Начало >> Статьи >> Архивы >> Авторадиография

Эффективность авторадиографии - Авторадиография

Оглавление
Авторадиография
Области применения авторадиографии
Радиоактивные изотопы
Авторадиография в сравнении с другими методами обнаружения ионизирующих излучений
Ядерные фотоэмульсии и фотографический процесс
Кристаллы бромистого серебра
Желатин
Скрытое изображение
Проявление скрытого изображения
Физическое проявление
Фиксирование эмульсии
Специальные методики
Цветные эмульсии
Воздействие ионизирующего излучения на ядерные эмульсии
Бета-частицы
Другие виды ионизирующего излучения
Разрешающая способность авторадиографии
Факторы, определяющие разрешающую способность зернистых авторадиограмм
Разрешение в электронномикроскопической авторадиографии
Разрешающая способность трековых авторадиограмм
Эффективность авторадиографии
Эффективность при электронномикроскопической авторадиографии
Эффективность трековой авторадиографии
Эффективность макроскопической авторадиографии
Соотношение между факторами, определяющими разрешение и эффективность
Фон авторадиограмм
Хемография
Облучение внешними источниками
Уничтожение фона
Измерение фона
Микроскопия и микрофотография авторадиограмм
Оптическая система для освещения в темном поле
Микрофотография зернистых авторадиограмм
Исследование в темном поле
Исследование и фотографирование трековых авторадиограмм
Относительные измерения радиоактивности
Перекрестные эффекты
Факторы связанные с эмульсией и влияющие на относительные измерения
Относительные измерения в трековой авторадиографии
Счет зерен и треков
Фотометрическая оценка плотности зерен
Выбор визуального или фотометрического метода счета зерен
Необходимость абсолютных измерений
Абсолютные измерения радиоактивности с помощью трековой авторадиографии
Планирование и осуществление авторадиографических исследований
Выбор эмульсии
Эксперименты с двумя изотопами
Освоение новой методики
Контрольные процедуры, необходимые для каждого эксперимента
Проектирование и оборудование темной комнаты
Гистологическая техника и авторадиография
Выбор способа гистологической фиксации
Методика приготовления гистологических срезов
Непроницаемые пленки
Приготовление авторадиограмм для микроскопии
Авторадиография растворимых радиоизотопов
Способы авторадиографии растворимого материала
Хемография и артефакты от давления
Количественные исследовани растворимых радиоактивных изотопов
Методика съемной эмульсии
Недостатки методики съемной эмульсии
Подробное описание методики  съемной эмульсии
Методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Факторы, влияющие на толщину эмульсионного слоя
Выбор подходящей толщины эмульсии
Оценка и описание методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Методика жидкой эмульсии для трековой авторадиографии
Авторадиография с электронной микроскопией
Ограничения современных методик
Детальное описание методик
Авторадиография макроскопических объектов
Авторадиография  в макроскопических образцах
Описание методик авторадиографии макроскопических объектов
Послесловие

ГЛАВА 5
ЭФФЕКТИВНОСТЬ АВТОРАДИОГРАФИИ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ

Авторадиографическая эффективность имеет несколько определений. Наиболее часто встречающееся из них связывает число зерен серебра в слое ядерной эмульсии с числом частиц, входящих в нее. Такая формулировка полностью подходит для экспериментального изучения эффективности. Относительно просто, используя соответствующий тип счетчиков ионизирующих излучений, измерить число частиц, вылетающих в единицу времени с единицы поверхности данного протяженного источника, содержащего равномерно распределенную радиоактивность. Экспонируя затем этот же источник в контакте с эмульсионным слоем и подсчитывая проявленные зерна, можно непосредственно определить эффективность.
Однако в большинстве радиоизотопных методик используется иное определение эффективности. Она выражается отношением числа зарегистрированных в эмульсии событий, как это имеет место с импульсами в счетчике Гейгера, к числу ядерных распадов, происшедших в источнике.
Это более сложное определение, так как оно включает множество параметров, относящихся к самому источнику. Если источник по отношению к пробегу излучаемых
δ-частиц является толстым, то многие из них совсем не достигнут регистрирующего прибора. Хотя эффективность, измеренная таким способом, более удобна для работы биологов, тем не менее это определение часто неприменимо к авторадиографии. Об этом приходится сожалеть, так как знание эффективности используемых систем, выраженной именно в этих понятиях, является основой количественной интерпретации авторадиограмм.
В настоящей работе эффективность определяется как число проявленных зерен в эмульсии на ядерный распад в источнике, и повсюду, где нет специальной оговорки, имеется в виду это определение. Необходимо подчеркнуть, что значение эффективности, при котором известно среднее число зерен серебра, приходящееся на образовавшуюся в источнике β-частицу, не дает возможности непосредственно перевести в величины радиоактивности результаты измерения количества зерен серебра, расположенных над клеткой в тканевом гистологическом срезе. Как отмечалось при обсуждении вопроса разрешающей способности, образующиеся в клетке β-частицы попадают в участки эмульсии, отстоящие от нее на различных расстояниях. Подобным образом, появление некоторых зерен серебра, сосчитанных над клеткой, связано с воздействием соседних участков среза. Измерение числа распадов в единицу времени, имевших место внутри источника, связано со многими трудностями, которые будут обсуждаться ниже (см. гл. 10, стр. 152). Несмотря на это, указанное определение эффективности применимо для сравнения различных авторадиографических систем и предварительной оценки их возможностей.
Необходимо иметь в виду также и другое определение эффективности, встречающееся в литературе, особенно по вопросам авторадиографии относительно больших объектов. Исследование эмульсии невооруженным глазом или при сравнительно небольшом увеличении не позволяет различать отдельные зерна серебра. Интенсивность потемнения снимка при этом становится параметром, связанным с числом β-частиц, вылетевших из источника за время экспонирования. Влияние этой замены на методику получения авторадиограмм макроскопических образцов будет обсуждаться ниже.
На трековых авторадиограммах объектом наблюдения и подсчета являются не отдельные зерна серебра, а их сочетания, формирующие трек. В этом случае эффективность выражается отношением числа треков, образовавшихся в эмульсии, к числу ядерных распадов, происшедших в источнике.

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ АВТОРАДИОГРАФИИ С ОЦЕНКОЙ ПЛОТНОСТИ ЗЕРЕН

Факторы, связанные с источником

Выбор изотопа. Влияние начальной энергии излучаемых β- частиц сказывается на эффективности авторадиографии в двух противоположных направлениях. С одной стороны, если, как это часто случается, источник имеет конечную толщину, то большая часть β-частиц, образующихся при распаде изотопа с низкой максимальной энергией излучения, поглощается внутри самого источника, не произведя действия в эмульсин. Этот фактор самопоглощения будет рассмотрен более подробно позже. С другой стороны, те β-частнцы, которые достигают тонкого слоя эмульсии, как было показано в гл. 3, теряют часть своей энергии, поэтому они имеют на оставшемся отрезке пути более высокую скорость ее потери, а следовательно, повышается и вероятность возникновения образования скрытого изображения в каждом кристалле бромистого серебра. В эмульсии Ilford G5 β-частицы с энергией от 20 до 75 кэв образуют в среднем одно проявленное зерно на микрон трека. В диапазоне энергий от 250 до 300 кэв эта величина [1] равна одному зерну на 2 мкм.  

Очевидно, при прохождении через тонкий слой эмульсии частицы с меньшей энергией будут регистрироваться с большей эффективностью. В качестве иллюстрации Герц [2] привел для нескольких изотопов средние числа зерен, образующихся в съемной эмульсии AR-10, в расчете на одну β-частицу. Эта величина изменяется от 2,0 зерен на частицу для углерода-14 (максимальная энергия 155 кэв) до 0,8 зерен на частицу для фосфора-32 (максимальная энергия 1,7 Мэв).

Расстояние между источником и эмульсией. Удаление источника от эмульсии понижает эффективность. Степень проявления этого эффекта во многом зависит от начальной энергии β-частиц. У трития, например, трек частицы настолько мал, что даже тончайший защитный слой поглощает значительную долю потока β-частнц. Перри и др. [3] показали, что пленка из форм вара толщиной 0,675 мкм уменьшает число зерен над меченной Н3 клеткой на 85%. С увеличением энергии частиц этот эффект ослабевает. Например, для Р32 изоляция источника материалом с плотностью 1,1 г/см3 и толщиной в несколько микронов не приводит к заметному уменьшению эффективности. Нет ощутимой разницы, например, между фотоотпечатком, экспонированным в прямом контакте с бумажной хроматограммой, содержащей Р32, и отпечатком, полученным при его изоляции от источника листом нетолстой бумаги.

Толщина источника. Если гладкий плоский источник толщиной в несколько ангстрем привести в контакт с ядерной эмульсией, то можно измерить число β-частиц, попадающих в эмульсию за 1 ч. Удвоение толщины источника при прочих идентичных условиях приведет к удвоению интенсивности поступления β-частиц в эмульсию. Но если продолжать этот процесс и сопоставлять толщину источника с интенсивностью поступления β-частиц в эмульсию (рис. 20), то кривая зависимости между этими величинами вскоре начнет отклоняться вниз от линии, соответствующей прямо пропорциональной зависимости. При дальнейшем добавлении слоя радиоактивного материала к обратной от эмульсии плоскости источника происходит меньшее увеличение скорости счета, чем ожидаемое, так как этот слой экранирован от эмульсии вышележащими слоями, поглощающими часть β-частиц. С источниками еще больших толщин отклонение от линейной зависимости становится все более заметным, пока, наконец, добавление радиоактивного материала вообще перестает влиять на скорость счета, и она остается постоянной.
Этот феномен известен как самопоглощение, и вид кривой, представленной на рис. 20, характерен для любого изотопа, излучающего β-частицы, хотя точные числовые значения в каждом случае зависят от энергетического спектра изотопа. В начальной части кривой, где возрастание скорости счета достаточно близко к линейному, источник считают бесконечно тонким. В области плато источник считается бесконечно толстым. При бесконечно малой толщине источника наблюдаемая скорость
счета пропорциональна количеству радиоактивности в нем, для бесконечно толстого источника скорость счета пропорциональная удельной концентрации его радиоактивности, но не зависит от ее абсолютного значения.
Очевидно, что толщина источника (исключая случаи бесконечно тонкого слоя) должна влиять на эффективность. Рассмотрим это на примере некоторых изотопов.

Рис. 20. Влияние увеличения толщины источника на наблюдаемую плотность потока β-частиц, покинувших поверхность источника. Вначале рост толщины источника обусловливает линейное возрастание плотности потока частиц: в этой части кривой до точки А источник "бесконечно тонкий". После А дальнейшее возрастание толщины источника нс обеспечивает соответствующего увеличения плотности частиц до тех пор, пока за точкой Б скорость счета на поверхности источника вообще перестает зависеть от дальнейшего прибавления радиоактивного материала к нижней поверхности источника. В этом случае об источнике говорят, что он «бесконечно толстый».

Срезы ткани толщиной 5 мкм с меткой Р32 можно считать бесконечно тонким источником. Простой и точный метод расчета самопоглощения излучения С14 был представлен Хендлер01м [4]. Используя полученные им результаты и предполагая плотность фиксированного биологического материала равной 123, можно обнаружить, что срез микронной толщины поглощает 5,5% образовавшихся β-частиц или, в более принятой терминологии, трансмиссия частиц, излученных в направлении эмульсии, составит в данном случае 94,5%. Для срезов толщиной 5 мкм трансмиссия равна 82,5%, а для 10 мкм—70,3%. Ясно, что в этом диапазоне энергии самопоглощение оказывает большое влияние, или, другими словами, эффективность существенно зависит от толщины источника.
Тритий — предельный случай изотопа, у которого самопоглощение является единственным особо важным фактором при рассмотрении авторадиографической эффективности.
Фалк и Кинг [5] для изучения самопоглощения использовали равномерно меченный Н3 метакрилат. Полученные ими данные представлены в табл. 3.

Таблица 3
Плотности зерен под срезами метилметакрилата, равномерно меченными Н3 и экспонированными с эмульсией Eastman Kodak NTB-2 в идентичных условиях


Толщина среза, мкм

Число зерен на 100 мкм2

Эффективность, %

Толщина среза, мкм

Число зерен на 100 мкм2

Эффективность, %

0,5

1,22+0,11

15,72

6,0

3,28+0,15

3,52

1,0

1,72+0,09

11,08

7,0

3,20 +0,18

2,94

2,0

2,18 + 0,10

7,04

8,0

3,25 ±0,12

2,62

3,0

2.61 ±0,10

5,62

9,0

3,26+0,14

2,34

4,0

2,99 + 0,15

4,82

10,0

3,16 + 0,12

2,03

5,0

3,25 +0,15

4,19

 

 

 

Примечание. Эффективность рассчитывали на основе известной удельной радио- активности метакрилата [5].
Здесь и вначале не наблюдается линейной зависимости между толщиной метакрилата и плотностью зерен, поскольку уже начальная толщина источника 0,5 мкм слишком велика, чтобы источник мог считаться бесконечно тонким. Для источников толщиной свыше 3 мкм наблюдается незначительный рост плотности зерен и равновесная толщина достигается при 5 мкм. Исследованные срезы должны, по-видимому, обладать плотностью, приблизительно совпадающей с таковой у фиксированного биологического материала. Таким образом, исключительно сильное влияние самопоглощения на эффективность тритиевых авторадиограмм отчетливо проявляется уже при толщине источника 0,5 мкм, когда эффективность равна 15%, а при толщине 10 мкм ее величина составляет только ~ 2 %.
Перри и др. [3] исследовали радиоактивность цитоплазмы, ядер и ядрышек в тканевой культуре 'клеток, меченной тритием. В уплощенных клетках ядро всегда отделено от эмульсии тонкой прослойкой цитоплазмы, находящейся между ними. Перри установил приемлемость приближенного выражения показателя пропускания β-частиц Н3 (в%) материалом, имеющим плотность 1,3, экспоненциальной функцией
e-1,5d, где d — толщина источника в микронах. Тщательное изучение геометрии исследуемою образца позволило ему рассчитать для каждого клеточного элемента соответствующий коэффициент. Уплощенные клетки имели оболочку из цитоплазмы средней толщиной в 0,2 мкм, которая отделяла ядра от вышележащей эмульсии. На авторадиограмме модели клеток, в которых ядрышки, ядра и цитоплазма содержат равные концентрации трития, плотности зерен над этими структурами относились бы как 0,43 : 0,61 : 1,0.
Приведенные цифры иллюстрируют два важных момента. Во-первых, эффективность регистрации трития настолько существенно зависит от толщины источника, что даже качественная интерпретация авторадиограммы среза ткани требует учета
фактора самопоглощения. Во-вторых, для количественного сравнения радиоактивности различных структур или клеточных элементов необходимо вводить поправки на самопоглощение, что требует проведения тонких и часто довольно затруднительных экспериментальных исследований. Этот вопрос будет более подробно обсуждаться в гл. 8 и 10.
Оценки точного значения эффективности авторадиографии трития в срезах ткани значительно расходятся. Авторы работы [6] считают, что для образования одного проявленного зерна серебра в срезе ткани толщиной 3 мкм должно произойти 100— 200 распадов. Такая величина эффективности ниже, чем следовало бы ожидать по данным работы [5]; нет хорошего соответствия между результатами подсчета зерен и данными, полученными в работе [6] с помощью счетчика импульсов. Вывод, однако, ясен. Самопоглощение действительно может уменьшить эффективность авторадиографии трития до очень низких значений.

Факторы, связанные с эмульсией

Толщина эмульсии. Если толщина эмульсии меньше, чем максимальная длина β-трека, то, очевидно, что с увеличением толщины эмульсии будет увеличиваться и общее число проявленных зерен серебра. Для высокоэнергетических излучений, как, например, у Р32 и эмульсионных слоев толщиной 1 — 20 мкм допустимо предположение о линейной зависимости между толщиной эмульсионного слоя и эффективностью авторадиографической системы. Для С14 уже на первых 2 мкм эмульсии число β-частиц, попадающих в следующий слой, заметно уменьшается, так что увеличение толщины эмульсии в этом случае не будет связано линейно с числом проявленных зерен.
Значимость этого фактора также зависит от максимальной энергии β-частиц исследуемого изотопа. Для трития, у которого максимальная длина трека β-частиц в ядерной эмульсии составляет около 3 мкм, толщина слоя эмульсии, если она не меньше этой величины, не влияет на эффективность. Однако с изотопами, характеризующимися более высокими энергиями частиц, при проведении количественного сравнения результатов подсчета числа зерен от двух источников контроль толщины эмульсионного слоя необходим.

Размер и концентрация кристаллов галоидного серебра.

Сравнение эмульсий, содержащих кристаллы диаметром 2 и 0,5 мкм, показывает, что при одинаковой в обоих случаях чувствительности большей эффективностью обладает эмульсия с меньшими кристаллами. Если в первом случае β-частица, попадая в эмульсионный слой толщиной, например, 4 мкм, под углом 90°, может произвести только 2 проявленных зерна, то во втором она пересечет около 8 кристаллов и может образовать 8 зерен серебра.

Слой эмульсии, состоящий из небольших плотно упакованных кристаллов, способен нести большую информацию на единицу длины трека каждой частицы, проходящей через него. Если эффективность характеризовать числом проявленных зерен серебра, то можно сказать, что такая эмульсия более эффективна, чем эмульсия с большими кристаллами.
Чувствительность эмульсии. В гл. 3 описывалась характеристика трека β-частицы, проходящей через ядерную эмульсию. Хотя любое столкновение β-частицы с кристаллом будет сопровождаться передачей ему некоторой энергии, не каждый кристалл вдоль траектории частицы получит энергию, достаточную для образования проявленного зерна. В высокочувствительной эмульсии для перевода активированного кристалла в проявленное зерно необходимы меньшие потери энергии. В такой эмульсии зерна серебра будут плотно расположены вдоль трека частицы. В эмульсиях с пониженной чувствительностью проявятся только зерна, в которых поглощено достаточно большое количество энергии.
Чувствительность эмульсии в конечном счете тесно связана с процессом проявления. При полном проявлении каждый кристалл со скрытым изображением будет превращен в проявленное зерно. Если же процесс проявления менее интенсивен, то проявляются только достаточно четко выраженные скрытые изображения, и, следовательно, таким же образом, как и при понижении чувствительности, эффективность авторадиографии падает.
Тритий и в этом отношении представляет особый случай. Энергия его частиц настолько низка, что вероятность их воздействия более чем на одно зерно невелика. Для столь низких энергий β-излучения скорость энергетических потерь очень высока, и относительно нечувствительные эмульсии зарегистрируют тритий почти с той же эффективностью, как и высокочувствительные, и к тому же часто с пониженным фоном. Поэтому для авторадиографии трития рациональнее использовать Ilford К2 вместо К5, или NTB-2 вместо NTB-3, что будет еще обсуждаться на стр. 183.
Продолжительность экспозиции. Уже упоминалось о том, что при длительных экспозициях из-за большой вероятности повторных попаданий β-частиц в один и тот же кристалл над источником наблюдается ухудшение разрешения. Ясно, что при этом эффективность регистрации также падает.
Регрессия скрытого изображения. Этот процесс обсуждается более подробно в других разделах (см. стр. 155 и стр. 93). Принципиально явление заключается в том, что при продолжительных экспозициях возможно восстановление зерен со скрытым изображением до бромистого серебра, особенно в присутствии окисляющих агентов или в условиях высокой влажности. К сожалению, как видно из данных на рис. 21, этот фактор, плохо контролируемый в авторадиографических экспериментах,
часто может вызвать почти полное исчезновение ожидаемого над источником следа. Требования, направленные на исключение возможности регрессии скрытого изображения, будут обсуждаться в гл. 11.

Рис. 21. Микрофотография среза скелетной мышцы, фиксированной в формалине перед заключением в парафин (Х27).
Срез покрывался эмульсией Ilford К2, которую засвечивали, и после этого препарат экспонировали в темноте в течение 1.8 дней. Проявляли обычным способом. Видно, что вокруг среза эмульсия потемнела, однако над самим срезом произошла сильная регрессия скрытого изображения, вызвавшая просветление. Данный пример иллюстрирует негативную хемографию
Если число зерен на авторадиограмме меньше ожидаемого, в первую очередь необходимо исследовать влияние этого фактора.
Любопытно, что регрессия скрытого изображения не влияет на разрешающую способность авторадиограммы, так как при этом просто уменьшается эффективная экспозиция, составляя только долю действительного времени экспонирования. Вот почему многие исследователи не обращают внимания на регрессию и не предпринимают никаких мер для ее контроля.
Регрессия скрытого изображения произвольно меняется от одной серии авторадиограмм к другой, и, возможно, именно это в наибольшей степени способствовало распространению мнения о том, что авторадиография пригодна только для изучения локализации источников и что достоверные количественные исследования вряд ли когда-либо станут возможными. Итак, если эффективность в серии авторадиограмм колеблется в необъяснимых пределах, то весьма вероятно, что это вызвано значительной регрессией скрытого изображения.
При обсуждении факторов, влияющих на разрешение зернистых авторадиограмм, представлялось возможным располагать их по степени значимости. Столь простая схема при рассмотрении эффективности нереальна из-за того, что многие из указанных выше факторов зависят от энергии β-частиц, излучаемых источником.
В случае относительно высоких энергий β-частиц, например Р32, большая эффективность регистрации обеспечивается толстым эмульсионным слоем, находящимся в прямом контакте с образцом. Влиянием толщины образца для обычно используемых гистологических препаратов можно пренебречь. Желательна максимальная чувствительность эмульсии, так как значительная часть спектра энергии этого изотопа выше 1 Мэв, т. е. относится к области, в которой скорость потери энергии β-частиц минимальна. Диаметр кристаллов в эмульсии должен быть небольшим, а их концентрация высокой. Проявление должно быть как можно более полным, чтобы использовать малейшую возможность доведения скрытого изображения до образования наблюдаемых структур. Выбор экспозиции должен обеспечить минимальную вероятность попадания двух и более частиц в один и тот же кристалл и предотвратить регрессию скрытого изображения. При этом от каждого распада, происшедшего в источнике, будет получено максимальное количество проявленных зерен.
Очевидно, что при этих условиях, требующихся для получения высокой эффективности, разрешение авторадиограммы будет очень плохим. Эксперименты, в которых разрешением можно полностью пренебречь в интересах эффективности, немногочисленны.
Для изотопов с низкой энергией излучения, например для трития, высокие показатели эффективности могут быть получены только с предельно тонкими образцами. Бесконечно тонким источником, с позиций самопоглощения, для этого изотопа является источник толщиной, не превышающей нескольких сотен ангстрем. Образец должен находиться в непосредственном контакте с эмульсионным слоем, причем нет необходимости увеличивать толщину последнего свыше 3 мкм, так как при большем удалении от источника зерна серебра все равно не будут образовываться. Необходимо, чтобы кристаллы в слое эмульсии имели небольшие размеры, а их концентрация должна быть высокой. Чувствительность кристаллов в этом случае не имеет большого значения, так как скорость потери энергии самых высокоэнергетических частиц трития во много раз больше, чем у Р32.
В литературе имеется ряд внушающих доверие оценок эффективности. Для расчетов приблизительной продолжительности экспозиции и минимального количества изотопа, необходимого для получения различимого следа, мы обычно предполагаем, что при толщине среза 5 мкм и слое ядерной эмульсии 2— 4 мкм эффективность характеризуется следующими показателями. Для Н3 100 распадов в срезе произведут приблизительно 2 зерна серебра, для С14 и S35 эта величина равна 30- 40 зернам; для Р32 она также составит около 30 зерен. Эти значения можно использовать в качестве основы для грубой оценки эффективности в различных экспериментальных ситуациях. Для препарата с изолированными, уплощенными клетками и эмульсионным слоем толщиной 1—2 мкм, по-видимому, можно ожидать выхода около 5 зерен серебра на 100 распадов для Н3, 40—45 для С14 и 20—25 зерен для Р32.



 
« Автоматизированный мониторинг больных сахарным диабетом детей и подростков   Актуальные проблемы низкорослости у детей »