Начало >> Статьи >> Архивы >> Авторадиография

Микроскопия и микрофотография авторадиограмм - Авторадиография

Оглавление
Авторадиография
Области применения авторадиографии
Радиоактивные изотопы
Авторадиография в сравнении с другими методами обнаружения ионизирующих излучений
Ядерные фотоэмульсии и фотографический процесс
Кристаллы бромистого серебра
Желатин
Скрытое изображение
Проявление скрытого изображения
Физическое проявление
Фиксирование эмульсии
Специальные методики
Цветные эмульсии
Воздействие ионизирующего излучения на ядерные эмульсии
Бета-частицы
Другие виды ионизирующего излучения
Разрешающая способность авторадиографии
Факторы, определяющие разрешающую способность зернистых авторадиограмм
Разрешение в электронномикроскопической авторадиографии
Разрешающая способность трековых авторадиограмм
Эффективность авторадиографии
Эффективность при электронномикроскопической авторадиографии
Эффективность трековой авторадиографии
Эффективность макроскопической авторадиографии
Соотношение между факторами, определяющими разрешение и эффективность
Фон авторадиограмм
Хемография
Облучение внешними источниками
Уничтожение фона
Измерение фона
Микроскопия и микрофотография авторадиограмм
Оптическая система для освещения в темном поле
Микрофотография зернистых авторадиограмм
Исследование в темном поле
Исследование и фотографирование трековых авторадиограмм
Относительные измерения радиоактивности
Перекрестные эффекты
Факторы связанные с эмульсией и влияющие на относительные измерения
Относительные измерения в трековой авторадиографии
Счет зерен и треков
Фотометрическая оценка плотности зерен
Выбор визуального или фотометрического метода счета зерен
Необходимость абсолютных измерений
Абсолютные измерения радиоактивности с помощью трековой авторадиографии
Планирование и осуществление авторадиографических исследований
Выбор эмульсии
Эксперименты с двумя изотопами
Освоение новой методики
Контрольные процедуры, необходимые для каждого эксперимента
Проектирование и оборудование темной комнаты
Гистологическая техника и авторадиография
Выбор способа гистологической фиксации
Методика приготовления гистологических срезов
Непроницаемые пленки
Приготовление авторадиограмм для микроскопии
Авторадиография растворимых радиоизотопов
Способы авторадиографии растворимого материала
Хемография и артефакты от давления
Количественные исследовани растворимых радиоактивных изотопов
Методика съемной эмульсии
Недостатки методики съемной эмульсии
Подробное описание методики  съемной эмульсии
Методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Факторы, влияющие на толщину эмульсионного слоя
Выбор подходящей толщины эмульсии
Оценка и описание методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Методика жидкой эмульсии для трековой авторадиографии
Авторадиография с электронной микроскопией
Ограничения современных методик
Детальное описание методик
Авторадиография макроскопических объектов
Авторадиография  в макроскопических образцах
Описание методик авторадиографии макроскопических объектов
Послесловие

ГЛАВА 7
МИКРОСКОПИЯ И МИКРОФОТОГРАФИЯ АВТОРАДИОГРАММ

ВЫБОР ОСВЕЩЕНИЯ

Практически при любой используемой в настоящее время технике авторадиографии эмульсия остается в контакте с биологическим образцом на протяжении всей обработки и последующего изучения. В большинстве случаев при исследовании авторадиограмм не возникает никаких особых трудностей. Срез можно окрасить до или после нанесения эмульсии, и для установления наличия зерен восстановленного серебра над окрашенным срезом пли пятном пригоден любой хороший микроскоп с обычной оптикой для проходящего света. Для окраски авторадиограмм можно использовать многие методики, этот вопрос более детально обсуждается в гл. 12. Некоторые авторы до сих пор предпочитают исследовать неокрашенный материал путем фазовоконтрастной микроскопии, но эта техника не имеет особых преимуществ. После гистологической и фотографической обработки контраст в тканях не очень выражен, а слой желатина поверх среза обусловливает еще большее снижение четкости изображения. Микрофотографии, сделанные методом фазового контраста, редко пригодны для публикации.
Но в некоторых случаях при исследовании окрашенных препаратов только в проходящем свете возникают затруднения в интерпретации авторадиограмм, особенно при просмотре их микрофотографий.
В принципе наличие эмульсионного слоя никоим образом не должно мешать микроскопированию среза и ограничивать выбор его окраски. Но зерна серебра не должны быть настолько велики или так плотно расположены, чтобы маскировать важные детали находящейся под эмульсией ткани. В то же время необходимо иметь возможность исследовать распределение зерен серебра при малом увеличении над большими участками гистоавторадиограммы, чтобы выявить общий характер локализации меченого соединения и отношение его к фону. Это не всегда удается осуществить при использовании только проходящего света. Если ткань обработана, например, гематоксилином, окрашивающим хроматин, ядрышки и цитоплазму некоторых клеток в темно-синий цвет, то при малом увеличении отличить зерна серебра от темных гранул в срезе весьма трудно.

На рис. 26 представлена авторадиограмма коры головного мозга плода крысы после введения Н3-тимидина, снятая при малом увеличении. Меченые клетки очень трудно выделить, особенно в участках среза с плотным расположением ядер. В результате относительно более четкого обнаружения зерен серебра в местах менее интенсивного окрашивания может создаться совершенно ошибочное представление о распределении их в срезе.

Рис. 26. Микрофотографии коры головного мозга плода крысы через 4 дня после введения тнмидина-Н3 на 16-й день беременности:
а — в проходящем свете зерна серебра хорошо видны в средней части поля, где плотность клеток небольшая; б— освещение в темном поле — количество зерен серебра в средних участках незначительное по сравнению с сильно меченными клетками поверхностных участков. Эмульсия Ilford G5 наложена поверх ПВХ-пленки. Окраска гематоксилином Гарриса до авторадиографии (X176).
Зерна серебра при малом увеличении можно легче обнаружить, если их сделать крупнее, используя эмульсии с большим диаметром кристаллов и метод перепроявления. Однако при микроскопии с масляной иммерсией зерна серебра будут выглядеть огромными и затемнять детали образца, уменьшая эффективность и разрешающую способность по сравнению с мелкозернистыми эмульсиями (см. гл. 4 и 5).
Возникающие затруднения могут быть весьма существенны, особенно в экспериментах, требующих большого навыка при детальном цитологическом изучении меченых клеток. Некоторые опытные специалисты не могут подсчитать процент митотических фигур, меченных тритием, из-за сходства глыбчатых хромосом в метафазе с зернами серебра, хотя такой подсчет часто делают в других лабораториях. Однако затруднения в интерпретации
наблюдающихся картин могут иметь и вполне объективные причины. Например, при изучении корреляции включения метки в зависимости от стадии митотического цикла в развивающемся яичнике требуется исследовать тонкую структуру хромосом, но последние имеют при окраске гематоксилином конденсированный, четкообразный вид с отдельными темными частицами, приблизительно равными по диаметру зернам серебра.
Если иногда трудно различить детали при микроскопическом исследовании гистоавторадиограммы, то очевидно, что еще большие сложности возникают при анализе микрофотографий. Большинство публикуемых фотографий черно-белые, и отличить на них окрашенные гранулы хроматина от зерен серебра при небольшом увеличении почти невозможно (см. рис. 26). При большом увеличении имеются другие трудности. Зерна серебра, естественно, располагаются в другой фокальной плоскости, чем срез, и в некоторых случаях совершенно невозможно получить резкое изображение обоих объектов на одной фотографии.
Если кто-либо сомневается в существовании таких проблем, пусть перелистает любой журнал по цитологии. Микрофотографии авторадиограмм трудно даже сравнивать по качеству с микрофотографиями гистологических препаратов. Во многих случаях зерна серебра точно сфокусированы, а срез представляет размазанный фон. Иногда сфотографирован срез, а зерна серебра отмечены от руки или даны две фотографии одного и того же участка с резким изображением среза на одной и зерен серебра на другой. Эти фотографии можно даже совместить, но трудоемкость монтажа удерживает многих исследователей.
Большинство из названных затруднений можно преодолеть, исследуя и фотографируя в темном поле или сочетая этот способ освещения с проходящим светом. Используемые принципы, выбор оборудования и техника микросъемки обсуждены в этой главе детально, так как выбор наиболее подходящей для данного эксперимента методики авторадиографии зависит от способа микроскопии, а в имеющейся литературе они описаны недостаточно [1].

ОСВЕЩЕНИЕ В ТЕМНОМ ПОЛЕ

Многих затруднений можно избежать, если используется какая-либо система, позволяющая с уверенностью отличить зерна серебра от окрашенных частиц среза. Восстановленные гранулы серебра представляют собой частички металла неправильной формы. Они не столько поглощают падающий на них свет, сколько отражают и рассеивают его. Поэтому они кажутся темными в проходящем свете, подобно окрашенным объектам, которые поглощают проходящий свет. Но при освещении пучком света, который не попадает в объектив, зерна серебра отклоняют свет от его первоначального пути в направлении оптической оси.



При освещении г. темном поле можно отличить от окрашенного фона даже очень мелкие зерна. Единственным ограничением, лимитирующим выбор окраски при этом способе исследования, является исключение методик, например, импрегнирования серебром, которые сопровождаются отложением металлов в срезе. Как видно из рис. 27, окрашенный материал может иметь в проходящем свете вид обычного гистологического препарата.



 
« Автоматизированный мониторинг больных сахарным диабетом детей и подростков   Актуальные проблемы низкорослости у детей »