Начало >> Статьи >> Архивы >> Авторадиография

Относительные измерения радиоактивности - Авторадиография

Оглавление
Авторадиография
Области применения авторадиографии
Радиоактивные изотопы
Авторадиография в сравнении с другими методами обнаружения ионизирующих излучений
Ядерные фотоэмульсии и фотографический процесс
Кристаллы бромистого серебра
Желатин
Скрытое изображение
Проявление скрытого изображения
Физическое проявление
Фиксирование эмульсии
Специальные методики
Цветные эмульсии
Воздействие ионизирующего излучения на ядерные эмульсии
Бета-частицы
Другие виды ионизирующего излучения
Разрешающая способность авторадиографии
Факторы, определяющие разрешающую способность зернистых авторадиограмм
Разрешение в электронномикроскопической авторадиографии
Разрешающая способность трековых авторадиограмм
Эффективность авторадиографии
Эффективность при электронномикроскопической авторадиографии
Эффективность трековой авторадиографии
Эффективность макроскопической авторадиографии
Соотношение между факторами, определяющими разрешение и эффективность
Фон авторадиограмм
Хемография
Облучение внешними источниками
Уничтожение фона
Измерение фона
Микроскопия и микрофотография авторадиограмм
Оптическая система для освещения в темном поле
Микрофотография зернистых авторадиограмм
Исследование в темном поле
Исследование и фотографирование трековых авторадиограмм
Относительные измерения радиоактивности
Перекрестные эффекты
Факторы связанные с эмульсией и влияющие на относительные измерения
Относительные измерения в трековой авторадиографии
Счет зерен и треков
Фотометрическая оценка плотности зерен
Выбор визуального или фотометрического метода счета зерен
Необходимость абсолютных измерений
Абсолютные измерения радиоактивности с помощью трековой авторадиографии
Планирование и осуществление авторадиографических исследований
Выбор эмульсии
Эксперименты с двумя изотопами
Освоение новой методики
Контрольные процедуры, необходимые для каждого эксперимента
Проектирование и оборудование темной комнаты
Гистологическая техника и авторадиография
Выбор способа гистологической фиксации
Методика приготовления гистологических срезов
Непроницаемые пленки
Приготовление авторадиограмм для микроскопии
Авторадиография растворимых радиоизотопов
Способы авторадиографии растворимого материала
Хемография и артефакты от давления
Количественные исследовани растворимых радиоактивных изотопов
Методика съемной эмульсии
Недостатки методики съемной эмульсии
Подробное описание методики  съемной эмульсии
Методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Факторы, влияющие на толщину эмульсионного слоя
Выбор подходящей толщины эмульсии
Оценка и описание методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Методика жидкой эмульсии для трековой авторадиографии
Авторадиография с электронной микроскопией
Ограничения современных методик
Детальное описание методик
Авторадиография макроскопических объектов
Авторадиография  в макроскопических образцах
Описание методик авторадиографии макроскопических объектов
Послесловие

ГЛАВА 8
ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ИЗМЕРЕНИЯ РАДИОАКТИВНОСТИ.
ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ
Обработка каждой авторадиограммы сводится фактически к относительному измерению радиоактивности. Даже в эксперименте, проводимом для того, чтобы показать, локализуется ли радиоактивный материал в данной структуре, необходимо плотность зерен или треков над предполагаемым источником сравнить с их плотностью над подобными немеченными источниками.
Точность относительных измерений сильно варьирует. При изучении концентрации иода в щитовидной железе обнаруживается такое громадное различие между содержанием метки в фолликулах щитовидной железы и, например, в скелетных мышцах, что самая глубокая методика оценки позволяет получить достаточно ясный ответ на вопрос, какая структура является наиболее сильно помеченной. Быстрая визуальная оценка степени почернения над источником и ее регистрация по шкале от + до ++++ есть измерение относительной радиоактивности, ясно, что методы более тщательного контроля позволяют установить менее существенные различия радиоактивности, и чувствительность измерения возрастает.
Лежащие в основе таких относительных измерений принципы имеют много общего со всеми методиками регистрации радиоактивности. Сравниваемые с помощью регистрирующего прибора образцы должны находиться в идентичных условиях; другими словами, эффективность регистрации активности изотопа должна быть одинаковой для всех образцов. В наблюдаемую скорость счета необходимо вносить поправку на фон, который определяется из измерения идентичного, но немеченного образца. Окончательная скорость счета от образцов пропорциональна их радиоактивности. При использовании гейгеровского или сцинтилляционного счетчика сравнительно просто обеспечить определенную эффективность для серий образцов и соответствующую величину фона. Каждый образец в этом случае обычно рассматривают как гомогенный источник, который никак иначе, чем через свою радиоактивность, не может повлиять на показания регистрирующего прибора, (за исключением эффекта гашения при жидкостно сциктилляционном счете). Необязательность гомогенности образца является одним из наиболее главных достоинств авторадиографических методик. Типичный биологический образец содержит источники, отличающиеся размером, формой и геометрическим расположением относительно эмульсии, так, что часто очень трудно, а иногда и невозможно зарегистрировать излучение различных источников с одинаковой эффективностью. На большие колебания эффективности при регистрации трития в цитоплазме, ядрах и ядрышках одной и той же клетки уже указывалось выше.
Часто необходимо сравнивать не только источники, отличающиеся по своему геометрическому расположению относительно эмульсин, и, следовательно, по эффективности регистрации их радиоактивности, но и источники, которые могут воздействовать на эмульсию иным, не связанным с действием ионизирующего излучения путем. Рис. 21 и 23 на примере позитивной и негативной хемографии иллюстрируют возникновение артефактных зерен серебра над источником и их непригодность для характеристики его радиоактивности.
На первый взгляд, подсчет зерен серебра над источником кажется нетрудным, по если наблюдаемая плотность зерен кроме радиоактивности может отражать и другие свойства образца, то для правильной интерпретации результатов необходимо проводить соответствующий контрольный эксперимент.
При использовании ядерпых эмульсий для сравнения уровней радиоактивности в объектах клеточных размеров могут иметь место многочисленные источники ошибок. Основные факторы, определяющие эффективность авторадиографических измерений, подробно освещены в гл. 5. В настоящей главе обсуждаются трудности, возникающие при проведении относительных измерений в экспериментальной практике, способы выявления возможных ошибок и пути предупреждения последних.

ЗАВИСИМОСТЬ ОТНОСИТЕЛЬНЫХ ИЗМЕРЕНИЙ ОТ ФАКТОРОВ, СВЯЗАННЫХ С ОБЪЕКТОМ ИССЛЕДОВАНИЯ

Потеря меченого материала при приготовлении источника

Влияние этого фактора в эксперименте особенно изменчиво. Если радиоактивная метка инкорпорируется в биологическом материале в макромолекулярной форме или в составе структуры белка, то обычная гистологическая фиксация, вероятно, приведет к осаждению метки in situ; очевидно, такое положение сохранится и на этапах заливки в парафин и нарезки препарата для получения авторадиограммы. Возможность потери метки при гистологической обработке возрастает по мере уменьшения размера молекул и увеличения их мобильности; для случая меченых ионов она становится вполне определенной. Заливке ткани в парафин для последующей нарезки предшествует проводка меченого материала через несколько растворителей, что создает условия для вымывания или перемещения радиоактивности в образце.

Таким образом, химическая природа меченого материала и методика его обработки могут оказать заметное влияние на потерн радиоактивности.
Иногда считают, что потеря радиоактивности в разных частях ткани происходит примерно одинаково. Однако даже если известно, что радиоактивность в образце присутствует в одной — единственной химической форме, то ее доступность для внешних растворителей может быть совершенно различна в зависимости от того, где она расположена — в ядре, в цитоплазме либо сорбирована интра- или экстрацеллюлярными структурами. Если радиоактивный изотоп представлен в образце несколькими соединениями, то различия в потерях на одном участке по сравнению с другим могут стать еще большими и привести к совершенно неверной трактовке результатов в случае, если измеренные количества зерен серебра выражаются в виде радиоактивности in vivo. Потеря радиоактивного материала образцом ткани, погруженным в раствор, очевидно, происходит более быстро в его поверхностных участках, а в центральной части будет наименьшей.
Методы, с помощью которых возможны изучение и контроль потерь или перемещений имеющейся в образце радиоактивной метки, обсуждаются в гл. 13. Описанная в этой главе методика авторадиографии растворимых радиоактивных материалов не только пригодна для некоторых довольно специальных экспериментов, но и является одним из основных контрольных мероприятий, которые требуются для проверки оправданности гистологических и авторадиографических процедур, используемых в большинстве исследований. Недостаточно залить радиоактивную ткань в парафин и показать, что радиоактивность все еще обнаруживается в авторадиограммах срезов, так как это вовсе не исключает возможности значительных потерь радиоактивности до авторадиографии.
Условия гистохимической и авторадиографической обработки можно считать приемлемыми для данного конкретного эксперимента только в том случае, когда у параллельных образцов ткани, один из которых заключается в парафин, а другой обработан по методике, применяющейся для растворимых радиоактивных материалов, распределение радиоактивности одинаково.

Необходимость сравнения толщины источников

Влияние толщины источника на эффективность регистрации обсуждалось в гл. 5. Если образец можно считать бесконечно тонким, то самопоглощением пренебрегают. В этом случае, независимо от толщины источников, при содержании в них одинакового количества радиоактивного материала образуется одинаковое количество проявленных зерен. Однако для источников, занимающих промежуточное положение между бесконечно тонкими и бесконечно толстыми, различия в толщине оказывают сильное влияние на эффективность, что необходимо учитывать при измерении общей или удельной активности источника.
Часто считают, что если при нарезке парафиновых срезов на микротоме установлена толщина 3 мкм, то все срезы будут одинаковой толщины — 3 мкм, это неверно. Так, если изготовить серию срезов с индикаторной толщиной, последовательно уменьшающейся от 10 к 1 мкм, то поверхность, занятая одним срезом, после влажной монтировки на подложке оказывается тем меньшей, чем тоньше срез. «Тончайшие» срезы сжимаются ножом, в результате чего окончательная толщина депарафинированной ткани может отличаться в 1,5 раза от нормальной толщины. Это сжатие неодинаково по всему срезу, что может усилить различие плотности зерен, если измерения не сопровождаются контролем толщины.
Измерить толщину источника нелегко. Для образцов толщиной более 20 мкм, вероятно, достаточно применение калибровочного устройства для тонкой фокусировки микроскопа, когда при максимальном увеличении последовательно наводят фокус на верхнюю и нижнюю поверхности среза. Однако для образцов толщиной менее 5 мкм эта методика недостаточно точна. Для очень тонких образцов применение интерференционного микроскопа дает очень точное измерение сухой массы, которая может быть переведена в относительные значения толщины образца. Но в диапазоне 1—5 мкм измерение толщины биологических образцов предельно затруднительно. Если знать толщину образца абсолютно необходимо, можно перемонтировать препарат и нарезать его под прямым углом к поверхности, приложенной к эмульсии. Это позволяет вместо измерения толщины образца в направлении оптической оси микроскопа измерять его длину в плоскости столика микроскопа, что проще и гораздо точнее.
Более высокое постоянство толщины образца можно получить, используя в качестве пропитывающих материалов полимеры, как в электронной микроскопии. При использований полимеров не требуется предварительно удалять их перед нанесением эмульсии, и можно получить наиболее точный профиль сечения и постоянную толщину среза по всей его поверхности.
Если по отношению к пробегу используемых частиц источник является бесконечно толстым, различия в его толщине менее существенны. При распределении такого источника по всей толщине среза наблюдаемые над ним количества зерен отражают концентрацию присутствующего радиоактивного вещества. Если же исследуемый источник не простирается по всей толщине среза, то серьезное значение приобретает глубина его залегания в срезе, как было показано в случае содержания меченых тритием соединений в ядрышке, ядре и цитоплазме клеток (см. стр. 70). Когда требуется сравнивать источники, расположенные на различных глубинах среза, необходимо определить их точное расстояние от эмульсии и ввести поправки на самопоглощение. Альтернативным способом измерения активности источников, встречающихся на различных глубинах в срезе, является подсчет зерен над случайной выборкой источников и сопоставление с помощью статистических методов. При этом необходимо учитывать ограничения и критически оценивать возможности авторадиографических методик. Никакой последующий статистический анализ результатов, как бы великолепно он ни был выполнен, не дает действительно ценной информации, если исходные положения ошибочны.

Необходимость сравнения размеров источников

При любом сравнении двух источников различного размера сразу возникает вопрос о выборе параметра, на основании которого будет проведено сравнение. Наиболее удобным параметром является обычно концентрация радиоактивного вещества, однако бывает, что необходимо сравнивать общее количество радиоактивного вещества в источниках. Примером этого является ситуация, когда один источник настолько мал, что может являться точечным. В таком случае точное измерение размера источника, а следовательно, и концентрации, затруднительно. Неприемлемость сравнения концентрации в одном месте с общим количеством радиоактивного вещества в другом очевидна.
Распределение зерен серебра в тонком эмульсионном слое над изолированным круглым источником небольшого по сравнению с пробегом изучаемых β-частиц диаметра будет соответствовать кривой, представленной на рис. 33. Число зерен серебра непосредственно над таким источником отражает его активность, которую непосредственно можно сравнивать с активностью других геометрически подобных источников; это сравнение позволяет определить отношение общих количеств радиоактивного вещества или его концентраций в исследуемых источниках. Подсчет числа зерен серебра в определенном объеме эмульсии выявляет зарегистрированные им β-частицы, испускаемые источником. Этот же объем эмульсии регистрирует β-частицы, возникающие вне источника, хотя и с меньшей эффективностью; и чем дальше от источника β-частицы появляются, тем меньше эффективность их регистрации рассматриваемым объемом эмульсии. Поэтому, если исследовать тот же объем эмульсии над центром круглого источника большего диаметра, но с равной концентрацией изотопа (см. рис. 33), то центральная часть этого источника диаметром d даст точно такое же число зерен серебра, что и первый источник, общин диаметр которого равен d. Но окружающие эту центральную область участки большего источника также будут вносить вклад в образование зерен серебра в исследуемом объеме эмульсии. Поэтому наблюдаемое число зерен будет выше над большим источником, даже если у них концентрация радиоактивного вещества одинакова. При дальнейшем увеличении диаметра источника частицы, вылетающие с его периферических участков, все хуже регистрируются объемом эмульсии над его центром, и на расстоянии, равном максимальному пробегу частиц, эффективность их регистрации становится равной нулю.

Рис. 33. Распределение плотности зерен серебра в эмульсии над различными источниками:
а — небольшой источник, дающий колоколообразное распределение плотности зерен с наибольшим значением над самим источником; б— протяженный источник, над которым возникает большая плотность зерен вследствие перекрестного эффекта от прилегающих участков самого источника.

Вот почему при превышении некоторого предельного диаметра количество зерен серебра в небольшом, расположенном над центром источника объеме эмульсии не зависит от размера источника и, следовательно, характеризует концентрацию содержащегося в нем радиоактивного вещества. Этот предельный диаметр источника обусловлен главным образом энергетическими характеристиками излучаемых β-частиц: с понижением их энергии уменьшается предел, выше которого различия в размере источника не влияют на число зерен в объеме эмульсии над его центральной частью.
Чтобы периферийные области плоского круглого источника совсем не оказывали влияния на эмульсию над его центром, диаметр источника должен в два раза превышать максимальную длину пробега испускаемых частиц. Этот вывод подтверждают некоторые другие факторы. Справедливость этого правила определяется действием ряда факторов. Для большинства радиоактивных изотопов доля β-частиц, испускаемых с энергией, близкой к максимальной, относительно невелика (см. рис. 7). Трековый радиус, или глубина проникновения β-частиц, всегда меньше их максимального пробега. Телесный угол, под которым с периферийных участков источника виден исследуемый объем эмульсии над его центром, относительно мал. Таким образом, хотя эффективность регистрации β-частиц, вылетающих из периферийных участков источника, не падает до нуля до тех пор, пока диаметр источника не превысит максимальный пробег β-частиц в два раза, тем не менее ее величина близка к нулю уже при существенно меньших размерах источника. В качестве грубого ориентира можно придерживаться правила, что если разрешение данной авторадиограммы (определенное как радиус участка эмульсии, в котором содержится половина зерен серебра, образовавшихся под действием излучения точечного радиоактивного источника) равно R мкм, то граница исследуемого участка эмульсин над центром источника должна быть удалена от края источника не менее чем на 2R мкм. При этом условии число зерен над источниками, даже если они различаются в размере, пропорционально концентрации радиоактивного вещества.
Рассмотрим теперь случай, когда у двух аналогичных круглых источников диаметром d и 2d общее количество радиоактивного вещества одинаково. Количества зерен, сосчитанных в небольших равных объемах эмульсии над центрами этих источников, не совпадают, так как в меньшем из них концентрация выше. Общее количество зерен серебра, образовавшихся над каждым из источников, также может оказаться различным.
Ранее было показано, что кривая распределения плотности зерен серебра, образующихся вокруг небольшого источника, имеет вид, представленный на рис. 16. Эффективность авторадиографии с оценкой плотности зерен определяли как отношение числа зерен серебра к числу происшедших ядерных распадов. Для двух круглых источников равной общей активности, но различного диаметра, эффективность остается той же самой, поэтому каждый из них вызовет образование в эмульсии одинакового числа проявленных зерен. Однако их распределение в пространстве будет, очевидно, сильно различаться. У меньшего источника большая часть зерен серебра расположится вне его границ. Задача состоит в определении объемов эмульсии, в которых заключается одинаковое количество зерен серебра (в %), образованных каждым из источников.
При сравнении концентрации или общего количества радиоактивного вещества в двух источниках различного размера возникают значительные затруднения. Строгая математическая обработка такого вида задач выходит за рамки этой книги. Некоторые очень уместные обсуждения вопроса можно при желании найти в материалах симпозиума по радиационной дозиметрии [1].

Блэкетт, Кембер, Ламертон [2] считают, что еще не существует удовлетворительных теоретических методов обработки, пригодных для дозиметрии малых источников β-излучения различного размера и формы. Одеблад разработал, возможно, наиболее перспективный подход; примененная им матричная теория для количественной оценки авторадиограмм будет обсуждена более подробно несколько позже.
Все эти причины создают затруднения для исследователя, желающего знать, является ли маленькая клетка столь же радиоактивной, как и большая. Однако существуют два случая, в которых такой вид сравнения можно сделать довольно просто.

  1. Размеры обоих источников более чем вдвое превышают величину разрешающей способности авторадиографической системы. В этом случае, как это было показано, результаты подсчета зерен в объемах эмульсии, расположенных над центром источников, отражают концентрации радиоактивного вещества 1. Если должны сравниваться общие количества радиоактивного вещества в источниках, то полученные значения концентрации можно умножить на соответствующие объемы источников.
  2. Размер обоих сравниваемых источников много меньше величины разрешения. В этом случае оправдано их рассмотрение в качестве точечных источников. Количество зерен, находящихся внутри участка эмульсии, ограниченного величиной разрешения каждого источника, при отсутствии влияния соседних источников должно быть пропорционально общему количеству радиоактивного вещества в исследуемом источнике.

Если размеры сравниваемых источников значительно различаются и при этом не выполняется ни одно из двух вышеупомянутых обстоятельств, то простого и прямого пути сопоставить их активности не существует. Однако необходимо отметить, что обе ситуации, позволяющие провести относительные измерения, определяются разрешающей способностью авторадиографической системы. Принимая это во внимание, при проектировании эксперимента необходимо по возможности так подбирать изотоп или методику, чтобы выполнялась та или иная совокупность критериев. Источник с изотопом С14, размеры которого слишком велики, чтобы считать его точечным, может перейти в эту категорию, если заменить метку на Р32. Альтернативно, используя электронномикроскопическую авторадиографию, можно уменьшить разрешение до такого уровня, когда размеры источника становятся относительно большими.
Если ни один из этих способов не подойдет, какой-либо другой методики для расчета эффективности регистрации двух источников пока не существует. Внесение соответствующих поправок в наблюдаемые значения количества зерен — задача быть может трудная, но важная.

Необходимость учета формы источников

Это утверждение вытекает непосредственно из положения, рассмотренного в предыдущем разделе. При сравнении источника дискообразной формы с протяженным линейным источником, если у них общее количество радиоактивного вещества и объем и концентрация изотопов одинаковы, бывает очень трудно выделить два равных объема эмульсии, содержащих одинаковое количество зерен. Плотность зерен в эмульсии непосредственно над линейным источником будет ниже, чем над диском.
Если размер источников велик в сравнении с величиной разрешения, то измерения в малом объеме, расположенном над центром источника, как можно далее от его границ, дадут значения концентрации радиоактивности. Если же размеры источников относительно невелики, то можно не принимать во внимание различия в форме и рассматривать каждый из них как точечный.
Имея дело с источниками неправильной формы, иногда можно выделить объемы эмульсии над каждым из них, которые геометрически достаточно подобны, чтобы считать примерно одинаково идентичными соответствующие эффективности регистрации излучения этих источников.



 
« Автоматизированный мониторинг больных сахарным диабетом детей и подростков   Актуальные проблемы низкорослости у детей »