Начало >> Статьи >> Архивы >> Авторадиография

Факторы связанные с эмульсией и влияющие на относительные измерения - Авторадиография

Оглавление
Авторадиография
Области применения авторадиографии
Радиоактивные изотопы
Авторадиография в сравнении с другими методами обнаружения ионизирующих излучений
Ядерные фотоэмульсии и фотографический процесс
Кристаллы бромистого серебра
Желатин
Скрытое изображение
Проявление скрытого изображения
Физическое проявление
Фиксирование эмульсии
Специальные методики
Цветные эмульсии
Воздействие ионизирующего излучения на ядерные эмульсии
Бета-частицы
Другие виды ионизирующего излучения
Разрешающая способность авторадиографии
Факторы, определяющие разрешающую способность зернистых авторадиограмм
Разрешение в электронномикроскопической авторадиографии
Разрешающая способность трековых авторадиограмм
Эффективность авторадиографии
Эффективность при электронномикроскопической авторадиографии
Эффективность трековой авторадиографии
Эффективность макроскопической авторадиографии
Соотношение между факторами, определяющими разрешение и эффективность
Фон авторадиограмм
Хемография
Облучение внешними источниками
Уничтожение фона
Измерение фона
Микроскопия и микрофотография авторадиограмм
Оптическая система для освещения в темном поле
Микрофотография зернистых авторадиограмм
Исследование в темном поле
Исследование и фотографирование трековых авторадиограмм
Относительные измерения радиоактивности
Перекрестные эффекты
Факторы связанные с эмульсией и влияющие на относительные измерения
Относительные измерения в трековой авторадиографии
Счет зерен и треков
Фотометрическая оценка плотности зерен
Выбор визуального или фотометрического метода счета зерен
Необходимость абсолютных измерений
Абсолютные измерения радиоактивности с помощью трековой авторадиографии
Планирование и осуществление авторадиографических исследований
Выбор эмульсии
Эксперименты с двумя изотопами
Освоение новой методики
Контрольные процедуры, необходимые для каждого эксперимента
Проектирование и оборудование темной комнаты
Гистологическая техника и авторадиография
Выбор способа гистологической фиксации
Методика приготовления гистологических срезов
Непроницаемые пленки
Приготовление авторадиограмм для микроскопии
Авторадиография растворимых радиоизотопов
Способы авторадиографии растворимого материала
Хемография и артефакты от давления
Количественные исследовани растворимых радиоактивных изотопов
Методика съемной эмульсии
Недостатки методики съемной эмульсии
Подробное описание методики  съемной эмульсии
Методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Факторы, влияющие на толщину эмульсионного слоя
Выбор подходящей толщины эмульсии
Оценка и описание методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Методика жидкой эмульсии для трековой авторадиографии
Авторадиография с электронной микроскопией
Ограничения современных методик
Детальное описание методик
Авторадиография макроскопических объектов
Авторадиография  в макроскопических образцах
Описание методик авторадиографии макроскопических объектов
Послесловие

Различия в толщине эмульсии

В зернистых авторадиограммах толщина эмульсии оказывает значительное влияние на эффективность регистрации. Это заставляет исследователя тщательно выбирать методику эксперимента, в котором требуется провести относительные измерения числа зерен серебра.
Очень трудно, используя жидкую эмульсию, получить слой постоянной толщины. Даже при выполнении рекомендаций Леблона и соавторов [61 разброс толщины эмульсии в лучшем случае составляет 1 —1,5 раза.
Чтобы убедиться в этом, надо взять несколько предметных стекол, покрытых жидкой эмульсией, и вынести их непроявленными на свет. Недостаточная равномерность толщины эмульсионных слоев сразу же бросится в глаза.
В противоположность жидким эмульсиям толщина съемных эмульсий несравненно более равномерна, и именно поэтому последние применяют чаще.
Существуют, однако, две ситуации, когда можно, используя многие преимущества методик с жидкими эмульсиями, пренебречь различиями в толщине эмульсии, обычно не допускающими интерпретацию результатов подсчета зерен. Первая — когда изотопом является тритий. В этом случае довольно просто поместить на образец толстый эмульсионный слой, чтобы поглотить все излученные β-частицы. Для этого достаточно обеспечить во время экспонирования толщину слоя эмульсии 3 мкм. При условии, что толщина эмульсионного слоя при всех комбинациях превышает указанную величину, эффективная толщина определяется максимальным пробегом β-частиц. Величина фона, однако, будет приблизительно пропорциональна толщине эмульсии. Чтобы этот источник ошибки не оказывал заметного влияния, величину фона необходимо поддерживать на низком уровне.
Второй случай, когда с позиций проведения относительных измерений допустимы колебания в толщине эмульсии, имеет место при сравнении малых объемов эмульсии, расположенных близко друг к другу. В тщательно приготовленных с помощью жидких эмульсий слоях изменения в толщине происходят постепенно, и, следовательно, их различие на двух участках, разделенных несколькими микронами, не должно быть большим.
Таблица 5
Сравнение подсчетов зерен и треков под лимфоцитами и прилежащими контрольными участками в эпителии двенадцатиперстной кишки мыши после инъекции сульфат-иона, меченного S35


Порядковый помер животного

Число зерен на 100 клеток

Число треков на 50 клеток

Лимфоциты

Контроль

Лимфоциты

Контроль

25

892

686(336)

28

21 (24)

26

1095

916 (336)

27

968

901(336)

29

19(24)

28

1594

1376(336)

29

18(24)

29

56

48 (48)

32

60

42 (48)

Достоверность различий

0,01 > Р >0,005

0,005 > Р >0,0005

Примечание. В круглых скобках показано время экспонирования в часах. Три момента в этих результатах представляют интерес. 1. Перекрестный эффект. Ткань, меченную слаборадиоактивным изотопом, исследовали в радиационном поле на расстоянии 15—20 мкм от интенсивно меченой эпителиальной поверхности. Параллельно проводили контрольный счет над прилегающими участками, расположенными на том же расстоянии от эпителиальной поверхности. 2. Плотность зерен. При подсчете использовали жидкоэмульсионную авторадиографическую методику, поэтому толщина эмульсии получалась неравномерной. Параллельные наблюдения над прилегающими экспериментальными и контрольными поверхностями позволили сравнить радиоактивность лимфоцитов и контрольных поверхностей для одного и того же животного. Сравнение значений, полученных для различных животных, не дает достоверных результатов вследствие возможных колебаний толщины эмульсионного слоя. 3. Счет треков. Количество треков не зависит от различной толщины эмульсии, поэтому результаты подсчетов для различных животных можно сравнивать. Большее значение отношения лимфоциты — контроль показывает, что в этом случае достигнуто лучшее разрешение исследуемых участков от высокоактивной эпителиальной поверхности, чем на зернистых авторадиограммах. Можно отметить также линейное увеличение количества треков со временем экспозиции и высокую точность результатов.

Дарлингтон и Роджерс [7] воспользовались этим обстоятельством в экспериментах, посвященных проверке способности лимфоцитов в эпителии тонкой кишки к инкорпорированию изотопа S35. Эти клетки лежат в относительно интенсивном радиационном поле цилиндрических эпителиальных клеток, покрытых на своей свободной поверхности слизью (ем. рис. 55). Для учета этого перекрестного эффекта подсчет зерен проводили в объемах эмульсии, расположенных непосредственно над лимфоцитами в эпителии и над смежными эпителиальными клетками. Таким образом, каждое значение скорости счета зерен от лимфоцита связывалось с контрольной величиной настолько близко от исследуемого участка, что различия в толщине эмульсии были, вероятно, незначительны. Данные табл. 5 иллюстрируют большие колебания в абсолютном количестве зерен, образовавшихся под действием излучения инкорпорированного изотопа S35, на 100 клеток для исследуемой группы животных: эти колебания определенно обусловлены различной толщиной эмульсии, так как при подсчете треков для всей группы животных получены близкие абсолютные величины. Однако отношение числа зерен над лимфоцитами к их числу над контрольными участками также находились в относительно узком диапазоне — от 1,1 до 1,3. Таким образом, несмотря на изменение толщины эмульсии, относительный подсчет зерен над этими парными участками продемонстрировал последовательный и важный пример подобных исследований, правильность проведения которого подтверждена трековой авторадиографией.

Различия в проявлении

На практике бывает очень трудно соблюсти одинаковые условия проявления нескольких серий авторадиограмм. На кинетику проявления могут повлиять многочисленные факторы: состав и температура проявителя, время проявления, интенсивность покачивания кюветы (см. гл. 2). Для создания таких условий проявления, при которых различия в перечисленных выше факторах будут небольшими и не вызовут значительных изменений в эффективности, лучше всего одновременно проявлять материалы, подлежащие сравнению.
В некоторых случаях это бывает невозможно. Сравнение числа подсчитанных зерен становится особенно затруднительным, если по плану эксперимента требуется подготовка материала в различные сроки. Очевидно, что и большие различия в содержании метки в сравниваемых источниках должны остаться легко наблюдаемыми.

Если требуется особая точность измерения, необходимо приготовить стандартные источники, такие, как асцитные клетки, предложенные авторами работы [8], и экспонировать их с каждой серией авторадиограмм в качестве эталона для сравнения. Помимо прочего, можно отметить, что методику стандартных эталонных источников обычно используют при измерениях гейгеровским или сцинтилляционным счетчиком.

Регрессия скрытого изображения

Условия экспонирования могут обусловить значительные отклонения в получаемых значениях эффективности для авторадиограмм различных серий и даже, хотя это менее вероятно, для отдельных препаратов одной серии. Присутствие атмосферного кислорода и недостаточная просушка эмульсии — два наиболее важных фактора, способствующие регрессии скрытого изображения.
Иногда эти факторы вносят ощутимые ошибки в авторадиограммы одной и той же партии, например, если хотя бы один препарат менее тщательно высушен перед экспонированием, чем другие. Поэтому необходимо постоянно обращать внимание на такие моменты, как различия в положении препаратов на сушильной раме и т. п. Этот источник ошибок можно нивелировать, если вместо многочисленных измерений на одном и том же препарате проводить подсчет зерен на различных авторадиограммах.
Весьма вероятно, что большинство ошибок при определении эффективности вызывается незначительными изменениями в условиях сушки и экспонирования авторадиограмм. Если необходимо сравнивать между собой серии авторадиограмм, то применение эталонных источников позволяет контролировать эту причину нестабильности.

Хемография

Хемография может вызывать образование проявленных зерен в отсутствие радиации или устранять скрытое изображение, вызванное действуем последней. Артефакты, вызванные действием хемографии, часто варьируют от одного участка образца к другому, и эти изменения, иногда отражающие анатомическое строение, могут оказывать влияние на эмульсию, повторяя структуры исследуемой ткани. Очевидно, что пока не исключена возможность хемографии, нельзя расценивать результаты подсчета зерен над двумя сериями объектов как характеристику относительной радиоактивности последних.
Необходимые для этого контрольные измерения детально разобраны в следующих главах. Наиболее простая методика контроля заключается в авторадиографии двух срезов, которые не содержат радиоактивного вещества, но полностью идентичны экспериментальным срезам в исследуемой партии. Один из двух препаратов с такими срезами необходимо засветить, а затем экспонировать совместно с другими препаратами. Если эффект
хемографин отсутствует, то после проявления препарата будет наблюдаться равномерное распределение фона по всей эмульсии. Наличие участков с пониженной плотностью зерен указывает на негативную хемографию (см. рис. 21). Другой нерадиоактивный препарат экспонируют и проявляют обычным путем, не подвергая предварительному световому воздействию. Позитивная хемография проявляется при этом в повышении плотности зерен на отдельных участках по сравнению с любым встречающимся на этой авторадиограмме фоном.

Выбор времени экспонирования

Если эмульсионный слой покрывает два источника, значительно различающиеся активностью, то отношение количества зерен над этими источниками будет точно отражать различие их активности только при относительно небольшой экспозиции. В противном случае вероятность многократного попадания частиц в одни и те же кристаллы галоидного серебра над более активным источником начинает возрастать, а эффективность регистрации соответственно уменьшается. Часто возникает желание увеличить экспозицию, чтобы получить большее число зерен серебра над малоактивным источником. Однако, учитывая вероятность множественных попаданий над более радиоактивным источником, следует ограничивать продолжительность экспозиции, даже если это потребует исследования гораздо большего числа слабомеченных источников.
Подводя итог возможностям зернистых авторадиограмм, следует подчеркнуть, что необходимо на должном техническом уровне обеспечить соблюдение ряда условий, прежде чем увериться в том, что подсчет зерен над мечеными источниками отражает относительное содержание в них радиоактивного изотопа. При сравнении подобных по форме и размеру источников соблюдение этих условий, как правило, не вызывает особых затруднений. Однако при сравнении различающихся источников контролируемые объемы эмульсии необходимо выбирать с большей тщательностью для гарантии того, что плотности зерен в них точно отражают величины относительной радиоактивности. Если какие-либо из исследуемых источников лежат в радиоактивном поле другого источника, то необходимо также оценивать и учитывать влияние перекрестного эффекта.
При электронномикроскопической авторадиографии относительные измерения радиоактивности вполне реальны, если соблюдены перечисленные выше требования к проведению таких измерений при световой микроскопии зернистых авторадиограмм. При этом почти всегда необходимо проводить статистический анализ результатов подсчета зерен над субклеточными структурами, особенно учитывая возможность перекрестных эффектов, так как многие органеллы клеток значительно меньше достигаемой разрешающей способности авторадиографии.



 
« Автоматизированный мониторинг больных сахарным диабетом детей и подростков   Актуальные проблемы низкорослости у детей »