Начало >> Статьи >> Архивы >> Авторадиография

Счет зерен и треков - Авторадиография

Оглавление
Авторадиография
Области применения авторадиографии
Радиоактивные изотопы
Авторадиография в сравнении с другими методами обнаружения ионизирующих излучений
Ядерные фотоэмульсии и фотографический процесс
Кристаллы бромистого серебра
Желатин
Скрытое изображение
Проявление скрытого изображения
Физическое проявление
Фиксирование эмульсии
Специальные методики
Цветные эмульсии
Воздействие ионизирующего излучения на ядерные эмульсии
Бета-частицы
Другие виды ионизирующего излучения
Разрешающая способность авторадиографии
Факторы, определяющие разрешающую способность зернистых авторадиограмм
Разрешение в электронномикроскопической авторадиографии
Разрешающая способность трековых авторадиограмм
Эффективность авторадиографии
Эффективность при электронномикроскопической авторадиографии
Эффективность трековой авторадиографии
Эффективность макроскопической авторадиографии
Соотношение между факторами, определяющими разрешение и эффективность
Фон авторадиограмм
Хемография
Облучение внешними источниками
Уничтожение фона
Измерение фона
Микроскопия и микрофотография авторадиограмм
Оптическая система для освещения в темном поле
Микрофотография зернистых авторадиограмм
Исследование в темном поле
Исследование и фотографирование трековых авторадиограмм
Относительные измерения радиоактивности
Перекрестные эффекты
Факторы связанные с эмульсией и влияющие на относительные измерения
Относительные измерения в трековой авторадиографии
Счет зерен и треков
Фотометрическая оценка плотности зерен
Выбор визуального или фотометрического метода счета зерен
Необходимость абсолютных измерений
Абсолютные измерения радиоактивности с помощью трековой авторадиографии
Планирование и осуществление авторадиографических исследований
Выбор эмульсии
Эксперименты с двумя изотопами
Освоение новой методики
Контрольные процедуры, необходимые для каждого эксперимента
Проектирование и оборудование темной комнаты
Гистологическая техника и авторадиография
Выбор способа гистологической фиксации
Методика приготовления гистологических срезов
Непроницаемые пленки
Приготовление авторадиограмм для микроскопии
Авторадиография растворимых радиоизотопов
Способы авторадиографии растворимого материала
Хемография и артефакты от давления
Количественные исследовани растворимых радиоактивных изотопов
Методика съемной эмульсии
Недостатки методики съемной эмульсии
Подробное описание методики  съемной эмульсии
Методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Факторы, влияющие на толщину эмульсионного слоя
Выбор подходящей толщины эмульсии
Оценка и описание методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Методика жидкой эмульсии для трековой авторадиографии
Авторадиография с электронной микроскопией
Ограничения современных методик
Детальное описание методик
Авторадиография макроскопических объектов
Авторадиография  в макроскопических образцах
Описание методик авторадиографии макроскопических объектов
Послесловие

ГЛАВА 9
ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ИЗМЕРЕНИЯ РАДИОАКТИВНОСТИ.
СЧЕТ ЗЕРЕН И ТРЕКОВ
Наиболее употребительным методом измерения реакции эмульсии является визуальный подсчет зерен. Отдельные зерна серебра подсчитывают непосредственно под сильно увеличивающим объективом микроскопа. Каждый, у кого есть большой опыт в подсчитывании зерен, согласится, что этот утомительный способ занимает много времени. Подобно всякой другой человеческой деятельности, он содержит значительный элемент субъективизма, и поэтому не может дать полного совпадения результатов при воспроизведении подсчета различными наблюдателями или же одним и тем же исследователем, но в разное время.
Делались попытки автоматизации процесса подсчета зерен. Хотя несколько приборов подобного рода описано в литературе, до сих пор почти все проводимые измерения авторадиограмм практически основываются на визуальном подсчете. В этой главе рассматриваются возможности применения фотометрического метода, необходимое для этого оборудование и, принцип его работы, обсуждаются также преимущества и ограничения этого метода.
На настоящей стадии развития авторадиографии фотометрический метод пока еще не может полностью заменить визуальный подсчет зерен, а только дополняет его.
В лабораториях, где приготовление авторадиограмм эпизодично, дороговизна и хлопоты, связанные с установкой такого фотометрического прибора, не оправданы. Однако для лабораторий, исследующих значительное количество зернистых авторадиограмм, применение фотометрии, безусловно, целесообразно, ибо здесь подсчет зерен — фактор, ограничивающий производительность работы.

ВИЗУАЛЬНЫЙ СЧЕТ ЗЕРЕН

В сущности, это очень простой процесс. Исследователь должен определить число проявленных зерен серебра, наблюдаемых в объеме эмульсии, который выбран для изучения. При этом следует рассмотреть два вопроса. Первый из них связан с определением, что принимать за зерно серебра, второй касается практического проведения исследований с условием создания наилучших условий для наблюдателя.

Распознавание зерен серебра

Такая постановка вопроса, вероятно, кажется чрезмерно академичной. Обычно пылинки или зернистый осадок легко отличаются от гистологических красок по их виду. Тем не менее точное распознавание зерен серебра становится необходимым в двух случаях.

Рис. 36. Трек β-частицы, зарегистрированный в эмульсии Ilford G5 (Х700).
Средний диаметр проявленных зерен и плотность их расположения в конце трека (справа) больше, чем в его начале (слева).
В конце своего пробега β-частица теряет энергию сравнительно быстрее, а производимые в эмульсии зерна серебра располагаются более плотно друг к другу и проявляют тенденцию к увеличению своих размеров. Эти зерна после проявления могут даже сливаться друг с другом (рис. 36), что затрудняет выяснение того, представляет ли данное образование одно большое зерно или несколько меньших, слившихся вместе. Вследствие этого физики при некоторых анализах треков частиц подсчет зерен заменили подсчетом микрообразований серебра. β-Частнцы трития — пример частиц с небольшой максимальной энергией, но с высокой скоростью потерн энергии, и обычно образуемые ими зерна серебра крупнее, чем зерна фона на той же авторадиограмме. Одному наблюдателю может показаться, что каждому микрообразованию соответствует одно зерно; оценив, что крупные микрообразования серебра приблизительно вдвое больше среднего зерна фона, он считает их за два зерна, слившихся при проявлении.  Не существует простого способа определения правильности того или иного способа оценки интенсивности. Если должны сравниваться результаты подсчета различных наблюдателен, то лучше всего перед началом счета остановиться на определенном способе распознавания.
Точное распознавание зерен серебра при использовании методики освещения в темном поле уже рассматривалось в гл. 7. Вкратце можно сказать, что существует критический размер, ниже которого зерна серебра не будут различаться при исследовании в проходящем свете по методу светлого поля. При использовании микроскопии в темном поле этот пороговый размер значительно меньше. С помощью первоклассной оптики и при полной адаптации наблюдателя к темноте в тех участках, где в проходящем свете не обнаруживаются зерна серебра, становятся видимыми многочисленные мелкие зерна. Должны ли они считаться зернами серебра, или же как некоторая форма артефакта не приниматься во внимание?
Уже указывалось на то, что неправильно рассматривать скрытое изображение как что-либо отсутствующее либо присутствующее в кристалле галоидного серебра. Один кристалл может содержать сотни атомов металлического серебра, готовых катализировать превращение кристалла в полностью проявленное зерно, другой, например, всего около 100. При достаточно сильном проявлении оба могут дать зерна, достаточно большие для их распознавания. Но при более мягких условиях проявления первый из кристаллов еще может проявиться до порога видимости, в то время как скрытое изображение в последнем является или слишком маленьким, или недостаточно сцентрированным, чтобы катализировать осаждение количества серебра, достаточного для получения видимого зерна.
Проявление фактически есть способ усиления эффекта. Оно не может рассматриваться отдельно от порога видимости проявленных зерен. В любой эмульсии множество кристаллов содержит очень маленькие скрытые изображения и в отсутствие радиации, и это важно для выбора режима проявления, который, делая возможно меньшее число таких зерен фона видимыми, в то же время проявляет кристаллы с большими скрытыми изображениями, вызванными воздействием излучения. Отработать методику проявления так, чтобы поставить зерна фона в худшие условия, столь же благоразумно, как и отрегулировать режимы усилителя и дискриминатора импульсов от сцинтилляционного счетчика для получения наилучшего возможного соотношения между сигналом и шумом.
Очевидно, изменение порога распознавания зерен при помощи перемены условий освещения будет влиять на отношение сигнал — шум в эмульсии при неизменных условиях проявления. Тот же самый результат подсчета зерен получается на авторадиограмме при энергичном проявлении и наблюдении (в проходящем свете по методу светлого поля) или при мягком проявлении и исследовании с освещением в темном поле.
Невозможно обеспечить успешный подсчет только крупных зерен и не учитывать мелкие, поскольку распределение их размеров имеет непрерывный характер, и поэтому любая попытка ограничить размеры подлежащих подсчету зерен вносит неприемлемо высокий элемент субъективности.
Отдавая предпочтение при планировании эксперимента наблюдению в темном или светлом поле, необходимо помнить, что в первом случае интенсивность освещения изучаемых объектов значительно меньше той, которая обычно используется в хорошо освещенной лаборатории. В период адаптации к темноте порог регистрации зерен серебра невооруженным глазом изменяется, и, следовательно, если освещение комнаты очень яркое, любой перерыв в счет потребует нового периода адаптации. Если невозможно обеспечить постоянно сниженную интенсивность окружающего освещения, то, пожалуй, лучше считать зерна в светлом поле.

Условия для визуального подсчета зерен

Для большинства наблюдателей воспроизводимость подсчета зерен начинает падать после первого часа работы, хотя точные временные характеристики этого эффекта зависят от опыта наблюдателя. Новички могут чувствовать тошноту, особенно, если работа связана с тщательным рассматриванием препаратов, с частыми перемещениями предметного столика микроскопа. Даже у очень опытных исследователей точность подсчета ухудшается, если они занимаются этим по нескольку часов ежедневно.
Возможно, самая утомительная сторона подсчета в том, что при этом необходимо держать голову в определенном положении по отношению к микроскопу. Удобное расслабленное положение при подсчете очень существенно. Предлагались многочисленные системы для освобождения наблюдателя от этой скованности при подсчете. Авторы работы [1] считают перспективным использование проекционных систем, позволяющих перенести поле зрения на экран. Для той же цели использовали телевидение. Иногда каждое поле авторадиограммы микрофотографируется, и зерна считают на проявленных фотоотпечатках [2]. Все эти методики увеличивают рабочий период, при котором усталость еще не начинает влиять на результаты, и облегчают привлечение нетренированного или не имеющего опыта микроскопических наблюдений персонала.
При использовании любой системы необходимо какое-то время, чтобы привыкнуть к условиям работы. Непрерывное наблюдение дает более воспроизводимые результаты. Тихую комнату с приглушенным освещением следует предпочесть шумной и хорошо освещенной лаборатории. Развивая этот принцип далее, можно отметить, что два человека обычно работают быстрее и с большей точностью, чем один. Наблюдатель концентрирует внимание на образце, а ассистент регистрирует счет. Необходимость записывать каждый результат, прежде чем перейти к следующему полю наблюдения, значительно искажает ритм работы. В одной из лабораторий, в которой физики проводят анализ треков частиц, каждый микроскоп имеет сбоку регистрирующую ленту, так что все измерения и комментарии наблюдатель может записывать, не отрывая глаз от микроскопа.
Необходимость принятия решений в процессе подсчета должна быть сведена к минимуму. Необходимый для сканирования объем эмульсии следует определить заранее, а также поставить перед собой конкретную задачу, например, «сосчитать все клетки типа А на линии от X до У» или «сосчитать все клетки в поле зрения при таком-то положении предметного столика микроскопа». Если задача не уточнена и ведется счет различных клеток, субъективный элемент делает результаты подсчета полностью неубедительными.
Подобным образом должны предопределяться форма и размер объема эмульсии, подвергающегося просмотру вокруг каждой клетки. Если этот участок большой или содержит много зерен серебра, то его следует подразделить с помощью окулярной сетки на меньшие квадраты и считать зерна в них по очереди, как клетки крови в гемоцитометре. Деление поля на небольшие участки для счета особенно целесообразно, если число зерен, которые необходимо подсчитывать, превышает 20.
Оценив однажды влияние внешних условий на точность и воспроизводимость визуального подсчета, можно планировать работу таким образом, чтобы надежные результаты получались довольно быстро. Вероятно, самым важным первым шагом к достижению этой цели является такая организация труда, при которой подсчет зерен проводится в сравнительно короткие промежутки времени с перерывами для другой работы. В дальнейшем продолжительность подсчета не должна превышать 1—2 ч, пока наблюдатель еще не устал.

Подсчет треков

Эта процедура неизбежно более медленная и трудная, чем подсчет зерен. Треки имеют три измерения, и каждое поле, выбранное для исследования, необходимо тщательно исследовать на многих фокальных уровнях. Чтобы определить направления полета β-частиц и зарегистрировать как можно точнее точку их входа в эмульсию, сами треки должны прослеживаться на некотором расстоянии.

Подсчет треков требует определенного опыта и некоторого понимания поведения β-частиц при их пролете через ядерную эмульсию, тогда как подсчет зерен после кратких пояснений можно доверить любому сотруднику, умеющему работать с микроскопом. Вместе с тем многие исследователи излишне боятся трудностей, связанных с распознаванием треков. В нескольких случаях я просил студентов подсчитать треки на материале, приготовленном с изотопами С14, S35 и Р32; после получасового объяснения они могли приступать к работе, и полученные ими данные были достаточно точными и воспроизводимыми.
Характеристики треков β-частиц детально описаны в гл. 3. Их основное свойство — отсутствие регулярности. Расстояния между инициируемыми зернами, изменения в направлении и размер зерен варьируют сложнейшим образом, отражая статистическую вероятность поведения частиц. β-Частицы с энергией от 400 кэв и выше распространяются по прямой или мягко изогнутой кривой на значительные расстояния. В эмульсии IlfordG5 зерна лежат в среднем на расстоянии 2 мкм друг от друга [3], хотя наблюдаются промежутки в 4—5 мкм и, наоборот, участки, в которых несколько зерен находятся более близко друг к другу. Большинство зерен при нормальных условиях проявления будут достаточно маленькими. Ниже 75 кэв—в конечной части трека высокоэнергетической частицы либо в случае частицы с низкой начальной энергией — зерна лежат в среднем на расстоянии 1 мкм. Вероятность разрывов трека более чем на 3 мкм очень мала, и зерна в конечных нескольких микронах могут даже сливаться. β-Частица обычно многократно меняет направление на протяжении последних 25 мкм, тогда как значительные внезапные изменения направления полета β-частицы из-за притяжения ее атомными ядрами происходят обычно на участках с более высокими энергиями (см. рис. 8).
Как правило, трек β-частицы определяется как четыре или большее количество зерен серебра, расположенных в ряд. Очевидно, четыре зерна фона также могут образовать структуру, напоминающую линейную. Однако трек всего из четырех зерен представляет конечный участок движения β-частицы, соответствующий энергии 10—20 кэв, и надо полагать, что эти зерна будут крупнее и расположены очень плотно. Если в качестве основы для сравнения использовать легко распознаваемые окончания треков β-частиц, то для любого нормально приготовленного материала окажется, что вероятность наблюдения четырех зерен фона сравнимого размера и подобного расположения, безусловно, невелика.
δ-Треки часто вызывают путаницу. Это треки, оставляемые электронами, покинувшими свои орбиты при прохождении частицы через атом. На рис. 14 продемонстрирован такой трек, берущий начало из длинного прямого трека частицы высокоэнергетического космического излучения.
Единственное различие между δ-треком и β-частицей — механизм образовании самой частицы. Если трек, подобный образуемому типичной β-частицей, начинается из другого трека, его следует рассматривать как обусловленный δ-электроном, а не β-частицей. В этом случае начальный трек разделяется приблизительно под углом 90° на два разветвления, каждое из которых имеет характерный заключительный участок с более тесно расположенными зернами (см. рис. 9).
Возможны, кроме того, определение и учет треков фона, обусловленных β-частицами, не являющимися излучением исследуемого источника. Если образец смонтирован на стеклянной подложке, с толстым слоем эмульсии над ним, то, очевидно, что треки, начинающиеся сверху в эмульсии, должны рассматриваться как вызванные частицами фона. Треки можно также считать фоновыми, если их длина или число зерен больше, чем это ожидалось, исходя из известных характеристик используемого изотопа. Поскольку эмульсионный слой после его обработки не восстанавливается до своей исходной толщины (в период экспонирования), длина трека не является таким надежным указателем начальной энергии частицы, как число зерен в нем. Уравнение, связывающее начальную энергию с длиной трека и числом зерен, приведено на стр. 43 и иллюстрируется рис. 10—12. Например, среднее число зерен, образуемых β-частицами с начальной энергией 155 кэв в эмульсии IlfordG5, равно 74. Разумеется, вокруг этого среднего значения числа зерен в каждом треке имеет место статистический разброс, и поэтому можно обнаружить трек β-частицы С14(Емакс= 155 кэв) более чем в 90 зерен, но вероятность его возникновения чрезвычайно низка. Поэтому, если в авторадиограмме С14 обнаружен трек в 105 зерен, разумно отнести его к фоновым.
До сих пор вследствие широкой вариабельности исследуемых образцов и длин треков, образованных излучением одного изотопа, невозможна автоматизация процесса подсчета β-треков. Он более трудоемок и требует большего терпения и опыта, чем визуальный подсчет зерен. Однако возникающие трудности не чрезмерны, а использование этой методики позволяет получать наиболее точные и воспроизводимые результаты.
Наиболее важным этапом при подготовке трековых авторадиограмм для наблюдения в микроскопе, вероятно, является восстановление толщины эмульсионного слоя перед монтировкой препарата под покровное стекло. Нередко в верхней части эмульсионного слоя рассеяны многочисленные зерна фона, которые с помощью процесса восстановления толщины эмульсионного слоя четко отделяются от образца, прилежащего к нижней поверхности эмульсии. Кроме того, при восстановлении толщины слоя могут быть разделены некоторые очень запутанные треки. Таким образом, задача идентификации и регистрации треков β-частиц значительно облегчается при проведении этой простой процедуры.



 
« Автоматизированный мониторинг больных сахарным диабетом детей и подростков   Актуальные проблемы низкорослости у детей »