Начало >> Статьи >> Архивы >> Авторадиография

Фотометрическая оценка плотности зерен - Авторадиография

Оглавление
Авторадиография
Области применения авторадиографии
Радиоактивные изотопы
Авторадиография в сравнении с другими методами обнаружения ионизирующих излучений
Ядерные фотоэмульсии и фотографический процесс
Кристаллы бромистого серебра
Желатин
Скрытое изображение
Проявление скрытого изображения
Физическое проявление
Фиксирование эмульсии
Специальные методики
Цветные эмульсии
Воздействие ионизирующего излучения на ядерные эмульсии
Бета-частицы
Другие виды ионизирующего излучения
Разрешающая способность авторадиографии
Факторы, определяющие разрешающую способность зернистых авторадиограмм
Разрешение в электронномикроскопической авторадиографии
Разрешающая способность трековых авторадиограмм
Эффективность авторадиографии
Эффективность при электронномикроскопической авторадиографии
Эффективность трековой авторадиографии
Эффективность макроскопической авторадиографии
Соотношение между факторами, определяющими разрешение и эффективность
Фон авторадиограмм
Хемография
Облучение внешними источниками
Уничтожение фона
Измерение фона
Микроскопия и микрофотография авторадиограмм
Оптическая система для освещения в темном поле
Микрофотография зернистых авторадиограмм
Исследование в темном поле
Исследование и фотографирование трековых авторадиограмм
Относительные измерения радиоактивности
Перекрестные эффекты
Факторы связанные с эмульсией и влияющие на относительные измерения
Относительные измерения в трековой авторадиографии
Счет зерен и треков
Фотометрическая оценка плотности зерен
Выбор визуального или фотометрического метода счета зерен
Необходимость абсолютных измерений
Абсолютные измерения радиоактивности с помощью трековой авторадиографии
Планирование и осуществление авторадиографических исследований
Выбор эмульсии
Эксперименты с двумя изотопами
Освоение новой методики
Контрольные процедуры, необходимые для каждого эксперимента
Проектирование и оборудование темной комнаты
Гистологическая техника и авторадиография
Выбор способа гистологической фиксации
Методика приготовления гистологических срезов
Непроницаемые пленки
Приготовление авторадиограмм для микроскопии
Авторадиография растворимых радиоизотопов
Способы авторадиографии растворимого материала
Хемография и артефакты от давления
Количественные исследовани растворимых радиоактивных изотопов
Методика съемной эмульсии
Недостатки методики съемной эмульсии
Подробное описание методики  съемной эмульсии
Методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Факторы, влияющие на толщину эмульсионного слоя
Выбор подходящей толщины эмульсии
Оценка и описание методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Методика жидкой эмульсии для трековой авторадиографии
Авторадиография с электронной микроскопией
Ограничения современных методик
Детальное описание методик
Авторадиография макроскопических объектов
Авторадиография  в макроскопических образцах
Описание методик авторадиографии макроскопических объектов
Послесловие

Сделано несколько попыток создать приборы для автоматического подсчета зерен. Дадлей и Пелк [4], например, для этой цели предложили использовать микроскоп с «летающим пятном». Мазиа и соавторы [5] разработали прибор, дающий микроденситометрическую запись определенной полосы эмульсии; но их методика требовала предварительного отделения эмульсии от ткани, фотографирования эмульсии и некоторых других операций, так что время, затрачиваемое на получение записи, намного увеличивалось по сравнению с визуальным подсчетом зерен. Наиболее точная регистрация достигается, вероятно, с помощью установки, представляющей комбинацию цитоанализатора и ядернотрекового сканера; эта установка занимает просторную комнату со сложным оборудованием [6].
Прибор, основанный на использовании освещения в темном поле, впервые предложил Гуллберг [7, 8], а его упрощенные варианты описали Денди [9] и Роджерс [10].
В списке необходимых условий для применения приборов вместо общепринятой методики визуального счета Пелк [11] перечисляет следующие: 1) подсчет зерен в эмульсии на площади в 100—400 мкм2 должен занимать не более 30 сек; 2) в функции исследователя должны входить только наблюдение и отбор участков для счета; 3) точный счет должен производиться в присутствии окрашенных срезов; 4) прибор должен обеспечивать возможность регистрации минимальных количеств зерен серебра на участке отсчета. В точной количественной авторадиографии редко достигается очень высокая плотность зерен, в то время как очень низкие их плотности будут часто встречаться в контрольных или фоновых областях; 5) приемлема погрешность счета не хуже 5—10%. Необязательно, чтобы она была выше. Результаты, пропорциональные числу зерен серебра, обычно имеют такое же значение, как и данные об абсолютном числе зерен; 6) прибор должен обеспечивать регистрацию зерен на различных фокальных уровнях в эмульсии.
К этому можно добавить еще два требования; 1) оптимальный размер и форма сканируемого участка эмульсии варьирует от эксперимента к эксперименту. Поэтому желательно, чтобы исследователь принимал это во внимание с учетом конкретного материала, который исследуется; 2) так как немногие биологи имеют навык обслуживания сложного электронного оборудования, идеальный счетчик зерен должен быть простым, надежным и сконструированным предпочтительно из доступных узлов.
Эти условия необходимы биологу для выбора наиболее оптимального типа прибора. Интересно сравнить их с возможностями при визуальном счете. Лайтха и соавторы [12], например, обнаружили, что при использовании освещения в светлом поле и эмульсии Kodak AR-10 проведение подсчета наиболее удобно, если меченые клетки имеют над собой от 25 до 35 зерен. При сравнении результатов, полученных несколькими наблюдателями, выявилось, что при исследовании более 50 меченых клеток колебания в количествах зерен не превышали ±10%. Работая с ассистентом, регистрирующим результаты, за 1 ч можно исследовать около 100 клеток [13]. Очевидно, трудности, связанные с применением прибора, не оправданны, если он -не обеспечивает скорость подсчета зерен, по крайней мере в одном поле наблюдения за 30 сек. Воспроизводимость результатов визуального подсчета зерен не очень высока, особенно, когда исследуется поле с высокой плотностью зерен. Поэтому простота конструкции и скорость исследования — более важные требования к счетчику, чем погрешность счета не более 1 %.
Счетчик должен обеспечивать также получение воспроизводимых результатов в присутствии окрашенных срезов. Для наблюдения неокрашенных авторадиограмм можно использовать фазовоконтрастную микроскопию, однако в присутствии наложенного на срез слоя желатина видимая гистологическая картина настолько плоха, что исследователь бывает вынужден прибегнуть к той или иной методике окраски среза, чтобы осуществить корреляцию получаемых значений с изучаемыми структурами или клетками. Это требование предельно затрудняет создание счетчика, основанного на применении освещения в светлом поле. Все ранее сконструированные приборы, основанные на этом способе, предназначались для исследования или неокрашенных препаратов, или же эмульсионного слоя, отделенного от образца. При обсуждении вопросов, связанных с микрофотографией, было показано, что темнопольное освещение позволяет получить световой сигнал от зерен серебра в условиях, при которых окрашенный гистологический препарат остается невидимым (см. рис. 27).
Описываемый ниже фотометрический счетчик основан на применении освещения в темном поле |7]. Он является модификацией прибора, предложенного несколько лет назад [10]. В этой модифицированной форме счетчик удовлетворяет всем перечисленным выше требованиям.
Принципиальная схема фотометрического счетчика зерен очень проста. Темнопольное освещение авторадиограмм преобразует зерна серебра в ярко светящиеся пятнышки и делает окрашенный образец невидимым (см. рис. 27 и 31). Свет, отраженный зернами серебра и попадающий обратно в объектив, собирается и направляется на фотокатод фотоумножителя. Ток, генерируемый фотоумножителем, регистрируется гальванометром. Чем больше зерен серебра присутствует в исследуемом поле наблюдения, тем больше света отражается обратно, попадая в фотоумножитель, и, следовательно, сильнее отклоняется стрелка гальванометра.
Устройство и принцип работы такого фотометра рассматриваются ниже детально, так как до настоящего времени в литературе нет описания подобного счетчика.

Система освещения

Один из первых наиболее важных шагов на пути создания фотометрического счетчика зерен — получение по возможности наилучшего темного поля. Если при визуальном наблюдении зерна серебра выглядят четкими и яркими на темном фоне, измерение создаваемого светового сигнала не представляет особых трудностей. Однако если они нечетко выражены на почти столь же светлом фоне, то любой метод, который включает измерение общего светового сигнала, отражаемого полем наблюдения, не будет достаточно чувствительным и стабильным.
При рассмотрении вопросов микрофотографирования авторадиограмм обсуждались различные осветительные системы, создающие условия освещения в темном поле. Обычную микроскопию в темном поле с дополнительным освещением и конденсором, несомненно, можно использовать для счета зерен, как это было показано Денди [9]. Недостаток данной системы в том, что образец нельзя наблюдать в светлом поле без изменения регулировки конденсора. Выбор такой осветительной системы оправдан только тогда, когда исследуемые области могут сравниваться без наблюдения окрашенного образца.
Для исследований в металловедении предназначены две альтернативные темнопольные системы, в которых свет падает сверху на предметный столик микроскопа. В первой системе, где фокусируемый на образце сходящийся конус света окружает линзу, используются объективы типа Ультропак. Такие линзы использовал Гуллберг [7, 8] в счетчике зерен. Во второй системе вертикального освещения освещающий луч поступает на образец непосредственно через линзу объектива.
Сравнение преимуществ этих двух систем было проведено ранее. Система вертикально падающего света при использовании масляно-иммерсионного объектива с высокой численной апертурой дает более темный фон и относительно более яркие зерна серебра по сравнению с системой сходящегося конуса [14]. Это наблюдение подтверждено также Таером [15].
Выбор системы вертикального освещения для фотометрического счета зерен дает некоторые дополнительные преимущества. С одной стороны, с помощью полевой диафрагмы осветителя можно уменьшить освещаемую поверхность авторадиограммы до небольшого участка в центре поля наблюдения. Такой вид диафрагмирования невозможен с линзами типа Ультропак.
Проявленные зерна серебра имеют неправильную форму и рассеивают свет во всех направлениях. Если освещается большая поверхность эмульсии, то свет, рассеянный зернами серебра в окружающих участках, заметно увеличит сигнал, исходящий из небольшой центральной части поля, даже если в ней самой не содержится зерен серебра. На этот вид эффекта Шварцшильда — Виллиджера в микроденситометрии указали Хоулинг и Фитцджеральд [16]: на результат измерения, проведенного на любом участке, всегда до некоторой степени влияет свет, рассеянный на соседних участках. Если освещен только участок эмульсии, подлежащий изучению, то влияние этого эффекта значительно уменьшается. Использование диафрагмы для ограничения диаметра пучка света до размеров измеряемой поверхности не только обеспечивает более темный фон и лучшее отношение сигнал — шум, но также, как будет показано далее, значительно упрощает оптическое устройство между объективом и фотоумножителем.
Используя систему с вертикальным осветителем, Таер [15], показал, что более темный относительно зерен серебра фон и, следовательно, значительное улучшение отношения сигнал — шум можно получить, затемняя небольшим экраном центральную часть осветительного пучка. Без такого центрального экрана аксиальные лучи света хорошо отцентрированного осветителя увеличивают отражение на внутренних оптических поверхностях между объективом, иммерсионным маслом и покровным стеклом. Этот отраженный свет, падая на фотокатод, обусловливает сильные отклонения стрелки гальванометра даже в отсутствие зерен серебра. Центральный экран можно расположить в плоскости диафрагмы осветителя, однако более просто тот же эффект достигается, если к центру передней линзы осветителя приклеить небольшой кружок из светонепроницаемого материала.
На приборе, описанном в работе [10], подобное улучшение отношения сигнал — шум действительно отмечали при использовании слегка расцентрированного конденсора, хотя причины этого явления в то время не были понятны.
Таер показал также, что попытки улучшения отношения сигнал — шум с помощью применения поляризованного света или света со смещенной фазой не приносят желаемого результата.
При измерении плотности зерен наилучшее отношение сигнал — шум обеспечивается применяемой в металловедении системой с вертикальным осветителем, который снабжен центральным экраном в плоскости осветительной диафрагмы, конденсором и полевой диафрагмой.
Следует упомянуть еще два момента, касающиеся осветительной системы. Стабильность и воспроизводимость фотометрических измерений плотности зерен зависят от лампы осветителя. Электрическое питание этой лампы необходимо стабилизировать с помощью трансформатора или аккумулятора. Кроме того, интенсивность и спектр излучения лампы становятся постоянными по прошествии некоторого времени после ее включения. Включать лампу и регулировать интенсивность света необходимо по крайней мере за 10 мин до начала измерений. Очевидно, до завершения измерений всей серии образцов не следует выключать или перемещать лампу.

Оптическая система

Чтобы выбрать участок эмульсии для сканирования и центрировать его в поле наблюдения, исследователь должен иметь возможность рассматривать авторадиограмму как при обычном светлопольном, так и при темнопольном освещении. Идеальный способ для этого — снабдить микроскоп трехокулярной насадкой и расположить фотоумножитель на вертикальном тубусе, обычно используемом для микрофотографии. Некоторые трехокулярные насадки устроены так, что полный световой лоток от поля наблюдения попадает или в окуляры, или в вертикальный тубус. В насадках других конструкций луч света направляется в окуляры или распределяется между окулярами и вертикальным тубусом, например, в отношении 20:80. Последняя схема позволяет одновременно наблюдать поле и фотографировать его. Однако использование таких насадок в счетчике зерен имеет несколько практических недостатков. Интенсивности световых сигналов, измеряемых при работах подобного рода, очень малы, и поэтому, если 20% света не достигает фотоумножителя и направляется в окуляры, к чувствительности фотометра должны быть предъявлены дополнительные требования. Более того, в окуляры может попадать свет из комнаты, внося заметный и изменчивый компонент в световой сигнал, регистрируемый фотометром. При такой конструкции насадки даже движения наблюдателя перед окулярами могут вызвать сильнейшие флюктуации в показаниях гальванометра. Таким образом, в момент измерения необходимо закрывать окуляры и направлять весь свет от поля наблюдения на фотокатод.
В первоначальном варианте фотометра [10] окуляры во время измерений не изолировали от остальной оптической системы и использовали предельно чувствительный фотоумножитель. Поэтому для устранения реакции гальванометра на сравнительно высокую и изменчивую освещенность лаборатории фотометр помещали в светонепроницаемый бокс, который в момент измерения закрывали. Это громоздкое сооружение практически не позволяло проводить исследования с высокой скоростью, необходимой для того, чтобы оправдать создание такого счетчика. Установка, используемая в настоящее время в этой лаборатории, снабжена трехокулярной насадкой, изолирующей окуляры от оптического тракта на время измерения, и фотоумножителем с более точно подобранной к условиям счета зерен чувствительностью. В этом случае нет необходимости в светонепроницаемом боксе, вследствие чего скорость и простота операций значительно возросли. Что касается остальной части оптической системы между объективом и фотокатодом, то чем проще конструкция, тем лучше. Описанный в работе фотометр [10] был в основном простой проекционной системой. Свет от поля наблюдения выходил из объектива слегка расходящимся пучком и, пройдя через единственную линзу без использования окуляров, попадал на фотокатод. Размер поля измерения контролировался диаметром осветительного пучка на полевой диафрагме. Эта система показала себя относительно нечувствительной к небольшим изменениям фокусировки (табл. 6).

Таблица 6
Фотометрические измерения плотности зерен в одном и том же участке эмульсии Ilford К2 над клетками с включением тимидина-Н3


Положение
объектива

Показание, ед.

Положение объектива

Показание, ед.

Положение объектива

Показание, ед.

Положение объектива

Пока
зание,
ед.

1

8,8

4

9,4

6

9,4

9

9,8

2

9,0

5

9,4

7

9,7

10

10,0

3

9,0

 

 

8

10,1

11

10,1

Примечание. После каждого показания объектив приближали к препарату на 1 мкм. Визуально все зерна серебра были в фокусе между позициями 5 и 6. Ясно, что влияние значительных изменений фокусировки относительно невелико, и все показания для поля с большим или меньшим числом сфокусированных зерен серебра почти не различаются [10].

Визуально точно сфокусированные зерна создают на фотокатоде яркие пятнышки света. Рассеянный свет от визуально не сфокусированных зерен распределяется по более обширным участкам поверхности фотокатода. При использовании эмульсионного слоя с обычной для зернистых авторадиограмм толщиной (предположим, до 2 мкм после обработки, обезвоживания и монтировки покровного стекла) не возникает трудностей, связанных -с распределением зерен на различных фокальных уровнях. Показания гальванометра не изменяются, даже если между измерениями авторадиограмму вынимать из микроскопа при условии, что зерна были сфокусированы.
Для фотометрического счета зерен можно использовать промежуточные оптические системы, входящие в состав серийно выпускаемого оборудования, например, такого, как микроспектрофотометр нью-йоркской фирмы «Лейтц». В этой более сложной системе поле наблюдения ограничивается до необходимой для измерения величины применением диафрагмы, располагаемой в фокальной плоскости перед фотокатодом.

Такая конструкция требует, чтобы зерна серебра были точно сфокусированы в плоскости диафрагмы. Если зерна серебра измеряемого участка находятся вне фокуса, то некоторая часть отражаемого ими света, попадая на фотокатод, будет экранироваться этой диафрагмой. С другой стороны, если зерна серебра, расположенные в непосредственной близости к измеряемому участку, находятся не в фокусе, то некоторая часть рассеянного ими света пройдет через отверстие диафрагмы. Следовательно, если не все зерна серебра в измеряемом участке и непосредственном его окружении точно сфокусированы, такой способ ограничения является источником ошибок. Даже на авторадиограммах трития очень редко встречается, чтобы все зерна, наблюдаемые с помощью объектива с высокой апертурой, лежали в одной фокальной плоскости. Таким образом, эта более сложная и тщательно разработанная оптическая система менее пригодна для проведения подобного рода измерений, для которых, кстати, она и не предназначалась.
Хотя рассматриваемый микроэлектрофотометр более чувствителен к небольшим изменениям фокусировки по сравнению с описанной ранее простой проекционной системой, тем не менее подобное оборудование можно использовать в фотометрических счетчиках зерен.
Бартелс [17] предложил в качестве промежуточной оптической системы в фотометрическом счетчике зерен использовать значительно более простой микрофлюориметр. Несмотря на то, что в этом приборе диафрагма также расположена перед фотокатодом, он, вероятно, должен быть менее чувствительным к слабым изменениям фокусировки. Предварительные измерения показали, что такая конструкция, как и предсказывалось, в большей степени подходит для счетчика зерен по сравнению с более сложным и дорогим микроспектрофотометром.
Подводя итог требованиям, предъявляемым к оптической системе, необходимо заметить, что она должна быть как можно более простой. Вполне достаточно прямой проекции света из объектива на фотокатод без применения промежуточных линз. В момент измерения оптическую систему необходимо полностью изолировать от окуляров, чтобы предотвратить флюктуации в показаниях из-за проникновения внешнего света.

Фотоумножитель

Желательно, если это возможно, чтобы фотоумножитель, высоковольтный выпрямитель и гальванометр составляли единый узел. В настоящее время несколько фирм выпускают такое оборудование, предназначенное в основном для микроспектрофотометрии. Высоковольтный выпрямитель, позволяющий оператору при подборе необходимой чувствительности к ожидаемому световому выходу от поля наблюдения в образце менять напряжение на ФЭУ, обладает очевидным преимуществом.

Удобно так же, чтобы и гальванометр имел несколько режимов чувствительности.
При отсутствии коммерчески доступных узлов можно в соединении с высоковольтным выпрямителем и гальванометром использовать фотоумножители, предназначенные для сцинтилляционного счета [10].
Большое значение имеет чувствительность ФЭУ. Проверенные мною два не слишком дорогих микрофотометра оказались недостаточно чувствительными для регистрации небольшого количества зерен серебра. Следует помнить, что подобные приборы обычно предназначены для измерения света, поглощаемого окрашенным препаратом в условиях освещения в светлом поле, и что световой сигнал, создаваемый единичным зерном серебра при вертикально падающем освещении, предельно мал в сравнении с интенсивностями света в упомянутых измерениях. С другой стороны, фотоумножители, предназначенные для сцинтилляционного счета, часто чрезвычайно чувствительны, что также может вызвать определенные трудности. Необходимое при их использовании снижение освещенности препарата уменьшает величину полезного сигнала по отношению к уровню шума, который обусловлен внешним светом, проникающим в оптическую систему. Микроокопы не проектируются полностью светоизолированными, и поэтому применение сверхчувствительных фотоумножителей требует помещения их в светонепроницаемые боксы, что затрудняет достижение необходимой для подобного рода приборов скорости операций.
Используемый в настоящее время в нашей лаборатории фотоумножитель фирмы «Фотовольт», модель 520-М, обладает как раз достаточной чувствительностью. Отклонение стрелки гальванометра на всю шкалу в наиболее чувствительном режиме достигается при освещенности 0,01 мклм.
В нашей лаборатории для фотометрического счета зерен используют оборудование, выпускаемое фирмой «Лейтц», но могут быть с успехом использованы и приборы других фирм.
Собственно микроскоп представлен стандартным исследовательским микроскопом «Ортолюкс» с механизированным столиком и расположенным под ним конденсором для работы в проходящем свете. В процессе работы стабилизатор напряжения гарантирует сглаживание напряжения, подаваемого на лампу вертикального осветителя. Использован вертикальный опак — осветитель типа ОРАК, снабженный револьверным держателем объективов: в центре передней линзы этого осветителя расположен кружок черного пластика диаметром около 2 мм. В револьверный держатель микроскопа вставлен слабоувеличивающий объектив (X 10, ч. а. 0,30) для отыскивания в проходящем свете необходимого для измерения участка авторадиограммы и масляно-иммерсионный объектив (PI. Аро. Х100, ч. а. 1,32) для проведения собственно измерений.
Трехокулярная насадка FS с наклонными бинокулярными и вертикальной монокулярной трубками позволяет во время измерений изолировать окуляры от оптической системы.
Микрофлюориметр фирмы «Лейтц», установленный на моноокулярной трубке, соединен с исследовательским блоком фотометра модели 520-М.

Работа с фотометром

Предположим, что имеется микроскоп с вертикальным осветителем и подходящей оптической системой, соединенной с фотоумножителем и гальванометром. Рассмотрим, как такой прибор должен использоваться и что необходимо, чтобы при этом выполнялись требования, перечисленные на стр. 136. Во-первых, надо представить, что измеряется фотометром такого типа. Этот прибор не считает число зерен серебра в поле наблюдения. Он измеряет свет, отраженный зернами серебра. Разница может быть ощутимой.
Если толщина эмульсионного слоя после процесса обезвоживания, монтирования и помещения покровного свекла превышает 3 мкм, зерна серебра, лежащие глубоко в эмульсии, будут отражать меньше света, чем зерна, находящиеся ближе к поверхности. Если эмульсия пропитана красителем, этот эффект усиливается. Следовательно, в таких случаях расположение зерен серебра в эмульсии может очень существенно влиять на их световой выход.
Большие колебания в размере зерен серебра вызовут соответствующие вариации в количестве света, отраженного каждым зерном. Крупные зерна отражают больше света, чем маленькие. При большом количестве зерен в поле наблюдения эти колебания не оказывают заметного влияния, поскольку в каждом из исследуемых полей присутствуют частицы всех размеров. Единственная ситуация, в которой могут наблюдаться значительные отклонения результатов фотометрического и визуального счета зерен, создается при сравнении зерен серебра, обусловленных излучением трития, с зернами фона. Зерна серебра, образуемые тритием, в среднем значительно крупнее редко расположенных зерен фона (см. рис. 36) В этих условиях показания фотометра для поля с зернами серебра, обусловленными излучением трития, будут более высокими по сравнению с показаниями для поля с таким же числом зерен фона. Визуальный подсчет, разумеется, дает одинаковый результат в обоих случаях.
Фотометр, регистрирующий интегральное количество света от всего измеряемого поля, не способен отличать зерна серебра от других отражающих свет объектов. Этим положением исследователю необходимо руководствоваться при выборе полей для проведения измерений.
Приняв во внимание сказанное выше, можно с уверенностью констатировать, что правильно установленный фотометр при измерениях будет давать вполне приемлемые результаты. На рис. 37 представлена зависимость между показаниями фотометра и визуально подсчитанным количеством зерен для нескольких исследованных полей.

Рис. 37. Зависимость показаний фотометра от числа зерен серебра, находящихся в измеряемом поле.
При отсутствии зерен серебра наблюдается отклонение стрелки прибора на 48 единиц. Выше этого значения обнаруживается линейная зависимость между фотометрическими показаниями и результатами визуального подсчета. Вертикальные метки—среднее, наибольшее и наименьшее значения трех подсчетов зерен. Горизонтальные метки — среднее, наибольшее и наименьшее значения трех фотометрических измерений [14].
Даже при полном отсутствии зерен серебра свет, отражаемый и рассеиваемый оптической системой, исследуемым образцом и эмульсионным слоем, вызовет отклонение стрелки гальванометра. Величина таких отклонений для каждого препарата остается постоянной. Выше этого значения, характеризующего чистое поле зрения, отклонение стрелки гальванометра линейно зависит от числа присутствующих зерен серебра. При очень высоких плотностях зерен их частичное наложение может уменьшить средний световой сигнал в расчете на одно зерно, как было показано ранее (см. стр. 71), такие условия для измерения радиоактивности не пригодны. Линейная зависимость между показаниями прибора и числом зерен в исследуемых областях сохраняется в широком диапазоне. При числе зерен свыше 20 на одно поле воспроизводимость визуальных подсчетов начинает падать, в то время как для фотометра она остается постоянной во всем измеряемом диапазоне плотностей.
Если чувствительность прибора повышается за счет увеличения высокого напряжения на ФЭУ, то чистому полю будут соответствовать более высокие показания гальванометра, а угол наклона прямой на рис. 37 уменьшится, т. е. одному зерну серебра будет соответствовать большее отклонение стрелки прибора. Соответственно уменьшение высокого напряжения снизит показание гальванометра от чистого поля, и на зерно серебра будет приходиться меньшее отклонение. Регулировку высокого напряжения желательно проводить по полю с такой плотностью зерен, которая ожидается при проведении конкретного эксперимента, и установить его таким, чтобы получить отклонение стрелки прибора на 80% полной шкалы.
При очень низких плотностях зерен — до 5 зерен на одно поле — колебания в размере отдельных зерен могут уменьшить точность соотношения между числом зерен и показаниями гальванометра. В таких случаях лучше использовать визуальный подсчет; применение фотометра целесообразно только тогда, когда плотность зерен превышает 10 на одно поле. В этих случаях выигрыш во времени будет значителен, а вероятность того, что статистическое распределение размеров зерен создаст трудности при интерпретации результатов, меньше.
Таблица 7
Фотометрические показатели

Примечание. Показатели характеризуют вклад окрашенного среза, покровного стекла и слоя фиксированной эмульсии в отражение света образцом. Позитивная авторадиограмма получена от среза двенадцатиперстной кишки мыши, которой вводили Н3-тимидин. Меченые клетки эпителия дают показания 10—16 единиц.

Анализ данных табл. 7 показывает, что присутствие окрашенных срезов не оказывает ощутимого влияния на показания гальванометра, подтверждая, таким образом, сделанный на основании микрофотографий (см. рис. 26—31) вывод, что срез практически не отражает свет. Это совершенно справедливо, например, для таких красителей, как гематоксилин и лейкофуксин Шиффа (окраска по Фельгену).
Как указывалось ранее, лампу вертикального осветителя необходимо включить и отрегулировать по крайней мере за 10 мин до начала измерений. Аналогично высокое напряжение на фотоумножителе следует подобрать таким, чтобы от типичного образца получались приемлемые отклонения гальванометра, а также отвести некоторое время на стабилизацию режимов работы. Совместной регулировкой полевой диафрагмы вертикального осветителя и диафрагмы промежуточной оптической системы освещаемая площадь ограничивается до размеров измеряемого участка, а с помощью диафрагмы осветителя для образца подбирают подходящие интенсивность света и отношение сигнал — шум. Разумеется, после такой настройки до окончания измерения всей серии недопустимы никакие изменения.
Начиная серию измерений для установления величины аппаратурного фона, который затем вычитается из всех последующих показаний (см. рис. 37), необходимо выделить несколько полей, не содержащих зерен серебра. Желательно проводить такое сравнение показаний от одного и того же поля, не содержащего зерен серебра. В начале и в конце серии измерений для контроля каких-либо сдвигов при освещении в светлом поле тубус с фотоумножителем тщательно изолируют от остальной оптической системы. Лампу вертикального осветителя во время наблюдения в светлом поле можно не выключать, не вызывая каких-либо нежелательных последствий. После выбора и центрирования подходящего для измерения участка осветитель выключают и тщательно фокусируют зерна серебра. Свет, отраженный полем, направляется в фотоумножитель и регистрируется гальванометром.
Ранее отмечалась необходимость стабильности в работе фотометра. В эксперименте, длившемся более 24 ч, выбранное микроскопическое поле измеряли 30 раз, причем в 10 из них препарат между измерениями полностью вынимали из микроскопа. Все показания укладывались в пределах 2% от среднего значения.
При оценке скорости работы фотометрического счетчика зерен необходимо представлять, что наибольшее время обычно занимает выбор требуемого участка измерения. В экспериментах, где отбор каждого последующего поля измерения осуществляется просто и быстро, в среднем можно рассчитывать на 30 измерений за 10 мин при условии, что занятому выбором наблюдателю ассистирует кто-либо, записывающий показания, или же к гальванометру подсоединен самопишущий прибор. На протяжении большей части рабочего дня можно поддерживать скорость 2 измерения в 1 мин без изменения точности или же воспроизводимости результатов.
В недавнем докладе Дормер с соавторами [18] описали фотометрический счетчик зерен, аналогичный разбираемому в этой главе, но оборудованный микрофотометром «Лейтц». Их результаты подтвердили стабильность, воспроизводимость измерений, линейность зависимости между показаниями гальванометра и результатами визуального счета зерен, а также возможность проведения точных измерений в присутствии окрашенного биологического материала. При использовании съемной эмульсии Kodak AR-10 фотометрические показания были нечувствительны к изменениям фокусировки; одинаковый результат наблюдался и при наибольшем, и при наименьшем числе зерен, находящихся точно в фокусе. Дормер с соавторами нашли, однако, что зерно серебра, расположенное непосредственно за границей наблюдаемого и измеряемого участка, обусловливает значительную реакцию гальванометра. Мною не обнаружено столь сильное проявление этого эффекта, подобное описанному. Можно только предполагать, что примененное ими окрашивание через съемную эмульсию привело к изрядному увеличению рассеиваемого света в расположенном над эмульсией желатиновом слое. Если бы Дормер с соавторами использовали тонкий слой жидкой эмульсии или же съемную эмульсию без желатиновой подложки, подобного эффекта, по-видимому, не наблюдалось бы.

Авторадиографические требования к фотометрическому счету зерен

Стоит специально остановиться на этих требованиях, поскольку многие исследователи, получив плохие результаты на совершенно непригодном материале, приготовленном специально для последующего визуального подсчета зерен, полностью отказываются даже от мысли когда-либо использовать фотометрический счетчик.
Прежде всего авторадиограмма должна быть пригодной для наблюдения в темном поле. Для этого процесс проявления проводят так, чтобы исключить появление многочисленных крошечных зерен фона. На рис. 38 представлена одна и та же авторадиограмма при освещении в светлом и темном поле, чтобы продемонстрировать еще раз, что авторадиограмма, вполне пригодная для наблюдения в проходящем свете, может быть совершенно неприемлемой для наблюдений в темном поле.
В идеале эмульсионный слой должен быть равномерным и после обезвоживания и монтирования покровного стекла тоньше 2 мкм для того, чтобы свести к минимуму колебания светового выхода от зерен серебра, расположенных в эмульсии на самом верхнем и нижнем уровнях. По той же причине окраска должна быть по возможности более светлой, но достаточной для выявления структур ткани. Для фотометрического счета можно также использовать съемную эмульсию с покрывающим ее слоем желатина. Однако необходимо избегать сильного или очень неравномерного окрашивания этого слоя.

Рис. 38. Микрофотографии одного и того же участка среза тонкого кишечника (Х840).
а — в проходящем свете видны большие и четкие зерна серебра; б — при освещении в темном поле наблюдается множество мелких зерен фона. Вследствие этого препарат не может подвергаться фотометрическим измерениям плотности зерен. Эмульсия Ilford G5, окраска после экспозиции гематоксилином Гарриса. Объектив Лейтц Ультропак Х100 с зеркальным конденсором.
Если требуются не только показания в единицах, пропорциональных числу зерен, но и абсолютные числа последних, приходящиеся на поле измерения, можно на основании визуального подсчета зерен на первых нескольких участках составить калибровочный график, подобный представленному на рис. 37. Как уже отмечалось, результаты подсчета зерен в двух последующих сериях авторадиограмм трудно сравнивать друг с другом. Еще труднее сравнивать данные фотометрических измерений, полученных в разных сериях, если отсутствует эталонный материал. В эксперименте с использованием фотометрического счета зерен рекомендуется обрабатывать все материалы одновременно, чтобы обеспечить идентичность проявления и других условий опыта.



 
« Автоматизированный мониторинг больных сахарным диабетом детей и подростков   Актуальные проблемы низкорослости у детей »