Начало >> Статьи >> Архивы >> Авторадиография

Необходимость абсолютных измерений - Авторадиография

Оглавление
Авторадиография
Области применения авторадиографии
Радиоактивные изотопы
Авторадиография в сравнении с другими методами обнаружения ионизирующих излучений
Ядерные фотоэмульсии и фотографический процесс
Кристаллы бромистого серебра
Желатин
Скрытое изображение
Проявление скрытого изображения
Физическое проявление
Фиксирование эмульсии
Специальные методики
Цветные эмульсии
Воздействие ионизирующего излучения на ядерные эмульсии
Бета-частицы
Другие виды ионизирующего излучения
Разрешающая способность авторадиографии
Факторы, определяющие разрешающую способность зернистых авторадиограмм
Разрешение в электронномикроскопической авторадиографии
Разрешающая способность трековых авторадиограмм
Эффективность авторадиографии
Эффективность при электронномикроскопической авторадиографии
Эффективность трековой авторадиографии
Эффективность макроскопической авторадиографии
Соотношение между факторами, определяющими разрешение и эффективность
Фон авторадиограмм
Хемография
Облучение внешними источниками
Уничтожение фона
Измерение фона
Микроскопия и микрофотография авторадиограмм
Оптическая система для освещения в темном поле
Микрофотография зернистых авторадиограмм
Исследование в темном поле
Исследование и фотографирование трековых авторадиограмм
Относительные измерения радиоактивности
Перекрестные эффекты
Факторы связанные с эмульсией и влияющие на относительные измерения
Относительные измерения в трековой авторадиографии
Счет зерен и треков
Фотометрическая оценка плотности зерен
Выбор визуального или фотометрического метода счета зерен
Необходимость абсолютных измерений
Абсолютные измерения радиоактивности с помощью трековой авторадиографии
Планирование и осуществление авторадиографических исследований
Выбор эмульсии
Эксперименты с двумя изотопами
Освоение новой методики
Контрольные процедуры, необходимые для каждого эксперимента
Проектирование и оборудование темной комнаты
Гистологическая техника и авторадиография
Выбор способа гистологической фиксации
Методика приготовления гистологических срезов
Непроницаемые пленки
Приготовление авторадиограмм для микроскопии
Авторадиография растворимых радиоизотопов
Способы авторадиографии растворимого материала
Хемография и артефакты от давления
Количественные исследовани растворимых радиоактивных изотопов
Методика съемной эмульсии
Недостатки методики съемной эмульсии
Подробное описание методики  съемной эмульсии
Методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Факторы, влияющие на толщину эмульсионного слоя
Выбор подходящей толщины эмульсии
Оценка и описание методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Методика жидкой эмульсии для трековой авторадиографии
Авторадиография с электронной микроскопией
Ограничения современных методик
Детальное описание методик
Авторадиография макроскопических объектов
Авторадиография  в макроскопических образцах
Описание методик авторадиографии макроскопических объектов
Послесловие

ГЛАВА 10
АБСОЛЮТНЫЕ ИЗМЕРЕНИЯ РАДИОАКТИВНОСТИ
НЕОБХОДИМОСТЬ АБСОЛЮТНЫХ ИЗМЕРЕНИЙ
В гл. 8 были обсуждены основные требования к относительным измерениям радиоактивности с помощью авторадиографии. Возникает вопрос, можно ли распространить те же технические приемы настолько, чтобы стало возможно измерять абсолютные значения, т. е. число радиоактивных распадов, происшедших в источнике за время экспозиции?
В большинстве авторадиографических экспериментов такие абсолютные измерения невозможны. В обычных экспериментах с использованием индикаторных количеств радиоактивности, когда меченое соединение вводят животному и изучают его последующее распределение между различными тканями и типами клеток, абсолютная скорость распада в пределах одной клетки не имеет особого значения без большого объема информации о масштабах и скорости процессов обмена. Однако встречаются ситуации, в которых такие измерения представляют интерес.
Один из примеров — быстро развивающаяся область изотопной цитохимии. Ткань можно обработать мечеными реагентами (in vivo либо in vitro) в условиях, при которых последние соединяются со специфической активной группой. Последующее измерение количества изотопа в клетке или другой гистологической структуре при контролируемых условиях позволяет обнаружить количество присутствующих в структуре групп, вступивших в реакцию. Примерами такого подхода могут служить измерения общего числа групп, вступивших в реакцию с меченным тритием уксусным ангидридом в красных кровяных клетках [1], оценка количества рецепторных участков для ацетилхолина в концевых пластинках двигательного нерва диафрагменной мышцы у мыши [2, 3] и более поздняя работа по определению количества молекул ацетилхолинэстеразы в концевых пластинках двигательного нерва [4J. Вероятно, по мере возрастания доступности высокоспецифичных энзимных ингибиторов и алкилирующих агентов этот подход найдет все более широкое применение. Очевидно, возможность определения абсолютных количеств реакционноспособных точек в пределах биологической структуры путем ее авторадиографии становится крайне важной.
В области микробиологии иллюстрацией дальнейшего применения метода абсолютных измерений является интересная работа Левинталя и Томаса [5]. Авторам удалось определить число атомов фосфора в единичной частице вируса бактериофага путем подсчета числа β-треков с применением метода, который они назвали «молекулярной авторадиографией». Во многих малых организмах, культивируемых в контролируемых условиях, можно одной из интересующих составных частей придать известную удельную активность путем соответствующего изменения радиоактивности предшественника, содержащегося в питательной среде. Последующее определение скорости распада изотопа в организме послужит мерой общего количества присутствующих молекул такого рода.
В радиобиологии изучение мощностей доз внутреннего облучения от инкорпорированных изотопов и воздействия их на ткани предполагает детальное знание распределения радиоактивности и количеств изотопа, присутствующего в каждом из облучаемых органов. Здесь тоже крайне важна возможность определения скорости распада изотопа в структуре по ее авторадиограмме.
Абсолютные измерения такого рода требуют очень высокой степени стандартизации всех процессов обработки и измерения. При относительных измерениях радиоактивности, когда активность одного источника сравнивают с активностью другого, часто бывает достаточно исходить из предположения об идентичности условий, при которых изучаются оба источника, причем детального исследования этих условий не требуется. В частности, не нужен учет самопоглощения излучения, поскольку в сравниваемых условиях оно идентично. То же самое справедливо для множества других факторов, таких, как толщина эмульсии, ее чувствительность, возможность потери определенного количества изотопа в процессе приготовления источников. Однако при абсолютных измерениях радиоактивности каждый из факторов, способных повлиять на эффективность измерений, должен быть известен и соответствующим образом скорректирован, если воздействие на эмульсию служит основой для определения скорости распада в источнике.
Часто говорят, что авторадиографическая техника в основе своей ненадежна и не может обеспечить проведения абсолютных измерений. Это справедливо только при условии, что могут быть допущены технические ошибки. Достаточно вспомнить об использовании ядерных эмульсий физиками-исследователями элементарных частиц, чтобы убедиться в возможностях метода эмульсий как очень удобного для регистрации прохождения заряженных частиц; эти возможности биологи лишь начинают использовать. При наличии хорошей техники можно определить массу заряда и начальную энергию частицы по ее следу в ядерной эмульсии.

В действительности, Пауэлл и его соавторы [6] описали элементарные частицы, которые впервые были идентифицированы с помощью ядерных эмульсий. Что касается β-частиц, то Росс с соавторами [7, 8] использовали длину трека и выход зерен в ядерной эмульсии для вычисления энергий β-частиц, испускаемых некоторыми радиоактивными изотопами. С точки зрения точности, которую можно достигнуть при использовании эмульсии, разумно ожидать, что число β-частиц, испущенных источником, может быть точно измерено; эта проблема намного проще тех, с которыми приходится сталкиваться в радиобиологии.
Во многих случаях авторадиография — единственный метод измерения скорости распада в источнике малых размеров. Ядерные эмульсии имеют высокую эффективность регистрации для низкоэнергетических β-частиц. Эмульсии обеспечивают накопление эффекта, т. е. кумулятивную регистрацию; поскольку воздействие излучения может быть приурочено к крайне малым объемам эмульсии в непосредственном контакте с источником, время авторадиографических измерений может оказаться весьма продолжительным по сравнению с другими методами регистрации заряженных частиц. Для биологических источников клеточных размеров при подходящих условиях можно точно зарегистрировать радиоактивность вплоть до 1 распада в день.
В данной главе будут описаны некоторые успешные попытки абсолютного измерения радиоактивности методом авторадиографии, а также указаны технические требования, с которыми приходится сталкиваться. Чтобы осуществить это намерение без излишнего повторения значительной части материала, который изложен в других разделах, необходимы определенные допущения об условиях проведения авторадиографии. Не вызывает сомнений, что должна отсутствовать потеря или перемещение существенного количества изотопа в процессе приготовления источника для экспонирования, или, если это невозможно, указанные процессы должны быть точно измерены и учтены. Должны быть известны размер и форма источника. Контакт источника с эмульсией должен быть таким, чтобы можно было пренебречь самопоглощением; в противном случае самопоглощение следует вычислить и внести соответствующую поправку. Что касается самой эмульсии, то должны быть выбраны соответствующие время экспозиции и продолжительность проявления, чтобы избежать ошибок из-за переэкспонирования эмульсии или неадекватного проявления. До тех пор, пока все перечисленные условия не удовлетворены, возможность определения скорости распада в источнике является спорной. Очевидно, корректно осуществляемые абсолютные измерения радиоактивности требуют от исследователя высокой технической подготовленности и проведения определенного числа контрольных экспериментов.
Одно из условий проведения точных измерений — контроль регрессии скрытого изображения — требует более подробного рассмотрения.

Контроль регрессии скрытого изображения

Как указывалось выше, образование скрытого изображения внутри кристалла галоидного серебра является обратимым процессом. Повышенная температура усиливает нестабильность скрытого изображения, причем активную роль в разрушении скрытого изображения играет присутствие окислителей, таких, как кислород воздуха и вода в эмульсии. Эмульсии различают по способности к регрессии скрытого изображения. Меньшей стабильностью скрытого изображения отличаются эмульсии с более мелкими размерами зерен и эмульсии более высокой чувствительности.
Явно влияет на стабильность скрытого изображения время экспонирования. Экспонирование в течение 2—3 месяцев образцов, способных оказать существенное воздействие на эмульсию за 2—3 дня, может привести к заметной регрессии скрытого изображения. Меры, необходимые для уменьшения регрессии скрытого изображения, состоят главным образом в контроле условий экспонирования. Во-первых, авторадиограммы обычно выдерживают при низкой температуре (рекомендуется температура + 4°С), хотя используемые эмульсии можно охладить до —40° С без каких-либо повреждений вследствие потери влаги. Во-вторых, важно равномерно высушить эмульсию: Ilford следует высушить до относительной влажности 45—50%· Мессиер и Леблон [9] настаивают на том, что для избежания регрессии скрытого изображения эмульсий Eastman и Kodak NTB требуется очень низкая абсолютная влажность, вплоть до 0. Чтобы исключить воздействие атмосферного кислорода, Герц [10J предложил простой метод экспонирования в углекислом газе. Такое решение кажется удовлетворительным, однако при наличии воды в эмульсии может получиться кислая среда, и нет прямых доказательств, что этого можно избежать. Лучше использовать любой имеющийся в наличии инертный газ, например азот, гелий или аргон.
Каким образом можно выявить регрессию скрытого изображения в тонком слое эмульсии в случае регистрации радиоактивности по увеличенной плотности зерен серебра? Серию пластинок подвергают одинаковому воздействию светом либо ионизирующим излучением, а затем проявляют через различные промежутки времени. Если почернение, измеренное путем счета зерен или с помощью микроденситометра, остается постоянным, регрессия скрытого изображения, которое образовалось при начальном облучении, отсутствует (рис. 39).

Рис. 39. Влияние регрессии скрытого изображения в эмульсионном слое, умышленно увлажненном перед началом экспонирования:
1 — наблюдаемые плотности зерен уменьшаются с увеличением экспозиции: 2 — неизменная плотность зерен на пластинке, экспонированной в отсутствие регрессии.
Если плотность зерен уменьшается с увеличением промежутка времени между экспонированием и проявлением, регрессия имеет место. Вероятно, этот способ наиболее удобен для экспериментального выявления оптимальных условий экспонирования.

Чтобы обеспечить удовлетворительный контроль регрессии скрытого изображения у каждой партии авторадиограмм, счет зерен следует проводить вокруг аналогичных структур при экспонировании в различные промежутки времени (рис. 40).
Рис. 40. Увеличение плотности зерен серебра вокруг меченого источника с возрастанием времени экспонирования:

1 — линейная зависимость между плотностью зерен и временем экспонирования, свидетельствующая об отсутствии регрессии скрытого изображения; 2 — уменьшение скорости возрастания плотности зерен с увеличением времени экспонирования вплоть до достижения плато. когда скорость образования скрытого изображения равна скорости его регрессии,
После введения соответствующей поправки на радиоактивный распад возрастание числа зерен со временем должно изображаться прямой линией. Регрессия скрытого изображения выражается в потере числа зерен по сравнению с предполагаемым, исходя из начальной скорости его возрастания. Если регрессия существенна, кривая может выйти на плато, когда скорость образования скрытого изображения равна скорости регрессии.
В авторадиографии с оценкой плотности зерен, как упомянуто в гл. 6, с регрессией скрытого изображения часто приходится мириться в целях сохранения низкого фона. В большинстве методик приведение в контакт эмульсии и образца и последующее высушивание создают определенное количество зерен фона. В условиях регрессии скрытого изображения длительное экспонирование приводит к исчезновению зерен, образовавшихся в начале экспонирования. В этих условиях, вероятно, фон будет состоять из зерен, вызванных посторонними источниками излучений. При работе по методикам, позволяющим получать авторадиограммы хорошего качества с возможно меньшим фоном, регрессия скрытого изображения обычно имеет место, даже если исследователь и не подозревает об этом. Строгий контроль условий экспонирования может 'поэтому привести к более высоким уровням фона, поскольку принимаются меры по сохранению всех зерен, присутствовавших в начале исследования, так же как и возникших во время экспонирования под действием излучения источника.
Если учесть, что регрессия скрытого изображения, почти с неизбежностью присущая всем авторадиограммам, в некоторых случаях играет положительную роль, а также принимая во внимание трудность установления регрессии без специального исследования эмульсии, нельзя утверждать слишком категорично, что измерение скорости распада не является корректным, если линейная зависимость реакции эмульсии от времени экспозиции не установлена достаточно четко.
Рассмотрение трековой авторадиографии показывает несколько отличную картину. Объектами, подвергаемыми регистрации, в данном случае являются не отдельные зерна серебра, а треки, и даже если регрессия скрытого изображения уменьшает, скажем, на 1/3 число зерен в треке, последний все еще можно распознать. При наличии небольшого опыта и при постоянных условиях проявления можно выявить пределы вариаций в размере и расположении зерен в треках данной длины. Регрессия скрытого изображения приводит к исчезновению малых зерен и уменьшению размера больших. В действительности на пластинке при наличии регрессии скрытого изображения трек, образовавшийся непосредственно после начала экспозиции, будет характеризоваться большими промежутками между зернами и меньшим размером зерен по сравнению с треком, образовавшимся перед концом экспозиции.
Столь незначительные степени регрессии можно выявить при изучении любой авторадиограммы без заметной разницы в счете треков.

Очевидно, при достаточно продолжительной регрессии скрытого изображения возрастание расстояния между сохранившимися его участками приводит к невозможности проследить трек, поскольку все, что в таком случае остается от треков, образовавшихся в начале экспозиции, — это несколько небольших серий мелких зерен, которые невозможно связать между собой. Рис. 41 иллюстрирует это явление.    

Рис. 41. Микрофотография β-треков на авторадиограмме с эмульсией Ilford G5 (X850) получена при наличии регрессии скрытого изображения:

Видны две части треков от частиц Р32. В одном треке зерна серебра имеют нормальное распределение размеров и характеризуются обычной плотностью расположения, во втором треке зерна имеют меньшие размеры и более разбросаны, чем обычно. Первый трек, вероятно, образовался в самом начале экспозиции, второй — незадолго до ее окончания.
Одновременное присутствие нормального и «репрессированного» треков на одной и той же авторадиограмме явно доказывает наличие регрессии скрытое изображения.
Попытки провести абсолютные измерения и явно обнаруживается при использовании методики экспонирования одного и того же объекта на нескольких пластинках.
Подобная сильная регрессия обрекает на неудачу в течение возрастающих промежутков времени, как это было в случае авторадиографии с оценкой плотности зерен.
Если требуется провести абсолютное измерение, то независимо от того, являются ли объектом регистрации треки или зерна серебра, более выгодно иметь данные для нескольких периодов экспозиции, чем то же количество наблюдений для единственной экспозиции. В первом случае можно удостовериться в отсутствии регрессии скрытого изображения; во втором —приходится предполагать ее возможность или проводить специальные контрольные опыты, чтобы убедиться в отсутствии регрессии.

АБСОЛЮТНЫЕ ИЗМЕРЕНИЯ С ПОМОЩЬЮ ЗЕРНИСТЫХ АВТОРАДИОГРАММ

Предположим, что многие технические проблемы приготовления приемлемой авторадиограммы полностью решены и что нет потери изотопа, отсутствуют хемография, регрессия скрытого изображения и т. д. Радиоактивный источник покрыт тонким слоем ядерной эмульсии, и проявленные зерна около него можно легко подсчитать. Возможно ли соотнести наблюдаемое число зерен с числом радиоактивных распадов, происшедших в источнике за время экспонирования? На первый взгляд, положительно решить этот вопрос нетрудно, поскольку распады, происшедшие в источнике, явились причиной образования зерен серебра и должно существовать некоторое определенное количественное соотношение. В действительности же это соотношение имеет очень сложный характер.
Существует два совершенно различных подхода к этой проблеме. Первый из них представляет собой попытку строго математически предсказать выход зерен от данного источника, основываясь на некоторых общих положениях. Второй подход является эмпирическим и состоит в приготовлении контрольных источников известной активности и измерении выхода зерен при воспроизводимых условиях. Каждый из них будет рассмотрен ниже.

Вычисление выхода зерен

β-Частицы имеют весьма извилистые треки, поэтому всякие предсказания, основанные на распределении в пространстве их траекторий, должны иметь статистический характер, причем с весьма широкими пределами колебаний. Математическая обработка результатов рассеяния коллимированного пучка моноэнергетических электронов, проходящих через гомогенную среду с известными характеристиками, уже достаточно сложна. К тому же β-частицы, испускаемые при распаде радиоактивного изотопа, характеризуются непрерывным спектром начальных энергий и могут покидать источник в любом направлении. В дополнение к этому β-частица, авторадиографически представленная на рис. 15,в, распространяется в четырех различных средах — в стекле пластинки, в материале самого источника, которым обычно является срез ткани, в ядерной эмульсии и в воздухе или инертном газе, в котором происходила экспонирование.

Принимая во внимание все эти факторы, можно утверждать, что точно предсказать плотность зерен от источников известной активности в настоящее время нельзя по многим причинам. Прежде всего отсутствуют достаточные сведения о рассеянии электронов на границе сред с различной плотностью, необходимые для выполнения весьма трудоемких вычислений.

Вследствие этого любую попытку вычислить плотность зерен необходимо начинать с ряда упрощающих предположений.
Наиболее серьезными попытками вычислить ожидаемые плотности зерен для известных авторадиографических ситуаций являются работы Одеблада [11 — 13]. Для иллюстрации трудности такого подхода эту работу следует рассмотреть несколько подробнее. Она представляет собой весьма интересную попытку применить матричную теорию к вычислению плотности зерен на авторадиограммах. Вначале автор сделал определенные упрощающие предположения: 1) распределение радиоактивного изотопа в срезе ткани соответствует наблюдаемой гистологической структуре и в пределах каждой структуры, например ядра клетки, распределение активности однородно; 2) рассматривается действие большого числа β-частиц на эмульсию, так что, вероятно, справедливы статистические расчеты, основанные на характеристиках всего спектра энергий изотопа. Кроме того, автор предположил, что имеются точные данные о форме и размерах изучаемых гистологических структур, о толщине среза, эмульсии, материале прослойки.
Затем Одеблад вводит систему прямоугольных координат, в которой оси х и у лежат в плоскости образца, а ось z перпендикулярна к ней. С помощью этих координат можно выразить соотношение между данной гистологической структурой и определенным объемом эмульсии. Далее он предположил, что перенос β-частиц от образца к эмульсии в условиях эксперимента можно описать безразмерным коэффициентом переноса Т(С).
Зерна, наблюдаемые в любом выбранном объеме эмульсии, возникли под действием излучения из непосредственно примыкающей структуры образца, а также вклада излучения других соседних структур, зависящего как от их удаления от рассматриваемого объема эмульсии, так и от суммарного содержания радиоактивности. Изучив таким образом большое число участков эмульсии, можно получить набор уравнений, которые связывают наблюдаемые плотности зерен серебра с геометрическими соотношениями между выбранными объемами в эмульсии и каждой гистологической структурой, с объемом каждой структуры и с концентрациями изотопа в ней.
Для решения этих уравнений необходимо знать коэффициент переноса Т(С) для каждого конкретного изотопа. Необходимые для решения матричные элементы должны либо вычисляться, либо определяться экспериментальным путем. Коэффициент пропорциональности для рассматриваемых условий авторадиографирования находят, используя для удобства точечные или плоскостные источники известной активности, для которых легко вычислить матричные элементы.

Работа по предварительному определению этих факторов очень трудоемка и требует проведения многочисленных измерений. Требуемые математические приемы также весьма сложны Тем не менее, как только необходимые коэффициенты будут определены для данной авторадиографической ситуации, количество радиоактивности в любой структуре биологического образца можно вычислить из наблюдаемых плотностей зерен.
Существует одно ограничение для описанного математического подхода, на которое указывает Одеблад. Для изотопов с низкой граничной энергией β-спектра применение коэффициента перехода Т(С) не вполне оправдано. Например, для Н3 самопоглощение становится настолько существенным фактором, что использовать этот коэффициент невозможно. Одеблад считает, что его подход справедлив только для изотопов со значительно большей максимальной энергией, таких, как Р32.
Прежде чем система уравнений может быть решена даже с вышеперечисленными упрощающими предположениями, по крайней мере два коэффициента должны быть найдены эмпирически— коэффициент переноса и коэффициент пропорциональности. Проведенный Одебладом анализ весьма убедительно иллюстрирует трудности, с которыми приходится сталкиваться при вычислении радиоактивности источника в сложном образце по известной плотности зерен в прилегающей эмульсии.
Не удивительно, что большинство попыток абсолютного измерения радиоактивности было основано на эмпирическом подходе, т. е. на приготовлении стандартных эталонных источников известной активности и их сравнении при контролируемых условиях с подлежащими изучению неизвестными источниками.

Метод сравнения со стандартными эталонными источниками

Имеется множество разновидностей этого метода, характеризующихся различной степенью совершенства измерения радиоактивности. В частности, широкое применение пленочных дозиметров для измерения дозы облучения персонала предполагает сравнение почернения исследуемой пленки с почернением контрольной пленки, облученной при известных условиях. Удобство этого метода связано с возможностью непосредственного получения результатов и его простотой.
Мамуль [14] приготовил желатиновые источники с известным содержанием S35, чтобы обеспечить сравнение со своими экспериментальными данными. Вазер и Люди [3] в своих измерениях поглощения меченого кураре концевыми пластинками двигательного нерва диафрагмы у мышей использовали подобные стандартные источники, содержащие С14. Вероятно, наиболее тщательной попыткой измерить радиоактивность образца по плотностям зерен является работа Андерсена с соавторами

[15, 16], в которой изучалась амеба chaos chaos после ее кормления материалом, меченным С14. Весьма тщательно были исследованы возможные потери радиоактивности при приготовлении авторадиограммы, регрессия скрытого изображения и воспроизводимость счета зерен. Плотность почернения, вызываемую срезами амебы, сравнивали с результатами измерения активности амебы и ее срезов на счетчике Гейгера перед авторадиографией. К тому же были изготовлены и подвергнуты авторадиографии стандартные источники из раствора меченой глюкозы.
Иную цель, чем измерение радиоактивности данного источника, преследует попытка оценить мощность дозы в некоторой точке ткани животного, которому вводили радиоактивный изотоп. Однако общими для этих случаев являются как задачи калибровки воздействия излучения на эмульсию, так и трудности интерпретации различных геометрических соотношений между тканью и эмульсией. Методические приемы и способы вычислений, приемлемые в дозиметрии внутреннего облучения, иногда можно использовать и при измерениях радиоактивности. Дозу облучения щитовидной железы I131 оценили Синклер и др. [17J; Блакетт и др. [18] изготовили цилиндрические источники различного диаметра и высоты, меченные известными количествами Р32, и использовали их при интерпретации авторадиограмм кости. Подобную технику при работе с Sr90 использовали Вауган и Оуэн [19]. Подробную библиографию по дозиметрии внутреннего облучения и авторадиографии можно найти в материалах симпозиума по некоторым аспектам внутреннего облучения [20].
При любой попытке оценить количество радиоизотопа в исследуемом источнике путем сравнения его авторадиограммы с авторадиограммой эталонного источника необходимо соблюдать некоторые основные положения, которые обсуждены при описании относительных измерений радиоактивности в гл. 8. В случае самой простой геометрии исследуемые источники достаточно удалены друг от друга, чтобы производимые ими зерна серебра не перекрывались. Тогда количество -зерен серебра вблизи источника является мерой только его собственной радиоактивности. Но даже в этом случае, когда перекрытием можно пренебречь, могут возникнуть трудности при выборе объемов эмульсии, соответствующих одинаковой эффективности регистрации радиоактивности двух источников, если источники различаются по размеру или форме.
В идеальном случае эталонный источник должен быть максимально подобен исследуемому источнику. Барнард и Марбрук [1] предложили в качестве одного из способов получения однородно меченных эталонных источников клеточных размеров вводить при контролируемых условиях в красные кровяные клетки лягушки меченный тритием уксусный ангидрид.

Клетки или бактерии, выращенные в культуре в присутствии меченых аминокислот, также могут представлять собой подходящие источники. Каро и Шнёс [21] описали меченные, пораженные фагом бактерии, которые могут служить эталонными источниками при электронномикроскопической авторадиографии.
Клетки или организмы, которые можно получить в большом количестве и однородно пометить, по всей видимости, являются лучшими эталонными источниками. Суспензии таких клеток можно легко приготовить для счета в гемоцитомере, а радиоактивность известного количества отобранных клеток можно оценить, например, сцинтилляционным методом. Мазки таких эталонных источников можно экспонировать рядом с исследуемыми источниками. При соблюдении критериев, перечисленных в гл. 8 в качестве необходимых для проведения относительных измерений, отношение числа зерен вблизи эталонного и исследуемого источника легко перевести в отношение их радиоактивностей.
В наиболее типичных ситуациях, когда радиоактивные источники в тканевых срезах располагаются вблизи друг друга, сравнение исследуемого и эталонного источников будет усложняться перекрестным эффектом. Количество зерен вблизи исследуемых источников отчасти обусловлено воздействием близрасположенных участков ткани, и прежде чем проводить сравнение с эталонным источником, необходимо внести соответствующие коррективы. Это может оказаться очень сложной задачей. В некоторых случаях эталонные источники можно распределить среди исследуемых источников случайным образом и выбрать соответствующие источники обоих типов с целью счета зерен в участках, где перекрестный эффект будет приблизительно одинаков. Однако это почти невозможно осуществить в срезах тканей. В этом случае можно только попытаться оцепить вклад в количество зерен вблизи исследуемого источника от соседних структур, если отыскать нерадиоактивные участки ткани, которые окружены подобными структурами, и подсчитать количество зерен в этих участках.
Абсолютные измерения радиоактивности с помощью авторадиографии с оценкой плотности зерен очень трудно осуществить с приемлемой точностью. Конечно, всегда можно подсчитать количество зерен, расположенных непосредственно над источником, и превратить их число в количество распадов, происшедших в источнике за время экспозиции, используя один нз показателей выхода зерен, опубликованных в литературе [10]. Этот подход справедлив, если единственной задачей является грубая оценка радиоактивности источника, и наличие в полученном результате коэффициента 3 или 4 не меняет ответа существенным образом. Однако ясно, что для точных измерений этот метод непригоден.

Абсолютные измерения с помощью электронномикроскопической авторадиографии

Какие-либо конкретные причины, препятствующие проведению измерений радиоактивности на электронномикроскопическом уровне, трудно отыскать. Каро и Шнёс [21] опубликовали данные об общей эффективности и разрешении авторадиографии с использованием монослоев эмульсии Ilford L4; Бахман и Салпетер [22] получили те же данные для эмульсий Ilford L4 и Eastman Kodak ΝΤΕ. Здесь существуют те же проблемы, что и в авторадиографии с использованием светового микроскопа; сравнимые объемы эмульсий должны быть изучены для исследуемого и эталонного источников. При вычислении радиоактивности необходимо принимать во внимание перекрестный эффект.
В настоящее время имеется единственная успешная попытка применить электронный микроскоп для абсолютных измерений радиоактивности [4]. Она относится к концевым пластинкам двигательного нерва, которые были обработаны in vitro тритием, меченным диизопропилфторфосфатом (ДФФ) ·—ингибитором энзимацетилхолинэстеразы. Приготовленные для электронной микроскопии срезы подвергли авторадиографии на монослоях эмульсии Ilford L4.
Предварительно были определены разрешение и эффективность метода. Были зарегистрированы все зерна серебра над концевыми пластинками двигательного нерва и вблизи них, причем показано, что это соответствует такому распределению, когда 90% энзима заключено в постсинаптической мембране.
Таблица 8
Количество молекул ацетилхолинэстеразы в концевой пластинке двигательного нерва m. sferno mastoideus мыши, оцененное путем обработки диизопропилфторфосфатом, меченным Р33 или Н3


Способ оценки

Количество молекул ацетилхолинэстеразы в концевой пластинке, X107

β-Трековая авторадиография (Р32)

1,5-3,5

Измерение с помощью жидкого сцинтиллятора (Н3)

1,0-4,4

Авторадиография с применением электронной микроскопии (Н3)

1,2—2,2

Примечание. Цифры, приведенные для треков и сцинтилляционного счета, дают диапазон значений, полученных в нескольких экспериментах; с применением электронной микроскопии проведен только один эксперимент; разброс величин отчасти связан с различающимися оценками общего объема концевой пластинки, принятыми при пересчете от концентрации радиоактивности в единице объема к значению для всей концевой пластинки (4].
Были подсчитаны все зерна серебра, возникшие вследствие радиоактивного распада, и затем вычислено количество молекул ДФФ, необходимое для получения такой интенсивности излучения. Количество молекул в кубическом микроне концевых пластинок было затем превращено в количество молекул ДФФ, связанных с ацетилхолинэстеразой во всей концевой пластинке. Полученные данные находятся в хорошем согласии с результатами β-трековой авторадиографии и измерением активности того же материала с помощью жидкого сцинтиллятора (табл. 8).
С применением электронного микроскопа и авторадиографии при наличии соответствующих условий можно провести в дальнейшем абсолютные измерения радиоактивности субклеточных структур.



 
« Автоматизированный мониторинг больных сахарным диабетом детей и подростков   Актуальные проблемы низкорослости у детей »