Начало >> Статьи >> Архивы >> Авторадиография

Абсолютные измерения радиоактивности с помощью трековой авторадиографии - Авторадиография

Оглавление
Авторадиография
Области применения авторадиографии
Радиоактивные изотопы
Авторадиография в сравнении с другими методами обнаружения ионизирующих излучений
Ядерные фотоэмульсии и фотографический процесс
Кристаллы бромистого серебра
Желатин
Скрытое изображение
Проявление скрытого изображения
Физическое проявление
Фиксирование эмульсии
Специальные методики
Цветные эмульсии
Воздействие ионизирующего излучения на ядерные эмульсии
Бета-частицы
Другие виды ионизирующего излучения
Разрешающая способность авторадиографии
Факторы, определяющие разрешающую способность зернистых авторадиограмм
Разрешение в электронномикроскопической авторадиографии
Разрешающая способность трековых авторадиограмм
Эффективность авторадиографии
Эффективность при электронномикроскопической авторадиографии
Эффективность трековой авторадиографии
Эффективность макроскопической авторадиографии
Соотношение между факторами, определяющими разрешение и эффективность
Фон авторадиограмм
Хемография
Облучение внешними источниками
Уничтожение фона
Измерение фона
Микроскопия и микрофотография авторадиограмм
Оптическая система для освещения в темном поле
Микрофотография зернистых авторадиограмм
Исследование в темном поле
Исследование и фотографирование трековых авторадиограмм
Относительные измерения радиоактивности
Перекрестные эффекты
Факторы связанные с эмульсией и влияющие на относительные измерения
Относительные измерения в трековой авторадиографии
Счет зерен и треков
Фотометрическая оценка плотности зерен
Выбор визуального или фотометрического метода счета зерен
Необходимость абсолютных измерений
Абсолютные измерения радиоактивности с помощью трековой авторадиографии
Планирование и осуществление авторадиографических исследований
Выбор эмульсии
Эксперименты с двумя изотопами
Освоение новой методики
Контрольные процедуры, необходимые для каждого эксперимента
Проектирование и оборудование темной комнаты
Гистологическая техника и авторадиография
Выбор способа гистологической фиксации
Методика приготовления гистологических срезов
Непроницаемые пленки
Приготовление авторадиограмм для микроскопии
Авторадиография растворимых радиоизотопов
Способы авторадиографии растворимого материала
Хемография и артефакты от давления
Количественные исследовани растворимых радиоактивных изотопов
Методика съемной эмульсии
Недостатки методики съемной эмульсии
Подробное описание методики  съемной эмульсии
Методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Факторы, влияющие на толщину эмульсионного слоя
Выбор подходящей толщины эмульсии
Оценка и описание методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Методика жидкой эмульсии для трековой авторадиографии
Авторадиография с электронной микроскопией
Ограничения современных методик
Детальное описание методик
Авторадиография макроскопических объектов
Авторадиография  в макроскопических образцах
Описание методик авторадиографии макроскопических объектов
Послесловие

Многочисленные неопределенности, возникающие при попытке абсолютных измерений с помощью методики оценки плотности зерен, обусловливают трудность перехода от наблюдаемого числа зерен в эмульсии к числу распадов, происшедших в образце. В трековой авторадиографии проблема существенно упрощается, так как один трек соответствует одной β-частице.
Априорно β-трековая авторадиография представляется более прямым методом измерения скорости распада в малом источнике, чем метод определения плотности зерен. В действительности применение трековой авторадиографии крайне мало разработано. Она имеет незаслуженную репутацию метода особой сложности.
Еще в 1957 г. Левинталь и Томас [5] описали абсолютные измерения, выполненные с применением трековой авторадиографии. Они метили бактериофаг Р32 и приготовили суспензию частиц этого вируса в расплавленной эмульсин Ilford G5. После остудневания, соответствующего экспонирования и проявления эмульсию просканировали для обнаружения β-треков. Вирусы не были видимы, однако их расположение в эмульсии легко регистрировалось, поскольку каждый из них располагался в центре сосредоточия β-треков, расходящихся радиально от общего источника. Количество β-треков непосредственно указывало число распадов, происшедших в вирусе за время экспозиции. Это единственный изящный эксперимент, в котором абсолютную активность источника определяли непосредственно по авторадиограмме без каких-либо упрощающих предположений или эмпирических коэффициентов, столь необходимых при интерпретации результатов методики определения плотности зерен.

В известном смысле условия этого эксперимента являются особыми. В данном случае в источниках, которые были суспендированы в эмульсии, самопоглощения не наблюдалось, что обеспечивает самый простой и наилучший с точки зрения геометрии случай соотношения источника и эмульсии. Изотоп Р32 образует длинные треки, большая часть которых вначале представляет собой прямые линии, что облегчает задачу распознавания и счета.
Измерения, проведенные Левинталем и Томасом, невозможно осуществить с помощью какой-либо доступной в настоящее время методики, и тем более удивляет то, что достигнутые при β-трековой авторадиографии чувствительность и простота не привели к широкому распространению метода.
В большинстве экспериментов, в которых предполагается использовать для абсолютных измерений трековую авторадиографию есть два усложняющих обстоятельства, которые отсутствовали в эксперименте Левинталя. Первое обстоятельство связано с долей β-частиц в энергетическом спектре изотопа, которая, как можно полагать, даст распознаваемые треки. Второе обстоятельство существенно, когда источник не может быть суспендирован в эмульсии, а его должны помещать на пластинку и покрывать регистрирующей средой только с одной стороны. Каждое из этих обстоятельств вносит неопределенность в простое во всем остальном соотношение между числом наблюдаемых треков и числом β-частнц.

Проблема нерегистрируемых β-частиц

β-Треком обычно считают четыре или более зерен серебра, расположенных примерно по одной линии. Характер их расположения был подробно описан ранее (стр. 41). Чтобы распознать трек среди хаотического распределения отдельных зерен фона в эмульсии, необходимо особо выделить некоторое минимальное количество зерен. Энергетический спектр всех β-излучающих изотопов непрерывен от максимальной энергии вплоть до нулевой, и, следовательно, частицы с энергией ниже определенной величины имеют незначительную вероятность образовать четыре зерна, расположенных кряду. Что касается Р32, то доля таких нерегистрируемых β-частиц для этого изотопа, видимо, исчисляется лишь долями процента, поскольку максимальная энергия высока (1,4 Мэв), а кривая энергетического спектра имеет колоколообразную форму; у изотопа С14, однако, максимальная энергия равна всего 155 кэв, и с учетом формы спектра (см. рис. 7) можно полагать, что значительная доля частиц имеет начальную энергию менее 40 кэв. Какова же доля таких частиц, не способных образовать четыре зерна кряду?
Эту задачу довольно подробно исследовали Леви и др. [23]. Авторы с помощью эмульсии Ilford G5 приготовили авторадиограммы изотопов С14, Са45 и С136. После обработки
эмульсию тщательно довели до прежней толщины. Таким образом, большую часть треков можно было изучать в трех измерениях в том первоначальном виде, в каком они были образованы β-частицами. Для большого количества треков были измерены количества зерен и расстояние между ними. Начальная энергия каждой частицы была неизвестна, но ее можно вычислить по длине трека. Благодаря этому получено соотношение между начальной энергией частицы и средним числом зерен, образуемых частицей в эмульсии G5 (см. рис. 2). Коэффициент вариации найденных средних значений составлял предположительно около 20%.
Из этих соотношений для любого известного энергетического спектра можно вычислить долю β-частиц, которые образуют в треке менее 4 зерен. Леви и др. [23] нашли, что менее 4 зерен образует 14% общего числа β-частиц, испускаемых С14. Для Са45 доля нерегистрируемых частиц равна 10%.
Приняв, что β-трек образуется четырьмя или более зернами, для любого изотопа с максимальной энергией свыше 150 кэв можно вычислить долю частиц, которые, по всей вероятности, не будут распознаны ввиду неспособности создать 4 проявленных зерна. С учетом этого коэффициента вносятся поправки в фактически зарегистрированное количество наблюдаемых треков. При максимальных энергиях ниже 150 кэв доля нерегистрируемых частиц становится существенной, неопределенность результатов их подсчета возрастает; поэтому корректирующий множитель становится как менее точным, так и более важным.

Влияние различной геометрии соотношения между источником и эмульсией

В описанном выше эксперименте Левинталя и Томаса [5] точечные источники Р32 были суспендированы в эмульсии. Поэтому регистрировались все β-частицы, испускаемые источником. Такая весьма благоприятная ситуация бывает далеко не всегда. Каким образом соотнести число треков в эмульсии и число β-частиц, когда источник расположен на стеклянной пластинке и покрыт эмульсией лишь с одной стороны?
Рис. 19 иллюстрирует эту типичную в авторадиографии ситуацию. Предположим, что источник имеет малые размеры и изолирован от других источников. Разумно предположить, что 50% всех испускаемых β-частиц движется по направлению к эмульсии, а 50%—по направлению к стеклянной подложке. Некоторые из β-частиц, вошедших в эмульсию, в какой-то точке своей траектории испытывают обратное рассеяние и вновь покидают эмульсию. Аналогично некоторые из частиц, попавших в стекло, будут рассеяны в эмульсию на различных расстояниях от источника.
Среднее расстояние между соседними зернами серебра в начале трека частицы с энергией, близкой к максимальной энергии β-спектра рассматриваемого изотопа, может быть легко вычислено из данных Леви и др [23]. Оно равно 1,6 мкм для С14; 2 мкм— для С136 и не превышает 2,5 мкм для изотопа с любой более высокой энергией. Могут, естественно, встретиться случаи, когда расстояние между соседними зернами будет вдвое больше среднего значения, однако это маловероятно. Следовательно, с весьма высокой вероятностью первое зерно серебра будет обнаружено в пределах 3,2 мкм для источника С14, 4,0 мкм от источника С136 и 5,0 мкм для высокоэнергетических частиц с минимальной ионизирующей способностью. Если посмотреть на источник сверху, то круг такого диаметра должен содержать начало почти всех треков.
При измерении активности источника следует подсчитывать каждый трек в пределах такого радиуса вокруг источника. Количество треков в пределах указанного радиуса вокруг источника, умноженное на два, дает общее число распадов, происшедших в источнике. Разумеется, поскольку первичное направление β-частиц, покидающих источник, имеет случайное распределение, существует статистическая неопределенность, связанная с этим коэффициентом 2, использование которого тем более достоверно, чем больше треков подсчитано.
До сих пор имеется мало данных о рассеянии β-частиц на границе эмульсии и ее стеклянной подложки. Предварительная оценка этой величины показывает, что менее 20% испускаемых источником β-частиц пересекает граничную поверхность стекло — эмульсия в какой-либо точке своей траектории, причем эти точки распределены в общем случае по довольно большой поверхности. Если рассматривать малый источник Р32, помещенный на стеклянной пластинке, то свыше 75% всех треков в эмульсии обнаруживается в пределах 5 мкм от источника, в то время как остальные треки распределены на площади радиусом в несколько сот микронов.
Кривая распределения расстояний от меченного Р32 точечного источника, на которых начинаются треки в эмульсии, имеет поэтому форму, показанную на рис. 42. Она далека от кривой колоколообразной формы. Скорее она имеет острый пик вблизи источника с очень резким падением до малых значений на расстояниях более 5 мкм. Вследствие этого относительно просто распознать и посчитать треки от частиц, входящих в эмульсию прямо из источника. Распределение такого вида может также упростить проблемы, связанные с перекрестным эффектом, так как вероятность обнаружения точки входа частицы, обратно рассеянной в эмульсию из стекла, примерно одинаково низка в пределах большого пространства вокруг источника.

Экспериментальная оценка измерений с помощью β-трековой авторадиографии


Рис. 42. Различие между распределением зерен серебра и точек начала β-треков вокруг источника, меченного Р32.
Плотность зерен в тонком слое эмульсии (кривая 1) падает с увеличением расстояния от источника относительно медленно. Наоборот, число точек начала треков в толстом эмульсионном слое (кривая 2) падает очень резко уже при малых расстояниях от источника (4—5 мкм).

Рис. 43. Зависимость числа β-треков на единице площади эмульсии от времени экспонирования.
Проиллюстрируем двумя экспериментальными примерами применимость измерений радиоактивности биологических объектов по трекам, а также хорошее совпадение результатов этих измерений с данными, полученными с помощью жидкого сцинтиллятора.

Исследуемой тканью являлась печень новорожденной мыши, которой ввели аминокислоту, меченную С14; парафиновые срезы подвергали авторадиографии на эмульсии Ilford G5 толщиной 25 мкм. Увеличение числа треков с увеличением времени экспозиции имеет линейный характер, что указывает на отсутствие регрессии скрытого изображения. Поэтому экспериментальные данные пригодны для измерения радиоактивности.
В первом опыте меченный С14 лейцин вводили новорожденной крысе, после чего готовили срезы участков печени.
Синтез протеина в печени протекает настолько быстро, что практически каждая клетка оказалась меченой, и радиоактивная метка распространилась однородно по всей ткани. Срезы имели толщину 5 мкм, некоторые из них покрывали эмульсией Ilford G5 для проведения β-трековой авторадиографии; другие срезы наклеивали на предметные стекла и окрашивали, чтобы измерить площадь каждого среза; некоторые депарафинировали в кислоте и суспендировали в сцинтиллирующей жидкости для последующего измерения активности на сцинтилляционном счетчике.
Счет сцинтилляционной установки (за вычетом фона) составил в среднем 245,9 имп/мин для образца из 5 исследуемых срезов. Гасящее действие примесей не обнаружено, а эффективность счета, оцененная с помощью взвешенного количества толуола, меченного С14 до известной активности, оказалась равной 64,5%. Это соответствует 330 расп/мин для пробы из 5 срезов.
При подсчете треков на авторадиограммах при трех различных сроках экспозиции не обнаружено регрессии скрытого изображения (рис. 43). Количество треков от каждого участка умножали на коэффициент, соответствующий переходу к площади 5 срезов, и таким образом вычисляли количество треков в минуту для 5 срезов. В полученную величину вводили поправку, соответствующую 14% β-частиц С14, которые могут образовать распознаваемый трек из 4 или более зерен (см. стр. 167). Окончательно скорректированное количество треков удваивали с учетом того, что половина β-частиц попадала в эмульсию. Оцененная этим методом скорость счета 5 срезов составила 325 имп/мин.
Совпадение полученных результатов весьма многообещающе. Интересно сравнить возможность непосредственного получения результатов и простоту метода β-трековой авторадиографии с весьма сложным и во многом неопределенным методом оценки числа распадов в источнике по плотности зерен на авторадиограмме.
Другим подтверждением пригодности метода оценки радиоактивности но числу треков, входящих в эмульсию непосредственно от источников, является работа Роджерса с соавторами [4]. Они измерили количество молекул диизопропилфтор- фосфата (ДФФ), меченных Р32, которые были связаны с энзимом ацетилхолинэстеразой в нейромоторных концевых пластинках грудинно-сосковой мышцы мыши. β-Трековая авторадиография срезов из единичных концевых пластинок была проведена с помощью эмульсии Ilford G5 (см. рис. 32). Количество треков, начинающихся непосредственно от пластинок, было принято за половину числа распадов, происшедших в концевой пластинке за время экспозиции. Таким путем оценили количество молекул ацетилхолинэстеразы в концевых пластинках.
С помощью ДФФ, меченного Н3, проведены измерения в жидком сцинтилляторе, результаты которых обнаружили хорошее совпадение с результатами β-трековой авторадиографии, а также количественного исследования этого материала с применением электронномикроскопической авторадиографии (см. табл. 8).
Итак, для С14 и всех других изотопов с более высокой максимальной энергией метод β-трековой авторадиографии, несмотря на некоторые недостатки, является наиболее пригодным. Соотношение между числом треков в эмульсии вблизи источника и количеством распадов, происшедших в источнике за время экспозиции, носит непосредственный и простой характер.
Абсолютные измерения радиоактивности Η3, I125 и других низкоэнергетических изотопов следует проводить с использованием эталонных источников известной активности, которые должны быть в максимальной степени подобны исследуемым источникам. Экспонирование источников обоих типов с тонким слоем эмульсии и последующее сравнение плотностей зерен в выбранных объемах эмульсии вблизи источников дают возможность определить концентрацию или общее количество радиоактивного изотопа в исследуемом источнике.
В случае применения электронного микроскопа, требующего использования тонкого слоя эмульсии, единственным удовлетворительным методом абсолютных измерений радиоактивности любого изотопа является сравнение плотностей зерен вблизи исследуемого и контрольного источников.
Тщательное соблюдение технических приемов с учетом многочисленных факторов, влияющих на точность абсолютных измерений, несомненно дает возможность измерить скорость распада в биологических источниках клеточных и даже субклеточных размеров.



 
« Автоматизированный мониторинг больных сахарным диабетом детей и подростков   Актуальные проблемы низкорослости у детей »