Начало >> Статьи >> Архивы >> Авторадиография

Планирование и осуществление авторадиографических исследований - Авторадиография

Оглавление
Авторадиография
Области применения авторадиографии
Радиоактивные изотопы
Авторадиография в сравнении с другими методами обнаружения ионизирующих излучений
Ядерные фотоэмульсии и фотографический процесс
Кристаллы бромистого серебра
Желатин
Скрытое изображение
Проявление скрытого изображения
Физическое проявление
Фиксирование эмульсии
Специальные методики
Цветные эмульсии
Воздействие ионизирующего излучения на ядерные эмульсии
Бета-частицы
Другие виды ионизирующего излучения
Разрешающая способность авторадиографии
Факторы, определяющие разрешающую способность зернистых авторадиограмм
Разрешение в электронномикроскопической авторадиографии
Разрешающая способность трековых авторадиограмм
Эффективность авторадиографии
Эффективность при электронномикроскопической авторадиографии
Эффективность трековой авторадиографии
Эффективность макроскопической авторадиографии
Соотношение между факторами, определяющими разрешение и эффективность
Фон авторадиограмм
Хемография
Облучение внешними источниками
Уничтожение фона
Измерение фона
Микроскопия и микрофотография авторадиограмм
Оптическая система для освещения в темном поле
Микрофотография зернистых авторадиограмм
Исследование в темном поле
Исследование и фотографирование трековых авторадиограмм
Относительные измерения радиоактивности
Перекрестные эффекты
Факторы связанные с эмульсией и влияющие на относительные измерения
Относительные измерения в трековой авторадиографии
Счет зерен и треков
Фотометрическая оценка плотности зерен
Выбор визуального или фотометрического метода счета зерен
Необходимость абсолютных измерений
Абсолютные измерения радиоактивности с помощью трековой авторадиографии
Планирование и осуществление авторадиографических исследований
Выбор эмульсии
Эксперименты с двумя изотопами
Освоение новой методики
Контрольные процедуры, необходимые для каждого эксперимента
Проектирование и оборудование темной комнаты
Гистологическая техника и авторадиография
Выбор способа гистологической фиксации
Методика приготовления гистологических срезов
Непроницаемые пленки
Приготовление авторадиограмм для микроскопии
Авторадиография растворимых радиоизотопов
Способы авторадиографии растворимого материала
Хемография и артефакты от давления
Количественные исследовани растворимых радиоактивных изотопов
Методика съемной эмульсии
Недостатки методики съемной эмульсии
Подробное описание методики  съемной эмульсии
Методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Факторы, влияющие на толщину эмульсионного слоя
Выбор подходящей толщины эмульсии
Оценка и описание методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Методика жидкой эмульсии для трековой авторадиографии
Авторадиография с электронной микроскопией
Ограничения современных методик
Детальное описание методик
Авторадиография макроскопических объектов
Авторадиография  в макроскопических образцах
Описание методик авторадиографии макроскопических объектов
Послесловие

Большинство авторадиографических исследований можно выполнить с помощью разных методик, каждая из которых обеспечивает получение ценных результатов. Вместе с тем нередко методику, идеальную для выполнения некоторых работ, применяют в других областях, для которых она совершенно не подходит.
В настоящей главе дается общий обзор методик, применяемых в настоящее время в авторадиографии, и характеристики задач, решаемых с их помощью. Это неизбежно будет связано с некоторым повторением материала, изложенного в других главах книги, но для биолога, желающего выбрать подходящую методику проведения эксперимента, не читая предварительно всей книги, такая компоновка наиболее удобна.
Методику, подлежащую использованию в конкретном эксперименте, выбирают с учетом большого числа факторов, многие из которых встречаются не постоянно. Здесь попытаемся описать основные области применения и ограничения более общих методик авторадиографии, с тем чтобы при их выборе учитывался весь комплекс подлежащих решению задач.
Авторадиографические методы можно классифицировать по способам исследования готовой авторадиограммы. Макроскопическое исследование охватывает авторадиографию хроматограмм и больших объектов, таких, как череп или даже продольный срез через все тело экспериментального животного. Оно может дать быструю, грубую количественную оценку распределения радиоактивности между относительно большими участками. Авторадиограммы, предназначенные для исследования в световом микроскопе, обычно представляют срезы или мазки биологического материала. Необходимость коррелировать распределение радиоактивности с характером видимых микроскопических структур обусловливает совершенно иные требования к применяемым в этом случае методикам. Электронномикроскопическая авторадиография предъявляет ряд особых требований — в этом случае методики направлены на получение максимально возможного разрешения.
Информация, которую предполагают получить с помощью эксперимента, также сильно влияет на выбор методики. В простейшем случае авторадиографию можно использовать для демонстрации распределения радиоактивности и установления
самого факта присутствия радиоизотопа в тех или иных структурах; применяемые при этом методики часто недостаточны для точных количественных оценок. При выполнении относительных количественных исследований радиоактивность одних клеток или структур сравнивают с радиоактивностью других или же с радиоактивностью сходных клеток после разных экспериментальных воздействий. Следующий этап усложнения методики связан с необходимостью измерить радиоактивность структур в абсолютных единицах.
Наконец, имеется группа дополнительных факторов, влияющих на выбор методики. Энергия излучения и период полураспада изотопа; характеристики меченого соединения, которое может быть нерастворимым или растворяться в каком- либо одном или во всех растворителях, используемых при обычной методике приготовления авторадиограммы; физическая природа образца, который может быть мелкодисперсной суспензией, волокнами, плотной тканью и т. д.; тип эмульсии, условия в фотолаборатории, продолжительность экспозиции — все это может влиять на окончательный выбор методики.

ВЫБОР ПОДХОДЯЩЕЙ МЕТОДИКИ

Авторадиография для макроскопического исследования

Применение этой методики авторадиографии связано обычно с простым изучением локализации радиоактивности, при этом лишь изредка требуются количественные показатели. Например, при авторадиографии хроматограмм преследуется цель установить, какие пятна являются радиоактивными, какие нет. Большие различия в количестве изотопа в пятнах можно оценить на глаз, но для более точного измерения лучше использовать соответствующие детекторы, например счетчик Гейгера или сцинтилляционный счетчик. Те же соображения приложимы к изучению половины среза целых животных при определении радиоактивности разных органов и тканей: авторадиография обеспечивает идентификацию большого числа возможных мест локализации радиоактивности, но для точного измерения активности каждой отдельной ткани более подходит счетчик Гейгера или сцинтилляционный счетчик.
В таких работах требуется безошибочное определение локализации радиоактивности, высокая разрешающая способность не столь важна. Основное требование — получение высокой плотности почернения в активных участках в течение возможно более короткого времени экспозиции в сочетании с низким и равномерным уровнем фона. Этим условиям лучше всего удовлетворяет рентгеновская пленка, которая имеет высокую чувствительность, большой размер зерен, обеспечивает хорошую воспроизводимость и проста в обращении.

Одним из требований рассматриваемой методики является приготовление ровной поверхности источника. При неровной поверхности источника возникают определенные трудности, которые можно преодолеть, погружая образец в жидкую эмульсию или нанося ее с помощью пульверизатора. В этом случае предпочтительно использование рентгеновской эмульсии, которая в связи с крупным размером зерен обеспечивает получение более выраженного почернения, и притом намного быстрее, чем мелкозернистые ядерные эмульсии.
Использование эмульсии Ilford ХК для покрытия больших образцов описано в гл. 18, где более детально рассматривается авторадиография макроскопических объектов.
При необходимости можно провести денситометрию проявленных рентгеновских пленок, но, как отмечено выше, при больших образцах и обычно используемой достаточно высокой активности радиометрия препарата, как правило, может дать более точные количественные данные, чем изучение авторадиограммы.

Авторадиография для световой микроскопии

Когда авторадиограммы предназначаются для исследования в световом микроскопе, требуются более высокая разрешающая способность и возможность непосредственного изучения подлежащего среза. Для подобного рода работ очевидно преимущество использования ядерных эмульсий с более мелкими зернами по сравнению с рентгеновской эмульсией. Соответственно двум типам препаратов, предназначенных для световой микроскопии, — зернистым и трековым авторадиограммам — существуют две основные группы методик их приготовления. В первом случае образец покрывают относительно тонким слоем эмульсии, в которой β-частицы при прохождении оставляют след в виде отдельных зерен серебра, и наличие радиоактивности распознается по увеличению плотности зерен над уровнем фона. При трековой авторадиографии используется более толстый слой эмульсии, и прохождение частиц через нее регистрируется по характерному расположению зерен серебра в виде фрагментов треков. Получать и исследовать трековые авторадиограммы более сложно.
Для изучения распределения радиоактивности в образце предпочтительнее использовать методики авторадиографии с оценкой плотности зерен. Эти методики проще и в большинстве случаев дают более высокое разрешение, а просмотр и фотографирование срезов намного легче, если они покрыты не слишком толстым слоем эмульсии.
Иногда при сравнении уровня радиоактивности разных участков трековые авторадиограммы более приемлемы, чем зернистые, но последние всегда могут найти применение. Зернистые авторадиограммы просты в приготовлении и дают хорошее разрешение, особенно при использовании изотопов с низкой максимальной энергией излучения. Измерение зернистых авторадиограмм можно провести быстро как путем подсчета зерен, так и с помощью фотометрических приспособлений, описанных в гл. 9. Приготовление трековых авторадиограмм более трудоемко, а подсчет треков требует большего терпения и квалификации, и его нельзя полностью автоматизировать. Трековые авторадиограммы можно приготовить только в случае достаточно высокой энергии излучения изотопа, например, С14 (Емакс=155 кэв), S35 (Емакс=150 кэв). В большинстве случаев основой для относительного измерения радиоактивности служит плотность зерен. В некоторых случаях, когда источник, например тритий, имеет большое самопоглощение, сравнить плотность зерен над двумя типами источников трудно; и тогда предпочтительно использовать другой изотоп с небольшим самопоглощением, такой, как Р32, и зарегистрировать β-излучение в толстом слое эмульсии.
Реальные преимущества трековой авторадиографии становятся очевидными при измерении радиоактивности в абсолютных единицах. Соответствие одного трека прохождению одной β-частицы делает относительно легким определение числа распадов, имевших место в источнике за время экспозиции. В противоположность этому абсолютное определение радиоактивности при исследовании зернистых авторадиограмм крайне затруднительно. Далее, трековая авторадиография необходима, если абсолютное измерение должно проводиться с изотопами примерно той же энергии, что у С14 или выше. Это очень точный и изящный метод, однако применение его, вероятно, останется довольно ограниченным.
В большинстве случаев для световой микроскопии подходит авторадиография с оценкой плотности зерен, разрешающая способность которой колеблется от 1 мкм для трития до 10 мкм для изотопов с большей энергией и удовлетворяет требованиям биологического исследования. Она позволяет наблюдать большое количество гистологических деталей в подлежащем срезе, а сравнение плотности зерен над различными структурами — это ценный способ измерения относительного содержания радиоизотопов.
Существуют две основные методики авторадиографии с оценкой плотности зерен: с применением съемных и жидких эмульсий. В большинстве экспериментов может быть использована любая из них, и на выбор часто влияют второстепенные факторы, такие, как наличие эмульсии или предыдущее знакомство с той или другой методикой.  Съемные эмульсии сочетают в себе достаточную чувствительность и разрешающую способность с преимуществами получения воспроизводимых результатов, что обусловлено производственным изготовлением эмульсионного слоя. Их можно использовать для изучения локализации радиоактивности и относительных количественных измерении любого изотопа, излучающего а- и β-частицы, причем разработаны методики использования их с растворимыми радиоизотопами. Они имеют длительный срок сохранности, иногда больше 6 месяцев. Один вид пленки, Kodak AR-10, и одна основная методика отвечают требованиям абсолютного большинства авторадиографических исследований.
Однако почти все, что можно сделать со съемными эмульсиями, можно также выполнить, и во многих случаях даже лучше, с помощью жидких эмульсий. Имеется много жидких эмульсий с широким диапазоном чувствительности и размером зерен, а простые модификации в методике нанесения эмульсии могут дать контролируемую толщину эмульсионного слоя, начиная от монослоя кристаллов галоидного серебра. При небольшом навыке можно так подобрать чувствительность, размер зерен и толщину слоя эмульсии, чтобы получить оптимальные результаты для данного эксперимента. В детальных цитологических исследованиях, когда необходимо изучить срез при очень большом увеличении, можно использовать тонкий слой мелкозернистой эмульсии. Для наблюдения при небольшом увеличении больше подходят крупнозернистые эмульсии. Подобным образом можно подобрать и чувствительность эмульсии к исследуемому изотопу. Изотоп Р32 (Емакс=1,4 Мэв) требует наивысшей возможной чувствительности, чтобы с достаточной эффективностью зарегистрировать начальную часть треков излучаемых частиц. Тритий (Емакс= 18 кэв) можно выявить с помощью эмульсии более низкой чувствительности и соответственно при более низком уровне фона.
Таким образом, при нанесении жидкой эмульсии можно более точно приспособить авторадиографию к требованиям эксперимента. Но и эта методика имеет свои недостатки, что показано ниже при ее сравнении с методикой съемной эмульсии при разных типах авторадиографических экспериментов.

При изучении локализации радиоактивности в тканях жидкие эмульсии могут дать лучшие результаты. Подбирая размер зерен и чувствительность эмульсии в соответствии с потребностью эксперимента и используя более тонкие слои эмульсии, чем при методе съемной эмульсии, можно, как правило, получить более высокое разрешение без какого-либо уменьшения эффективности. Технически процесс нанесения жидкой эмульсии несложен и не требует много времени, а адгезия эмульсии с образцом лучше. Кроме того, в этом случае отсутствует слой желатина, который имеется на съемной эмульсии, что упрощает окраску среза, позволяет использовать для исследования препарата освещение в темном поле и намного упрощает микрофотосъемку.

Что касается относительных количественных измерений, то до сих пор не решена проблема получения однородного по толщине эмульсионного слоя. Были испытаны многие модификации простого процесса погружения стекол в жидкую эмульсию, но нет надежного способа получения слоя постоянной и однородной толщины на серии стекол, особенно с гистологическими срезами, которые обычно имеют очень неровную верхнюю поверхность. В этих условиях колебания толщины эмульсии на разных стеклах приведут к ошибкам при сравнении результатов подсчета зерен, что совершенно недопустимо. В противоположность этому толщина съемной эмульсии намного более равномерна даже над неровной поверхностью среза ткани, поэтому колебания плотности зерен над срезом не усугубляются за счет флюктуации толщины эмульсин.
Важным исключением в отношении возможности количественной оценки при использовании жидкой эмульсии являются изотопы с небольшой максимальной энергией излучения, такие, как Н3 или I125. Маловероятно, чтобы частицы этих двух изотопов имели длину пробега в эмульсии более 2 мкм. Относительно просто приготовить эмульсионный слой толщиной 3— 4 мкм. Какие-либо вариации толщины такого слоя не будут отражаться на эффективности регистрации радиоактивности — процесса, происходящего только в пределах нижних 2 мкм эмульсии. В этих условиях колебания толщины эмульсии вызовут изменения только в плотности зерен фона, а поскольку их количество должно быть небольшим, то резонно использовать такой способ приготовления препаратов для относительной количественной оценки. Леблон и соавторы [1] на основании исследования срезов, меченных I131, С14 и Н3, представили интересные данные, иллюстрирующие это положение. Плотность зерен для первых двух изотопов при использовании жидкой эмульсии колебалась в разных участках среза в пределах ±10%. Для трития результаты были удивительно постоянными, несмотря на заметные колебания толщины эмульсии.
Таким образом, жидкие эмульсии рационально использовать для получения зернистых автодиограмм с Н3 и I125, но не с изотопами более высоких энергий излучения. С другой стороны, съемные эмульсии могут дать хорошие результаты с любым изотопом.
Для абсолютного измерения радиоактивности часто необходима трековая авторадиография. Однако если имеется подходящий стандартный образцовый источник, задача упрощается и сводится к сравнению плотности зерен над исследуемым и стандартным источниками, и в этом случае полностью приложимы выводы предыдущего абзаца.
Каково же окончательное заключение? Когда необходимо предпочесть съемную, а когда — жидкую эмульсию?

При небольшом объеме исследований и однообразном материале и если, как это обычно бывает, не требуется абсолютное измерение активности, по-видимому, лучшей является методика съемной эмульсии. Как уже отмечалось, один вид съемной эмульсии Kodak AR-10 и одна основная методика могут быть приспособлены практически к любому эксперименту. Во многих лабораториях потребность в авторадиографии возникает время от времени для получения дополнительной информации. При этих условиях маловероятно, что будет накоплен достаточный опыт для полной реализации потенциальных возможностей жидких эмульсий.
Однако если количество авторадиограмм оправдывает затраты времени на выработку подходящих методик для ряда эмульсий и затраты на регулярную доставку материалов, можно ожидать, что более хорошие результаты будут получены с жидкими эмульсиями. Зернистые авторадиограммы следует применять для локализации радиоактивности изотопов любой энергии и для относительных количественных измерений с Н3 и I125. Трековую авторадиографию можно использовать для относительных и абсолютных измерений количества изотопов более высокой энергии. Опыт работы с жидкими эмульсиями обеспечит также прочную базу для освоения электронномикроскопической авторадиографии.
Конечно, можно использовать жидкую эмульсию для локализации и измерения относительного количества Н3 и I125, а съемную эмульсию для относительного измерения изотопов с большой энергией. Однако это — не общепринятая система, поскольку большинство исследователей предпочитают уделять больше времени и усилий основным экспериментам за счет сокращения времени на приобретение технических навыков.

Авторадиография для электронной микроскопии

Использование авторадиографии на электронномикроскопическом уровне определяется, во-первых, необходимостью коррелировать распределение радиоактивности со структурами, которые могут быть видны только в электронном микроскопе, и, во-вторых, связанным с этим желанием получить возможно более высокое разрешение.
Практически приемлемые методики базируются на двух группах эмульсий. Из первой группы для работ на электронномикроскопическом уровне наиболее часто используют эмульсию Ilford L4 с кристаллами диаметром около 1400 А. Проявленные зерна этой эмульсии без труда видны в световом микроскопе, что облегчает контроль за приготовлением подходящего материала. Однако разрешающая способность ограничена диаметром кристаллов, и маловероятно, что она будет лучше чем 1500 А, хотя более высокое разрешение может быть получено при оптимальных условиях, при исследовании крайне тонких источников, меченных Н3 или I125.
Вторую группу образуют две мелкозернистые эмульсии. Это Gevaert NUC 307 с кристаллами диаметром 700А и Eastman Kodak ΝΤΕ с кристаллами диаметром 500 А. При использовании этих эмульсий теоретически можно получить- разрешение в зависимости от природы и толщины источника в пределах 500—1000 А 1.
Важно представить, какие технические возможности открывают эти эмульсии. При диаметре кристаллов около 500— 700 А чувствительность, необходимая для регистрации прохождения β-частиц, приближается к теоретическому максимуму, а соответственно увеличивается и возможность спонтанного образования зерен фона. В то же время проблема регрессии скрытого изображения намного сложнее, чем при использовании эмульсий для световой микроскопии, так как ее скорость зависит от размера кристаллов. Вследствие этого нет оснований ожидать от этих двух эмульсий столь же высокой чувствительности и воспроизводимости, как для эмульсии Ilford L 4.
Условия разрешения зависят от двух переменных факторов — толщины образца и толщины эмульсионного слоя. Наилучшее разрешение достигается при очень тонком образце и монослое мельчайших кристаллов галоидного серебра. Однако при этом сокращается число восстановленных зерен, ибо с уменьшением толщины образца снижается количество радиоактивных распадов на единицу площади эмульсии, а вследствие малого диаметра кристаллов возрастает вероятность прохождения β-частиц через тонкий слой эмульсии без образования скрытого изображения.
Попытки достичь очень высокого разрешения могут окончиться неудачно, так как невозможно получить достаточно большое количество восстановленных зерен серебра без увеличения времени экспозиции до многих месяцев. Это, в свою очередь, может оказаться неприемлемым, если в сколько- нибудь значительной степени имеет место образование фона или регрессия скрытого изображения.


1 Из эмульсий, изготовляемых в СССР, для авторадиографии на электронномикроскопическом уровне можно использовать эмульсии ПР-2 и П-9р, разработанные в Радиевом институте АН СССР (г. Ленинград). Диаметр кристаллов галоидного серебра составляет в этих эмульсиях 600 и 1200 А, диаметр проявленных зерен 3000 и 4000 А соответственно. Срок хранения более 4 месяцев. Эти эмульсии успешно используют при авторадиографии образцов, меченных Н3 и С14; они дают результаты, сравнимые с получаемыми при использовании эмульсий Ilford L4 и Gevaert NUC 307. Фотографическая обработка этих эмульсий подробно описана в статье Н. А. Перфилова с соавт.— Прим, перев.

Важно с самого начала подчеркнуть эти трудности достижения высокого разрешения в авторадиографии на электронномикроскопическом уровне. Легко достичь разрешения в 1500 А для трития с применением эмульсии Ilford L4 при условии, что внутри источника будет создана концентрация радиоактивного изотопа, достаточная для получения треков, обнаруживаемых при световой микроскопии. Эмульсия имеет длительный срок сохранности, проста в обращении, ее можно экспонировать в течение длительного промежутка времени, прежде чем высокий фон или регрессия скрытого изображения снизят ее эффективность. Она регистрирует β-частицы всех энергий, так что электронномикроскопические авторадиограммы, хотя и с худшим разрешением, могут быть получены и с С14 и даже с Р32.
Применяя эмульсии Gevaert NUC 307 или Eastman Kodak ΝΤΕ, можно достичь разрешения ниже 1000 А для Н3 и I125. Однако чувствительность этих эмульсий небольшая, гак что изотопы более высоких энергий будут регистрироваться с крайне низкой эффективностью. Чувствительность может колебаться от одной партии эмульсии к другой. Экспозиция может быть ограничена возрастанием фона, который у этих эмульсий намного выше, чем у эмульсии Ilford L 4.
В настоящее время кажется резонным использовать эмульсию Ilford L4 как основу для большинства авторадиографических исследований на электронномикроскопическом уровне. Эмульсии Gevaert NUC 307 или Eastman Kodak ΝΤΕ следует оставить для тех случаев, когда необходимо получить наилучшее разрешение; предварительно необходимо посредством авторадиографии с эмульсией Ilford L4 удостовериться, что уровень радиоактивности источника обеспечит получение достаточного числа зерен серебра при том времени экспозиции, которое возможно для этих эмульсий.
Было предложено много методик для нанесения эмульсии на образец в виде монослоя кристаллов галоидного серебра. Методика, которая будет описана в гл. 17, основана на простом погружении образца в. жидкую эмульсию. Как было показано в работах [2, 3], такая методика дает воспроизводимый монослой; при условии выполнения соответствующих контрольных мероприятий она технически проще и требует меньше времени, чем другие методики, которые были предложены.



 
« Автоматизированный мониторинг больных сахарным диабетом детей и подростков   Актуальные проблемы низкорослости у детей »