Начало >> Статьи >> Архивы >> Авторадиография

Освоение новой методики - Авторадиография

Оглавление
Авторадиография
Области применения авторадиографии
Радиоактивные изотопы
Авторадиография в сравнении с другими методами обнаружения ионизирующих излучений
Ядерные фотоэмульсии и фотографический процесс
Кристаллы бромистого серебра
Желатин
Скрытое изображение
Проявление скрытого изображения
Физическое проявление
Фиксирование эмульсии
Специальные методики
Цветные эмульсии
Воздействие ионизирующего излучения на ядерные эмульсии
Бета-частицы
Другие виды ионизирующего излучения
Разрешающая способность авторадиографии
Факторы, определяющие разрешающую способность зернистых авторадиограмм
Разрешение в электронномикроскопической авторадиографии
Разрешающая способность трековых авторадиограмм
Эффективность авторадиографии
Эффективность при электронномикроскопической авторадиографии
Эффективность трековой авторадиографии
Эффективность макроскопической авторадиографии
Соотношение между факторами, определяющими разрешение и эффективность
Фон авторадиограмм
Хемография
Облучение внешними источниками
Уничтожение фона
Измерение фона
Микроскопия и микрофотография авторадиограмм
Оптическая система для освещения в темном поле
Микрофотография зернистых авторадиограмм
Исследование в темном поле
Исследование и фотографирование трековых авторадиограмм
Относительные измерения радиоактивности
Перекрестные эффекты
Факторы связанные с эмульсией и влияющие на относительные измерения
Относительные измерения в трековой авторадиографии
Счет зерен и треков
Фотометрическая оценка плотности зерен
Выбор визуального или фотометрического метода счета зерен
Необходимость абсолютных измерений
Абсолютные измерения радиоактивности с помощью трековой авторадиографии
Планирование и осуществление авторадиографических исследований
Выбор эмульсии
Эксперименты с двумя изотопами
Освоение новой методики
Контрольные процедуры, необходимые для каждого эксперимента
Проектирование и оборудование темной комнаты
Гистологическая техника и авторадиография
Выбор способа гистологической фиксации
Методика приготовления гистологических срезов
Непроницаемые пленки
Приготовление авторадиограмм для микроскопии
Авторадиография растворимых радиоизотопов
Способы авторадиографии растворимого материала
Хемография и артефакты от давления
Количественные исследовани растворимых радиоактивных изотопов
Методика съемной эмульсии
Недостатки методики съемной эмульсии
Подробное описание методики  съемной эмульсии
Методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Факторы, влияющие на толщину эмульсионного слоя
Выбор подходящей толщины эмульсии
Оценка и описание методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Методика жидкой эмульсии для трековой авторадиографии
Авторадиография с электронной микроскопией
Ограничения современных методик
Детальное описание методик
Авторадиография макроскопических объектов
Авторадиография  в макроскопических образцах
Описание методик авторадиографии макроскопических объектов
Послесловие

Прежде чем приступить к биологическому исследованию с новой авторадиографической методикой, требуется осуществить несколько предварительных экспериментов. В некоторых случаях можно получить требуемую информацию из литературы или в других лабораториях, но, как правило, необходимо провести эти предварительные эксперименты самому. Требуется изучить два вопроса: возможность потери или перераспределения радиоактивного материала и оптимальные условия проявления.                                                                               

Потеря или перераспределение радиоактивного материала

Для некоторых экспериментов, например при изучении инкорпорации меченого тимидина в ДНК, в литературе имеется достаточно данных, чтобы предположить, что при приготовлении ткани для авторадиографии не будет сколь-либо значительной потери метки. Во многих других случаях, однако, подобного рода сведения получить нельзя. Гистологические и авторадиографические методики, которые следует использовать при обработке материала с содержимым радиоизотопов, растворимых в воде или органических растворителях, описаны в гл. 13. Они весьма отличаются от общепринятых методик, например: заключения в парафин и нанесения расплавленной эмульсии.
Обычные гистологические и авторадиографические методики дают готовый препарат, который при исследовании под микроскопом может и должен иметь очень высокие качества. Методика сухой авторадиографии неизменно ухудшает качество биологических препаратов. Поэтому предпочтительнее оставить эту методику для экспериментов, когда она действительно необходима.
Чтобы установить, вымывается ли некоторое количество радиоизотопа из ткани, следует взять меченый материал, который будет использован в последующем эксперименте, и провести его через все этапы фиксации и заключения в парафин. Растворы, через которые проводился материал, можно исследовать с помощью счетчика Гейгера или сцинтилляционного счетчика, но, как отмечено ниже (стр. 210), это относительно малочувствительный способ и он не дает возможности обнаружить перераспределение радиоактивной метки.
В идеальном контрольном эксперименте следует взять два идентичных фрагмента биологического материала и обработать один из них обычными методиками нарезки и авторадиографии, а другой так, как если бы он содержал растворимый материал, согласно методикам, описанным в гл. 13. Сравнение авторадиограмм, полученных с помощью этих двух способов обработки, должно дать совершенно ясное представление о том, имеет ли место потеря или перераспределение радиоактивного материала при первом способе обработки. Если имеется некоторая потеря радиоактивности, можно несколько модифицировать гистологическую обработку, исключив тот из растворителей, который в основном обусловливает вымывание изотопа. Однако во многих случаях будет необходимо приготовлять материал путем нарезки на криостате или воспользоваться методикой сухой авторадиографии.

Проявление

Одним из общих для всех способов авторадиографии этапов является проявление экспонированной эмульсии, при котором частицы металлического серебра, имеющиеся в каждой точке скрытого изображения, увеличиваются до размеров порога видимости. Этот порог видимости зависит от методики исследования готовых авторадиограмм. Большое или малое увеличение освещения в светлом или темном поле, интенсивность и цвет окраски, которая служит фоном для зерен серебра,— все это влияет на величину, до которой зерна должны быть проявлены, чтобы быть зарегистрированными. При постоянных условиях проявления количество серебра в центрах начального скрытого изображения само по себе определяет время, необходимое для того, чтобы зерна достигли порога видимости.
Поэтому довольно наивно предполагать, что условия проявления данной эмульсии могут быть строго и однозначно детерминированы. Идеальные условия должны определяться особенностями эксперимента. Простейший путь — приготовить серию предметных стекол с тем меченым биологическим материалом, который будет исследоваться в эксперименте, покрыть их эмульсией, экспонировать и затем разделить на шесть групп, каждая из которых должна содержать по крайней мере три препарата. Эти препараты следует затем проявить в проявителе, который предполагается использовать в дальнейшем, поддерживая постоянными степень разбавления и температуру проявителя, а также количество покачиваний, но варьируя время проявления. Если, например, рекомендуется проявление в течение 4 мин, то следует проявлять в течение 1, 2, 4, 6, 8 и 10 мин. После фиксации, окрашивания и монтирования образца иод микроскопом необходимо просмотреть авторадиограммы в условиях, выбранных для исследования экспериментального материала, и определить наиболее подходящее время проявления. Эту серию авторадиограмм следует сохранить; наилучшее время проявления для последующих экспериментов, которые могут требовать других условий микроскопии, можно определить при просмотре препаратов из этой серии при новых условиях. Подобная серия представлена на рис. 4.
Такое определение времени проявления — существенный подготовительный этап для получения надежных результатов авторадиографии. Если окажется, что наилучшее время проявления слишком короткое, например 1 или 2 мин, можно разбавить проявитель или проявлять при несколько более низкой температуре, так, чтобы неизбежные при работе в темной комнате случайные небольшие отклонения от точного времени проявления не оказывали значительного влияния на качество препарата. Подобным образом нецелесообразно проявлять дольше 10 мин препараты с тонкими слоями эмульсии, если процесс можно без ущерба ускорить, используя более концентрированный проявитель или повышая его температуру. Абсолютно воспроизводимых условий проявления достичь трудно. Поэтому будет ошибкой выбрать время проявления, которое лишь несколько короче времени проявления, дающего неприемлемо высокий фон, так как даже небольшого изменения числа покачиваний стекла в проявителе может быть достаточно, чтобы привести к появлению такого фона в отдельных партиях срезов. Поэтому следует выбирать такое время проявления, при котором допускаются некоторые отклонения от оптимального без особых последствий.
Время проявления требуется определять для каждой эмульсии. Например, для эмульсий Ilford G5 и К2 необходимы совершенно разные условия проявления.
Можно, хотя в этом и нет особой необходимости, выразить результаты такого определения времени проявления количественно (см. рис. 3), откладывая по оси ординат плотность зерен вблизи меченого материала или в контрольных участках, а по оси абсцисс — время проявления. В большинстве случаев плотность зерен в области расположения метки возрастает до определенного значения и выходит на плато. Плотность зерен фона вначале остается на довольно низком уровне и затем быстро возрастает с увеличением времени проявления. Выбор наилучшего времени проявления по такому графику проводится более точно, поскольку относительно легко выбрать точку на плато, далеко не доходя до участка быстрого увеличения плотности зерен.



 
« Автоматизированный мониторинг больных сахарным диабетом детей и подростков   Актуальные проблемы низкорослости у детей »