Начало >> Статьи >> Архивы >> Авторадиография

Гистологическая техника и авторадиография - Авторадиография

Оглавление
Авторадиография
Области применения авторадиографии
Радиоактивные изотопы
Авторадиография в сравнении с другими методами обнаружения ионизирующих излучений
Ядерные фотоэмульсии и фотографический процесс
Кристаллы бромистого серебра
Желатин
Скрытое изображение
Проявление скрытого изображения
Физическое проявление
Фиксирование эмульсии
Специальные методики
Цветные эмульсии
Воздействие ионизирующего излучения на ядерные эмульсии
Бета-частицы
Другие виды ионизирующего излучения
Разрешающая способность авторадиографии
Факторы, определяющие разрешающую способность зернистых авторадиограмм
Разрешение в электронномикроскопической авторадиографии
Разрешающая способность трековых авторадиограмм
Эффективность авторадиографии
Эффективность при электронномикроскопической авторадиографии
Эффективность трековой авторадиографии
Эффективность макроскопической авторадиографии
Соотношение между факторами, определяющими разрешение и эффективность
Фон авторадиограмм
Хемография
Облучение внешними источниками
Уничтожение фона
Измерение фона
Микроскопия и микрофотография авторадиограмм
Оптическая система для освещения в темном поле
Микрофотография зернистых авторадиограмм
Исследование в темном поле
Исследование и фотографирование трековых авторадиограмм
Относительные измерения радиоактивности
Перекрестные эффекты
Факторы связанные с эмульсией и влияющие на относительные измерения
Относительные измерения в трековой авторадиографии
Счет зерен и треков
Фотометрическая оценка плотности зерен
Выбор визуального или фотометрического метода счета зерен
Необходимость абсолютных измерений
Абсолютные измерения радиоактивности с помощью трековой авторадиографии
Планирование и осуществление авторадиографических исследований
Выбор эмульсии
Эксперименты с двумя изотопами
Освоение новой методики
Контрольные процедуры, необходимые для каждого эксперимента
Проектирование и оборудование темной комнаты
Гистологическая техника и авторадиография
Выбор способа гистологической фиксации
Методика приготовления гистологических срезов
Непроницаемые пленки
Приготовление авторадиограмм для микроскопии
Авторадиография растворимых радиоизотопов
Способы авторадиографии растворимого материала
Хемография и артефакты от давления
Количественные исследовани растворимых радиоактивных изотопов
Методика съемной эмульсии
Недостатки методики съемной эмульсии
Подробное описание методики  съемной эмульсии
Методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Факторы, влияющие на толщину эмульсионного слоя
Выбор подходящей толщины эмульсии
Оценка и описание методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Методика жидкой эмульсии для трековой авторадиографии
Авторадиография с электронной микроскопией
Ограничения современных методик
Детальное описание методик
Авторадиография макроскопических объектов
Авторадиография  в макроскопических образцах
Описание методик авторадиографии макроскопических объектов
Послесловие

Существенное преимущество авторадиографии в изучении систем живого организма — возможность корреляции локализации радиоактивности с микроскопической структурой объекта. Четкое распознавание структур под эмульсией и возможность исследовать их гистохимически столь же важны, как и наличие видимых зерен серебра. К сожалению, на ранних этапах развития авторадиографии неудовлетворительное качество гистологического препарата рассматривали как неизбежную плату за возможность выявления локализации радиоактивности. Вследствие этого, а также из-за трудности получения приемлемых для публикации микрофотографий многие биологи до сих пор убеждены, что гистологические структуры при исследовании авторадиограмм видны нечетко, к тому же их можно окрашивать лишь с помощью ограниченного количества методик.
При некоторых условиях сочетать требования авторадиографии и гистологии без определенных компромиссов трудно. Тем не менее в авторадиографии можно успешно применять абсолютное большинство специфических методик окраски, в том числе и гистохимические методики на энзимы, хотя многие из них и не были испытаны. Как видно из гл. 7, во многих случаях можно получить авторадиограммы, в которых эмульсия и ее зерна почти невидимы при общепринятом исследовании препаратов в проходящем свете. Ситуации, когда неудовлетворительное качество гистологического препарата является платой за авторадиографию, встречаются весьма редко.
Поиски методик, дающих высококачественные гистологические препараты, обусловлены не только требованиями внешнего вида. Достаточно одного примера. Барнард и соавторы [1—3] в серии статей утверждают, что демонстрируют авторадиограммы моторных бляшек поперечнополосатых мышц, меченных in vivo ферментным ингибитором динзопропилфторфосфатом. Исследователи работали почти исключительно с неокрашенным материалом, который изучали при помощи фазовоконтрастной микроскопии.
Последующие исследования [4] показали, что эти работы были основаны на ошибочной идентификации: участки высокой плотности зерен серебра, которые они исследовали, располагались над тучными клетками, а не над моторными бляшками. Это стало совершенно очевидно после применения гистохимических методик определения на авторадиограммах локализации ацетилхолинэстеразы, неспецифических эстераз и метахромазии (рис. 44 и 45).

Рис. 44. Микрофотография авторадиограммы моторной бляшки диафрагмы мыши после воздействия in vivo ДФФ (X800).
Срез толщиной 5 мкм приготовлен с помощью криостата и покрыт тонким слоем эмульсии Ilford К2. После экспонирования и проявления ацетилхолинэстеразу реактивировали, удалив ДФФ с помощью обработки среза пиридин-2-альдоксином, после чего провели гистохимическую реакцию на ацетилхолинэстеразу.

Для точной корреляции локализации радиоактивности со структурами среза необходимо достигнуть наилучших условий для наблюдения. Любая незначительная погрешность таит в себе возможность ошибки при интерпретации результатов.
Выбор подходящей гистологической методики определяют многие факторы. Не все они будут рассмотрены в настоящей главе. Методики, которые следует использовать, когда радиоактивный материал может изменить локализацию или полностью раствориться при обычном приготовлении срезов для авторадиографии, изложены в следующей главе. Некоторые приемы, с помощью которых можно изменить сами авторадиограммы с целью достижения наилучших условий для исследования среза, уже обсуждались в гл. 7.
В этой главе будут изложены основные принципы, которые необходимо принимать во внимание при выборе подходящей гистологической методики.


Рис. 45. Микрофотография криостатного среза диафрагмы мыши после воздействия in vivo ДФФ (Х1000).
Авторадиограмма приготовлена с помощью тонкого слоя эмульсии Ilford К2. После экспонирования и проявления срез окрасили толуидиновым синим. Участок высокой плотности зерен соответствует локализации тучных клеток, расположенных между неокрашенными мышечными волокнами и дающих характерную реакцию метахромазин.

ЧИСТОТА ПРИ РАБОТЕ

Прежде чем детально обсуждать отдельные этапы приготовления объекта, следует отметить, что авторадиография требует на всех стадиях большей чистоты и тщательности, чем приготовление обычных гистологических препаратов. Полезно взять несколько окрашенных срезов, приготовленных принятым в лаборатории способом, и исследовать их в проходящем и падающем свете с целью обнаружения «зерен серебра» или других черных включений. Часто многочисленные черные пятнышки, приблизительно соответствующие по размеру проявленным зернам серебра, видны в проходящем свете, и количество их определенно увеличивается в темном поле. Эти частицы, определяющиеся в отсутствие эмульсионного слоя, можно полностью игнорировать при обычной микроскопии, но они сильно мешают при исследовании авторадиограмм.
Полезно специально тренировать персонал, который будет готовить материал для авторадиографии, и поручать приготовление растворов и стекол только специально выделенным для этой цели сотрудникам. Таким путем можно достигнуть воспроизводимой чистоты. Все сосуды с растворами должны быть плотно закрыты, чтобы предохранить от запыления их поверхности и изменения концентрации вследствие испарения или поглощения воды. Кроме того, их необходимо часто обновлять. Никогда нельзя высушивать влажные срезы в условиях, при которых находящиеся в употреблении в обычной лаборатории химикаты или пыль могут осесть на них; срезы необходимо высушивать в атмосфере, максимально лишенной пыли.
Стеклянную посуду, используемую для работы с эмульсией, необходимо тщательно очищать. Обычно трудно очищать сосуды, которые содержали жидкую эмульсию. После мытья в горячей воде для удаления, насколько возможно, эмульсии их необходимо выдерживать несколько часов в 1 н. растворе гидроокиси натрия. После мытья в горячей проточной воде их следует погрузить в чистую кислоту, отмыть холодной проточной водой в течение ночи и окончательно промыть дистиллированной водой. Даже при такой обработке посуда, часто используемая для эмульсий, приобретает характерный вид вследствие отложения серебра на ее поверхности.
Предметные стекла требуют специальной очистки. Стекла необходимо помещать на ночь в смесь, приготовленную растворением 100 г бихромата калия примерно в 850 мл воды с добавлением 100 мл концентрированной серной кислоты. Кислоту следует добавлять очень медленно при постоянном помешивании. После вымачивания в этом растворе стекла промывают в течение нескольких часов в холодной проточной водопроводной воде и в двух порциях дистиллированной воды по 30 мин в каждой, затем погружают в следующий раствор комнатной температуры:
Желатин........................................................................ 5,0 г
Хромовокислые квасцы ...                                      0,5 г
Вода ............................................................................. до 1000 мл
и высушивают в атмосфере, лишенной пыли.
Раствор желатина непосредственно перед употреблением необходимо профильтровать. Не следует хранить его более 48 ч даже в холодильнике. Обычно удобно готовить сразу большое количество стекол и сохранять их в контейнере, закрытом пластикатом или стеклом. Такие предметные стекла достаточно чисты, а слой желатина обеспечивает хорошую адгезию среза к эмульсии. При работе с клеточной суспензией, если на стекла не нанесен слой желатина, могут возникнуть значительные трудности в приготовлении хороших мазков; для предотвращения смещения или потери эмульсии необходимы специальные меры.
При получении гистоавторадиограмм необходимо максимально соблюдать чистоту, поскольку качество их прямо пропорционально тщательности приготовления материала на каждом этапе.



 
« Автоматизированный мониторинг больных сахарным диабетом детей и подростков   Актуальные проблемы низкорослости у детей »