Начало >> Статьи >> Архивы >> Авторадиография

Методика приготовления гистологических срезов - Авторадиография

Оглавление
Авторадиография
Области применения авторадиографии
Радиоактивные изотопы
Авторадиография в сравнении с другими методами обнаружения ионизирующих излучений
Ядерные фотоэмульсии и фотографический процесс
Кристаллы бромистого серебра
Желатин
Скрытое изображение
Проявление скрытого изображения
Физическое проявление
Фиксирование эмульсии
Специальные методики
Цветные эмульсии
Воздействие ионизирующего излучения на ядерные эмульсии
Бета-частицы
Другие виды ионизирующего излучения
Разрешающая способность авторадиографии
Факторы, определяющие разрешающую способность зернистых авторадиограмм
Разрешение в электронномикроскопической авторадиографии
Разрешающая способность трековых авторадиограмм
Эффективность авторадиографии
Эффективность при электронномикроскопической авторадиографии
Эффективность трековой авторадиографии
Эффективность макроскопической авторадиографии
Соотношение между факторами, определяющими разрешение и эффективность
Фон авторадиограмм
Хемография
Облучение внешними источниками
Уничтожение фона
Измерение фона
Микроскопия и микрофотография авторадиограмм
Оптическая система для освещения в темном поле
Микрофотография зернистых авторадиограмм
Исследование в темном поле
Исследование и фотографирование трековых авторадиограмм
Относительные измерения радиоактивности
Перекрестные эффекты
Факторы связанные с эмульсией и влияющие на относительные измерения
Относительные измерения в трековой авторадиографии
Счет зерен и треков
Фотометрическая оценка плотности зерен
Выбор визуального или фотометрического метода счета зерен
Необходимость абсолютных измерений
Абсолютные измерения радиоактивности с помощью трековой авторадиографии
Планирование и осуществление авторадиографических исследований
Выбор эмульсии
Эксперименты с двумя изотопами
Освоение новой методики
Контрольные процедуры, необходимые для каждого эксперимента
Проектирование и оборудование темной комнаты
Гистологическая техника и авторадиография
Выбор способа гистологической фиксации
Методика приготовления гистологических срезов
Непроницаемые пленки
Приготовление авторадиограмм для микроскопии
Авторадиография растворимых радиоизотопов
Способы авторадиографии растворимого материала
Хемография и артефакты от давления
Количественные исследовани растворимых радиоактивных изотопов
Методика съемной эмульсии
Недостатки методики съемной эмульсии
Подробное описание методики  съемной эмульсии
Методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Факторы, влияющие на толщину эмульсионного слоя
Выбор подходящей толщины эмульсии
Оценка и описание методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Методика жидкой эмульсии для трековой авторадиографии
Авторадиография с электронной микроскопией
Ограничения современных методик
Детальное описание методик
Авторадиография макроскопических объектов
Авторадиография  в макроскопических образцах
Описание методик авторадиографии макроскопических объектов
Послесловие

Биологические ткани для получения удовлетворительных срезов толщиной 1—5 мкм обычно требуют заключения в некоторые поддерживающие среды, например парафин. Как и в отношении гистологической фиксации, до начала любого эксперимента должна быть исследована возможность потери или перераспределения радиоактивного материала путем сравнения авторадиограмм ткани, обработанной выбранным способом, и контрольной, нарезанной с помощью криостата, как описано в следующей главе.
Классической средой для заключения является парафин, и, по-видимому, большинство авторадиограмм приготовляли из блоков, залитых в парафин. В связи с этим имеется два момента. Во-первых, срезы должны быть полностью и тщательно депарафинированы в чистом ксилоле или бензоле до повторной гидратации и покрытия эмульсией. Следы парафина могут сохраниться на срезе вследствие использования ксилола, в котором уже обрабатывали большое количество срезов. Это не очень мешает обычной гистологической обработке, но препятствует равномерному растеканию эмульсии над срезом и ухудшает адгезию между стеклом и эмульсией. Другой недостаток заливки в парафин—необходимость его удаления до авторадиографии, вследствие чего верхний контур среза становится обычно неровным. Фактическая толщина среза при номинальном значении 5 мкм будет варьировать от 5 мкм над плотной тканью до 0 над просветом кровеносных сосудов и тканевыми щелями. Эта постоянно меняющаяся геометрия может затруднять относительное и абсолютное измерение радиоактивности.
В таких случаях весьма полезны методики, разработанные для электронной микроскопии. Из метакрилатовых или аралдитовых блоков можно приготовить срезы для световой микроскопии толщиной 1—2 мкм, их подвергают авторадиографии без удаления заключающей среды, и эти срезы с однородной плоской поверхностью легко покрыть равномерным слоем эмульсии.
В настоящее время для заключения тканей имеется большое число водорастворимых смол (применение их в обычной гистологии обсуждается в книге Стидмана [7]). Они могут найти применение в авторадиографии растворимых в липидах соединений, которые вымываются органическими растворителями.
Независимо от того, какую среду использовали для заливки, срезы должны быть натянуты на стекло в условиях высокой чистоты. Так как срезы на стекле расправляют, используя для этой цели дистиллированную воду, слой желатина становится клейким, и на нем легко собирается пыль. Слоя желатина на стекле вполне достаточно для приклеивания среза, и пет необходимости использовать для этого другие адгезирующие вещества, например яичный белок.
Методики, необходимые для приготовления срезов целого животного или таких тканей, как кость, зуб, рассматриваются в гл. 18, так как они требуются в основном в связи с авторадиографией относительно крупных объектов.

ОКРАСКА ПРЕПАРАТОВ

В начальном периоде развития авторадиографии исследовали обычно неокрашенные препараты с помощью фазовоконтрастной микроскопии.

Рис. 46. Микрофотография моторной бляшки в грудинно-сосцевидной мышце мыши после воздействия in vitro меченым ДФФ ( X 1000).
Авторадиография с эмульсией Ilford К2. Моторные бляшки окрашены гистохимически на ацетилхолинэстеразу по Келли. В этой методике используется преципитация тиохолина меди в участках локализации энзима с последующим превращением его в сульфат серебра. При исследовании в темном поле преципитат отражает большое количество света, что делает невозможным фотометрический подсчет зерен серебра над окрашенными участками. Объектив Лейтц Ультропак Х100.

Но фазовый контраст, дающий прекрасные результаты при исследовании свежезамороженного материала, дает очень плохое изображение срезов тканей, покрытых эмульсией, особенно если срез и эмульсия были обезвожены для приготовления постоянных препаратов. В этих случаях почти любая техника окраски более предпочтительна, чем использование фазового контраста.
Методика окраски может быть продиктована условиями эксперимента. Однако во многих случаях имеется возможность выбора. Если готовые препараты будут просматриваться в одном проходящем свете, значительно выгоднее использовать светлые тона, например розовый и желтый; поэтому для препаратов, меченных тимидином, применяют реакцию Фельгена. На этом фоне хорошо видны темные зерна серебра, тогда как голубые или темно-фиолетовые цвета гематоксилина делают распознавание и подсчет зерен серебра очень затруднительными. При освещении в темном поле выбор цвета менее важен, так как зерна серебра хорошо видны на черно-голубом фоне (см. рис. 26). При этом способе исследования следует избегать тех методик окраски, которые вызывают рассеивание света срезом, что может помешать наблюдению зерен серебра. Этот эффект виден на рис. 46, где он вызван осадком сульфата серебра при реакции на ацетилхолинэстеразу по Келли [8].
Принципиально имеется два альтернативных способа окраски срезов: образец окрашивают до нанесения эмульсин или после ее проявления и фиксирования. Каждый из этих способов имеет свои недостатки и преимущества.

Окрашивание до экспонирования

Любая процедура между получением материала и началом экспонирования связана с двойной опасностью: потерей радиоактивного вещества из образца и внесением в образец веществ, которые могут химически взаимодействовать с эмульсией в процессе экспонирования. Прежде чем решить вопрос о применении окраски перед экспонированием, необходимо оценить и исключить обе эти возможности: первую — путем сравнительного исследования материала до и после окраски, чтобы выяснить, имеется ли различие в количестве и распределении зерен серебра в обоих случаях; вторую — путем экспонирования окрашенного, но не содержащего радиоактивных веществ материала с нормальной и засвеченной эмульсией с целью определения хемографии. Дополнительным недостатком окрашивания препарата до экспозиции является то, что окраска может измениться и исчезнуть в процессе проявления и фиксирования.
В качестве примера этих последствий может служить работа [9], в которой показано, что окраска по Фельгену до экспонирования значительно уменьшает число зерен, видимых над клетками, меченными тимидином-Н3. Дейхар [10] сообщил о положительной хемографии в срезах, окрашенных до экспонирования целестиновым голубым.
Однако окрашивание до экспонирования имеет и некоторые преимущества: прежде всего для окрашивания доступны все реактивные группы, имеющиеся в срезах, тогда как после экспонирования, проявления и фиксации многие из них могут быть удалены или разрушены. Это особенно существенно при определении энзимов. Далее, могут быть использованы методики, применение которых после экспонирования может повредить авторадиограмму. Хорошим примером этого является реакция Фельгена на ДНК. Кислотный гидролиз после экспонирования растворяет зерна серебра. Подобным образом окрашивающие растворы с интенсивной щелочной реакцией удаляют желатин эмульсии, вызывая потерю или смещение гранул серебра; такие методики также лучше использовать до экспонирования. Затем имеются методики, вызывающие сильное окрашивание желатина эмульсии, такие, как различные способы выявления сульфгидрильных групп или даже совершенно неспецифические окраски, как, например, гематоксилином Гарриса.
В общем, окрашивание срезов дает более четкую картину, если оно выполняется до авторадиографии. Но окраска может вызывать хемографию или настолько изменяться при проявлении и фиксировании, что теряет свою ценность. В этих случаях окрашенные до нанесения эмульсии срезы следует покрывать непроницаемой пленкой. Таким путем можно удовлетворительно сочетать большинство сложных методик окраски с авторадиографией. Если непроницаемая пленка необходима, чтобы предупредить хемографию, то очевидно, что срез должен окрашиваться до экспонирования, так как окраска через пленку в дальнейшем будет невозможна.

Окрашивание через эмульсию после экспонирования

Если реактивные группы, которые необходимо выявить методикой избирательной окраски, сохраняются в процессе фотографической обработки, срез можно окрасить через эмульсию после экспонирования. В этом случае устраняются как опасность «потерять» радиоактивный материал, так и хемография, обусловленная окраской, и нет никакой необходимости защищать окраску в процессе проявления и фиксации с помощью непроницаемых пленок. Единственная опасность такой обработки— разрушение и изменение самой авторадиограммы. Это обычно учитывается путем сравнения окрашенного и неокрашенного материалов. Если количество зерен или треков в обоих случаях одинаково над сравнимыми структурами, можно считать методику окраски подходящей.
Удивительно, какое большое число методик можно использовать при окраске через слой эмульсии. Очевидно, предпочтительно применять специфические окраски на такие химические группы, которых нет в эмульсии. Фик [11], например, окрашивал срезы метиловым зеленым пиронином через эмульсионный слой толщиной 50 мкм и более. Если используется менее специфический краситель, он может значительно поглощаться желатином эмульсии. В таком случае применяют чрезмерное окрашивание среза и эмульсии с последующим дифференцированием, т. е. удалением краски в течение короткого промежутка времени; это приводит к более быстрому вымыванию красителя из эмульсии, чем из подлежащего среза. Перед окраской через эмульсию авторадиограмма должна быть тщательно промыта в проточной водопроводной воде для полного удаления гипосульфита натрия, используемого при фиксации. Даже слабые его следы, остающиеся на эмульсии, могут настолько изменить условия окраски, что будут получены неприемлемые результаты.
В случае неудовлетворительной или непостоянной окраски полезно предварительно выдержать срезы в растворе, доведенном до необходимого для окраски значения pH.
В литературе приведены перечни красителей, применение которых совместимо с авторадиографией. Бойд [5] в своей книге суммировал наиболее ранние работы, а позднее Тирстон и Жофтес [12], Беланжер [13], Леблон, Коприва и Мейсер [14] дали ценную информацию по этому вопросу.
Иногда при наличии слоя обработанной эмульсии могут успешно применяться даже гистохимические методики окраски для выявления локализации энзимов. Гуд и Попп [15] исследовали активность пироксидазы в гранулах эозинофильных лейкоцитов. Дарзинкевич приготовил авторадиограммы мышц, в которых ацетилхолинэстераза ингибировалась воздействием меченого диизопропилфторфосфата. После экспонирования автору удалось с помощью инкубации авторадиограммы в растворе пиридин-2-альдоксииа удалить ингибитор и затем выявить участки ацетилхолинэстеразной активности по Карновскому (см. рис. 44) [4]. Легко допустить, что реактивные группы, которые желают выявить, могут не сохраниться в процессе авторадиографии, по такое предположение всегда требует проверки.
В немногих случаях, когда окраску до экспонирования нельзя использовать из-за опасности потери радиоактивного материала, а окраска после экспонирования повреждает эмульсию или растворяет зерна серебра, можно попытаться, как предлагает Фроланд [16], сфотографировать неокрашенную авторадиограмму, удалить эмульсию, окрасить срез и снять вновь тот же участок. Ясно, что такую сложную методику стоит применять лишь в случае крайней необходимости.



 
« Автоматизированный мониторинг больных сахарным диабетом детей и подростков   Актуальные проблемы низкорослости у детей »