Начало >> Статьи >> Архивы >> Авторадиография

Авторадиография растворимых радиоизотопов - Авторадиография

Оглавление
Авторадиография
Области применения авторадиографии
Радиоактивные изотопы
Авторадиография в сравнении с другими методами обнаружения ионизирующих излучений
Ядерные фотоэмульсии и фотографический процесс
Кристаллы бромистого серебра
Желатин
Скрытое изображение
Проявление скрытого изображения
Физическое проявление
Фиксирование эмульсии
Специальные методики
Цветные эмульсии
Воздействие ионизирующего излучения на ядерные эмульсии
Бета-частицы
Другие виды ионизирующего излучения
Разрешающая способность авторадиографии
Факторы, определяющие разрешающую способность зернистых авторадиограмм
Разрешение в электронномикроскопической авторадиографии
Разрешающая способность трековых авторадиограмм
Эффективность авторадиографии
Эффективность при электронномикроскопической авторадиографии
Эффективность трековой авторадиографии
Эффективность макроскопической авторадиографии
Соотношение между факторами, определяющими разрешение и эффективность
Фон авторадиограмм
Хемография
Облучение внешними источниками
Уничтожение фона
Измерение фона
Микроскопия и микрофотография авторадиограмм
Оптическая система для освещения в темном поле
Микрофотография зернистых авторадиограмм
Исследование в темном поле
Исследование и фотографирование трековых авторадиограмм
Относительные измерения радиоактивности
Перекрестные эффекты
Факторы связанные с эмульсией и влияющие на относительные измерения
Относительные измерения в трековой авторадиографии
Счет зерен и треков
Фотометрическая оценка плотности зерен
Выбор визуального или фотометрического метода счета зерен
Необходимость абсолютных измерений
Абсолютные измерения радиоактивности с помощью трековой авторадиографии
Планирование и осуществление авторадиографических исследований
Выбор эмульсии
Эксперименты с двумя изотопами
Освоение новой методики
Контрольные процедуры, необходимые для каждого эксперимента
Проектирование и оборудование темной комнаты
Гистологическая техника и авторадиография
Выбор способа гистологической фиксации
Методика приготовления гистологических срезов
Непроницаемые пленки
Приготовление авторадиограмм для микроскопии
Авторадиография растворимых радиоизотопов
Способы авторадиографии растворимого материала
Хемография и артефакты от давления
Количественные исследовани растворимых радиоактивных изотопов
Методика съемной эмульсии
Недостатки методики съемной эмульсии
Подробное описание методики  съемной эмульсии
Методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Факторы, влияющие на толщину эмульсионного слоя
Выбор подходящей толщины эмульсии
Оценка и описание методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Методика жидкой эмульсии для трековой авторадиографии
Авторадиография с электронной микроскопией
Ограничения современных методик
Детальное описание методик
Авторадиография макроскопических объектов
Авторадиография  в макроскопических образцах
Описание методик авторадиографии макроскопических объектов
Послесловие

При использовании стандартных методик гистологической и авторадиографической обработки (см. гл. 12 и 14—18) предполагается, что меченый материал образца не растворяется в большинстве полярных и неполярных растворителей. В некоторых экспериментах эта идеальная ситуация близка к реальной: например, меченый тимидин, который инкорпорируется в ДНК, при соответствующей фиксации практически нерастворим. Однако во многих случаях меченый материал не столь легко переводится фиксатором в нерастворимую форму. В случае применения меченых неорганических ионов, таких, как ион иода, можно быть совершенно уверенным, что источник излучения, который желательно локализовать и измерить, практически растворим в любом реагенте, используемом при обычных гистологических и авторадиографических методиках.
Исходя из начального химического состава вводимого меченого соединения, нельзя с уверенностью сказать, будет ли радиоактивный материал вымываться при обычной методике приготовления авторадиограмм. Подходящая методика авторадиографии растворимого материала выявляется на основании предварительного исследования многих экспериментальных ситуаций. Если имеются какие-либо сомнения относительно потери радиоактивности, то следует параллельно обработать фрагменты биологических образцов обычной методикой и методикой, сохраняющей растворимый материал in situ, и результаты авторадиографии сравнить. Однако этого недостаточно, чтобы показать, что распределение меченого соединения воспроизводимо и не изменяется после обычной авторадиографии. Может наблюдаться выраженная потеря метки из одного типа клеток или тканевого компонента, в то время как в других участках остается достаточно большое количество меченого материала, чтобы дать положительные результаты при авторадиографии. Возможны также переход меченого материала в раствор и неспецифическое распределение его на мембранах, волокнах и в других тканевых структурах.
В литературе публикуется много экспериментальных работ без каких-либо доказательств надежности выбранной методики. Если характер распределения радиоактивности, выявленный, например, с помощью съемной эмульсии на парафиновых срезах, тот же, что и после применения методики, предотвращающей потерю или перераспределение радиоактивности, резонно остановиться на первой методике.
В качестве контрольной процедуры иного рода можно подсчитать импульсы, например на сцинтилляционном счетчике, чтобы определить присутствие радиоактивности в растворах, используемых в гистологии и авторадиографии, после проводки через них серии препаратов. Однако это довольно малочувствительный метод, так как общая радиоактивность в срезах тканей, приготовленных для авторадиографии, часто невелика, а объем растворов большой, так что возможна потеря 30—40% радиоактивности из серии срезов, которая не будет зафиксирована измерением активности образцов растворов, взятых для исследования. Этот тип контроля имеет дополнительный недостаток: он не дает никакой информации о возможном перераспределении радиоактивности во время приготовления авторадиограмм. Методика авторадиографии растворимых изотопов необходима не только в тех немногих случаях, когда предполагается, что радиоактивный материал теряется при обычной авторадиографии, но и как предварительный этап во многих экспериментах для выявления возможности использования более простой и привычной методики.
К сожалению, авторадиография растворимых изотопов технически затруднительна. Методики с применением жидких эмульсий стали более или менее широко применяться для исследования растворимых изотопов более 10 лет назад. За это время опубликовано большое количество статей, в которых доказывается, что существующие способы авторадиографии растворимого меченого материала не адекватны, и предлагаются различные модификации и новые методики, которые большей частью весьма сложны.
Здесь не делается попытки провести обзор этой литературы. Будут обсуждены относительно немногие основные методики, которые дали приемлемые результаты более чем в одной лаборатории. Методики, которые кажутся в настоящее время наиболее подходящими, будут описаны детально. К сожалению, до сих пор не предложено никакой методики, которая позволила бы изучить распределение растворимого материала в тканях на электронномикроскопическом уровне.
Проблемы, возникающие при приготовлении тканей для авторадиографии растворимого материала, могут рассматриваться в двух аспектах: гистологическом и авторадиографическом.

ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ РАСТВОРИМЫХ ИЗОТОПОВ

Основная проблема — получение относительно тонких срезов плотных тканей. Это необходимое требование для приготовления авторадиограмм с достаточно высоким разрешением.
Классическая гистологическая методика приготовления тканей, пригодных для получения хороших срезов, включает обезвоживание и пропитывание парафином. Это требует проводки материала через водные растворы, обезвоживания его в спиртах возрастающей концентрации и замещения спирта такими растворителями, как ксилол или бензин до заключения в парафин. Трудно придумать методику, более подходящую для экстракции меченого материала из ткани.
Можно заменить дегидратацию ткани лиофильной сушкой. Ткань можно быстро заморозить, погружая ее в изопентан при температуре жидкого азота и затем выдерживая при температуре —30° С и очень низком давлении до возгонки и полного удаления воды. После этого ткань можно непосредственно заключить в парафин и получить удовлетворительные срезы. Однако это не дает полного решения всех проблем авторадиографии растворимых изотопов. Например, некоторые меченые соединения могут растворяться в расплавленном парафине. В эксперименте по определению локализации меченого иона иода автор намеренно получил авторадиограммы срезов из участков парафина, находящихся вблизи заключенных в нем кусочков ткани, и установил присутствие иона иода в самом парафине. Другая трудность — удаление парафина из среза, чтобы можно было получить удовлетворительные авторадиограммы. Если срез монтируют на стекле и покрывают эмульсией, последняя не образует над парафином ровной и гладкой пленки. Если срез монтируют на поверхности эмульсионного слоя, то парафин надо удалить до проявления, в противном случае, проникновение растворов, используемых при проявлении, в подлежащую эмульсию невозможно проконтролировать. Обработка в ксилоле или аналогичном растворителе для удаления парафина перед проявлением, по-видимому, не оказывает существенного влияния на эмульсию, но велика вероятность того, что депарафинированный срез отклеится от эмульсии.
Учитывая сказанное, можно сделать вывод, что если имеется какая-либо опасность растворения меченого материала в водных или органических растворителях, заливка в парафин не обеспечивает достижения цели.
Использование вместо парафина таких сред, как аралдит, исключает некоторые затруднения. Эмульсию в этом случае можно наносить ровным слоем поверх заключающего пластика. Подобную методику описали в работе [1]. Небольшие фрагменты ткани после высушивания под вакуумом заключают в аралдит (путем непосредственного пропитывания) и с помощью стеклянного ножа готовят тонкие срезы. Эти срезы покрывают эмульсией и экспонируют. Предварительные результаты авторов показывают, что эта методика, дающая хорошее разрешение и не сопровождающаяся очевидным перераспределением радиоактивности в случае исследования меченых стероидных гормонов, может быть весьма полезной (рис. 48). Однако существует возможность перемещения некоторых соединений при пропитывании заключающей средой.

Рис, 48. Микрофотография небольшой артерии легкого через 5 мин после введения меченой ацетилсалициловой кислоты (Х1600).
Отлично видна локализация этого хорошо растворимого соединения в просвете сосуда. Ткань заморожена в изопентане при температуре жидкого азота, высушена в замороженном состоянии и заключена в эпон под вакуумом. Срез толщиной 1 мкм. Авторадиография с помощью эмульсии Kodak NTB-2.

Можно предположить, что эта методика явится отправным пунктом для разработки авторадиографии растворимых материалов на электронномикроскопическом уровне. К сожалению, сохранность ткани в этом случае недостаточно хорошая, чтобы можно было ее исследовать с помощью электронного микроскопа (2).
В настоящее время широко используют методику приготовления гистологических срезов с помощью криостата.
Замороженная ткань достаточно плотна для нарезки, а если принять меры для сохранения ее в замороженном состоянии в течение всего процесса нарезки и авторадиографии, то шансы потери или перераспределения радиоактивности невелики.
Образец ткани вырезают таким образом, чтобы его размер не превышал 2 мм в любом направлении, и помещают в изопентан. Последний предварительно охлаждают в жидком азоте до состояния, когда он только начинает становиться вязким. Эту стадию легко определить, если в изопентане постоянно встряхивать стеклянную бусинку. Когда эта точка достигнута, ткань следует поместить в контейнер с изопентаном. Через минуту ткань, за которой легче наблюдать и с которой легче манипулировать, если она смонтирована на небольшом кусочке тонкого картона, переносят с помощью заранее охлажденного пинцета в жидкий азот, где ее можно хранить очень долго.
Когда все готово для нарезки срезов, следует поместить головку блока от криостата в чашку с двуокисью углерода. С помощью охлажденного пинцета ткань вынимают из жидкого азота и помещают на каплю 1%-ного раствора желатина, нанесенную на поверхность блока. При небольшой практике это можно сделать очень быстро, так что желатин замерзает, фиксируя ткань к блоку, прежде чем она оттает. Ткань на блоке переносят для резки в криостат, предварительно охлажденный приблизительно до —20° С.
Ткань с момента помещения в изопентан до нарезки должна оставаться замороженной. При этом не возникает условий для значительной потери или даже перемещения меченого материала. Быстрота монтирования на блок, очевидно, имеет решающее значение, так как если ткань оттает во время помещения на каплю желатина, может произойти потеря и перемещение радиоактивности.
Не исключено кратковременное оттаивание ткани в момент нарезки. Предполагают, что кромка ножа действует подобно коньку, расплавляя блок давлением, которое создается по линии контакта. Возможно, это и так, но опыт показывает, что данное явление не имеет существенного значения в авторадиографии растворимых веществ, которые часто локализуются в ограниченном участке внутри клетки. Можно полагать, что расплавленная зона замерзает практически мгновенно.
Дальнейший процесс обработки нарезанных срезов будет описан при изложении применяющейся авторадиографической методики.
Обработка клеточной суспензии проще по сравнению с обработкой плотного материала, который требует нарезки. Не требуется много времени и опыта, чтобы приготовить мазок из суспензии клеток и высушить его при слабом токе воздуха. В некоторых случаях этого может быть совершенно достаточно. Но необходимо отметить, что концентрация меченого вещества в клетке обычно намного выше, чем в окружающей жидкости, и притом зависит от функциональной проницаемости мембранных систем клетки. По мере высыхания мазка внеклеточное осмотическое давление жидкости увеличивается, и в этих условиях возможен выход внутриклеточного материала в окружающую жидкость. В эксперименте с растворимыми веществами вокруг клеток, высушенных на воздухе, может образоваться широкий ореол из зерен серебра, в то время как в срезах, приготовленных на криостате, локализация радиоактивности при той же радиографической методике оказывается иной. В этом случае всегда можно заморозить суспензию клеток погружением в изопентан в жидком азоте (контейнером может служить небольшая капсула из желатина или алюминиевой фольги); полученный в результате блок льда нарезают на криостате так, как и плотную ткань.
Качество срезов, сделанных на криостате, обычно хуже по сравнению с приготовленными путем заключения в плотную среду. Внутри замороженных клеток могут образовываться кристаллики льда, придавая им при большом увеличении вид «изъеденных молью». Трудно получить одинаковые и воспроизводимые по толщине срезы. Сами срезы очень хрупкие и часто имеют разрывы и складки. Затруднения, возникающие вследствие этих технических дефектов, будут рассмотрены позднее в связи с интерпретацией авторадиограмм растворимых материалов. Однако срезы, полученные при небольшом навыке работы на криостате, имеют приемлемое качество, и эта техника в настоящее время часто является наилучшим способом подготовки ткани для авторадиографии без риска потери или перераспределения меченого растворимого материала.



 
« Автоматизированный мониторинг больных сахарным диабетом детей и подростков   Актуальные проблемы низкорослости у детей »