Начало >> Статьи >> Архивы >> Авторадиография

Способы авторадиографии растворимого материала - Авторадиография

Оглавление
Авторадиография
Области применения авторадиографии
Радиоактивные изотопы
Авторадиография в сравнении с другими методами обнаружения ионизирующих излучений
Ядерные фотоэмульсии и фотографический процесс
Кристаллы бромистого серебра
Желатин
Скрытое изображение
Проявление скрытого изображения
Физическое проявление
Фиксирование эмульсии
Специальные методики
Цветные эмульсии
Воздействие ионизирующего излучения на ядерные эмульсии
Бета-частицы
Другие виды ионизирующего излучения
Разрешающая способность авторадиографии
Факторы, определяющие разрешающую способность зернистых авторадиограмм
Разрешение в электронномикроскопической авторадиографии
Разрешающая способность трековых авторадиограмм
Эффективность авторадиографии
Эффективность при электронномикроскопической авторадиографии
Эффективность трековой авторадиографии
Эффективность макроскопической авторадиографии
Соотношение между факторами, определяющими разрешение и эффективность
Фон авторадиограмм
Хемография
Облучение внешними источниками
Уничтожение фона
Измерение фона
Микроскопия и микрофотография авторадиограмм
Оптическая система для освещения в темном поле
Микрофотография зернистых авторадиограмм
Исследование в темном поле
Исследование и фотографирование трековых авторадиограмм
Относительные измерения радиоактивности
Перекрестные эффекты
Факторы связанные с эмульсией и влияющие на относительные измерения
Относительные измерения в трековой авторадиографии
Счет зерен и треков
Фотометрическая оценка плотности зерен
Выбор визуального или фотометрического метода счета зерен
Необходимость абсолютных измерений
Абсолютные измерения радиоактивности с помощью трековой авторадиографии
Планирование и осуществление авторадиографических исследований
Выбор эмульсии
Эксперименты с двумя изотопами
Освоение новой методики
Контрольные процедуры, необходимые для каждого эксперимента
Проектирование и оборудование темной комнаты
Гистологическая техника и авторадиография
Выбор способа гистологической фиксации
Методика приготовления гистологических срезов
Непроницаемые пленки
Приготовление авторадиограмм для микроскопии
Авторадиография растворимых радиоизотопов
Способы авторадиографии растворимого материала
Хемография и артефакты от давления
Количественные исследовани растворимых радиоактивных изотопов
Методика съемной эмульсии
Недостатки методики съемной эмульсии
Подробное описание методики  съемной эмульсии
Методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Факторы, влияющие на толщину эмульсионного слоя
Выбор подходящей толщины эмульсии
Оценка и описание методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Методика жидкой эмульсии для трековой авторадиографии
Авторадиография с электронной микроскопией
Ограничения современных методик
Детальное описание методик
Авторадиография макроскопических объектов
Авторадиография  в макроскопических образцах
Описание методик авторадиографии макроскопических объектов
Послесловие

Обычные методики авторадиографии, при которых срезы погружают в жидкую эмульсию или воду для наложения съемной эмульсии, в данном случае совершенно неприемлемы. Был предложен способ, при котором съемную эмульсию помещали на поверхность ртути и вылавливали оттуда, как из воды, но нет достаточных оснований рекомендовать его применение.
Криостатный срез можно натянуть на покровное стекло с лезвия ножа. Если для этого использовать стекло комнатной температуры, срез растает, прилипнув к стеклу, и затем медленно высохнет. При этом может произойти существенное перераспределение радиоактивности. Срез должен все время оставаться замороженным. Из этого следует, что стекла, на которые будет монтироваться срез, должны храниться при температуре ниже 0° С.
Для того чтобы срезы прилипли к стеклу с ножа, нет необходимости поддерживать его при комнатной температуре, требуется только, чтобы между ножом и стеклом была некоторая разница температур, причем стекло должно быть несколько теплее ножа [10]. Размораживание среза в момент монтирования можно определить по образованию слоя инея на ноже в участках на месте среза. Такие срезы должны быть забракованы.
Разницы температуры между стеклом и ножом можно достигнуть несколькими способами. Срезы можно сохранить в контейнере с несколько более высокой температурой, чем в криостате. Можно поддерживать температуру ножа на более низком уровне, обкладывая кран его сухим льдом. Возможно, наиболее простым методом является сохранение стекол в криостате, полагаясь на слабое нагревание их во время манипуляции по наклеиванию стекол.
Было предложено несколько методик покрытия эмульсией срезов, натянутых на стекла. Логично было бы попытаться покрыть срез какой-либо непроницаемой пленкой, например ПВХ, после чего использовать обычные методики покрытия съемной или жидкой эмульсией без опасности вымывания радиоактивности из ткани. Однако это крайне трудно. Чтобы нанести пленку без проведения среза через какие-либо растворители, необходимо приготовить пластикатовую пленку на проволочной петле, полностью высушить ее и затем поместить над срезом. В этих условиях нелегко добиться по-настоящему тесного прилегания пленки к срезу, поэтому часто образуются складки пленки или небольшие воздушные пузырьки. Кроме того, применение пластиковой пленки исключает возможность окраски среза после авторадиографии.
Можно натянуть срез на предметное стекло и покрыть его сухой эмульсией. Такую методику предложили авторы работ с использованием съемной пленки Kodak AR-10, которую отслаивают от стеклянной подложки и накладывают прямо на стекло с помощью небольшого резинового валика. Полагают, что конденсация влаги на стекле при перемещении его из криостата в воздух с комнатной температурой обеспечивает достаточную адгезию эмульсии. Однако этого также достаточно, чтобы вызвать во многих экспериментах перемещение радиоактивности.
Методика, предложенная Миллером и др. [5], кажется довольно многообещающей. Петлю, приготовленную из проволоки нержавеющей стали, помещают в расплавленную эмульсию, а затем извлекают с пленкой эмульсии на ней. Пленку тщательно высушивают и затем помещают поверх криостатного среза, натянутого на стекло. Эта методика может дать удовлетворительные результаты при условии, что некоторые этапы ее выполнения тщательно контролируются. Срез перед тем, как перенести в лабораторию, должен быть хорошо высушен, затем необходимо предотвратить конденсацию влаги на его поверхности, дав возможность ему достичь температурного равновесия
в сухой атмосфере. Наконец, пленка эмульсии должна полностью высохнуть. Темную комнату следует хорошо проветривать, поскольку достаточно высокий процент пленок эмульсин рвется, если они недостаточно высушены. Если исключить эти досадные неприятности, методика дает приемлемые результаты.
Брайтон и Якобсон [6] предложили методику, которая в несколько модифицированном виде была попользована в ряде лабораторий. Они применяли высушенный материал, заключенный в парафин. Срезы натягивали на тефлоновую подложку и на время экспонирования плотно прижимали к эмульсионному слою на стекле. Электростатические силы были достаточно велики, чтобы удержать срез на тефлоне и после окончания экспонирования. Робертс и др. [7], а также Штумпф [8] модифицировали эту методику, используя криостатные срезы, которые натягивали на тефлоновую подложку или на силиконированное стекло. Криостатные срезы в замороженном состоянии высушивали под вакуумом и затем плотно прижимали к эмульсионному слою для экспонирования. Некоторые трудности связаны с поддержанием срезов в контакте с эмульсией после удаления тефлоновой подложки или силиконированного стекла. Чтобы поддержать срез на месте, можно использовать покрытие эмульсии до проявления и фиксации ацетатом целлюлозы [6, 7].
Хаммарстрем и соавторы [9] предложили натягивать криостатные срезы на липкую ленту из поливинилхлорида и прикладывать их к эмульсии, которую они пропитывали глицерином для улучшения адгезии между срезом и эмульсией. Перед проявлением ленту удаляли, растворяя ее в ксилоле или ацетоне.
Некоторые преимущества может дать высушивание криостатных срезов в замороженном состоянии до экспозиции, в частности, уменьшается вероятность перемещения радиоактивных веществ при оттаивании среза. Однако очень тонкие криостатные срезы после высушивания имеют вид тончайшего слоя порошка, и трудно представить, насколько хорошо при этой методике сохраняется гистологическая структура. Можно ожидать, что после прикладывания срезов к эмульсии для экспозиции и последующего отделения ее сохраняются только фрагменты таких срезов.
В настоящее время наиболее удовлетворительным способом автор считает натягивание срезов с криостатного ножа непосредственно на сухую эмульсию. Это позволяет сохранить ткань в замороженном состоянии с момента погружения в изопентан вплоть до конца экспозиции. Подобная методика была описана Апплетоном [10], который использовал съемную пленку Kodak AR-10. Это наиболее простая методика дает удовлетворительные результаты в ряде лабораторий [11 —14].
При этой методике стекло сначала покрывают эмульсией. Если используется съемная эмульсия, ее следует натянуть на
стекло (см. гл. 14) желатиновым слоем к стеклу и эмульсией наружу. Если применяется жидкая эмульсия, стекло покрывают, погружая его в расплавленную эмульсию (см. гл. 15). В любом случае эмульсионный слой должен быть тщательно высушен. Криостатные срезы ткани, содержащей меченый материал, нарезают обычным способом; единственное условие — криостат должен находиться в темной комнате и срезы нарезают при освещении, не влияющем на эмульсию. Покрытые эмульсией стекла сохраняют при температуре от —10° до —15° С. Срезы снимают с ножа кратковременным прикладыванием к срезу покрытого эмульсией стекла. Стекла немедленно переносят для экспонирования в комнату с температурой от —20° до —30° С.
Иногда считают, что резать на криостате в темной комнате крайне трудно; в действительности же при небольшом навыке это вполне возможно. До того как выключить основной свет, следует установить блок на криостате и получить удовлетворительные срезы: таким образом, при неактиничном свете остается только повернуть ручку микротома и снять срез. Автор предпочитает при этой методике использовать эмульсию Ilford, так как она позволяет манипулировать в условиях намного более яркого освещения, чем съемные эмульсии Eastman-Kodak NTB или Kodak AR-10. По при некотором терпении и полной адаптации к темноте даже при работе с этими эмульсиями можно получить серию приемлемых срезов и смонтировать их на эмульсионном слое, не допуская размораживания срезов.
Очевидно, чтобы избежать размораживания, экспонировать срезы, приготовленные подобным образом, необходимо при температуре ниже 0° С.
В некоторых лабораториях встречаются значительные трудности, связанные с отклеиванием срезов в процессе проявления и фиксации; для предупреждения этого предлагали разные способы: погружение срезов перед проявлением в раствор ацетатцеллюлозы [6, 7], в формвар [12] и смолу [13].
Отклеивания срезов можно избежать, применяя общепринятую обработку после окончания экспозиции.
Стекла вынимают из морозильной камеры холодильника и переносят в помещение лаборатории, оттаявшие при этом срезы быстро (примерно в течение 2 мин) высушивают при медленном токе воздуха. Далее срезы помещают на 12 мин в 4%-ный раствор формальдегида, приготовленный с добавлением фосфатного буфера (pH = 7,4), и несколько раз промывают в дистиллированной воде при комнатной температуре для фиксации. Вслед за этим срезы следует немедленно проявить и зафиксировать, окончательно окрасить и затем смонтировать для микроскопии.
Дарзинкевич, работая в лаборатории автора, успешно применял обычную методику со съемной эмульсией AR-10, так и с эмульсией Ilford К2 с потерей весьма незначительного процента срезов. Является фактом, что если не проводить оттаивания и высушивания срезов, значительная часть их будет утеряна. Использование оттаивания может показаться нелогичным после тех усилий, которые предпринимались, чтобы сохранить ткань в замороженном состоянии на протяжении всех операций, но период времени, в течение которого меченый материал может изменить локализацию, составляет только очень незначительную долю общей экспозиции, так что его влиянием на авторадиограмму можно пренебречь. При другом способе размороженный срез с эмульсией можно до фиксации в формалине погрузить в спирт и высушить. При этом уменьшается время, в течение которою размораживание среза позволяет радиоактивному материалу изменить локализацию.
Некоторые авторы предпочитают готовить авторадиограммы с эмульсионным слоем над срезом. Этого можно добиться, если снимать срез с криостата на покрытое эмульсией покровное стекло. К сожалению, покровное стекло имеет очень небольшую теплоемкость, и трудно контролировать его температуру во время манипуляций по снятию среза с достаточной точностью, так что в некоторых случаях может происходить размораживание среза с последующим нарушением распределения радиоактивности. По-видимому, наиболее подходящий способ — приклеить покровное стекло к предметному каплей заключающей среды и покрыть покровное стекло эмульсией. Такое «двойное» стекло удовлетворяет требуемой степени теплоемкости, и манипулировать с ним проще, а после окраски покровное стекло можно отклеить от предметного с помощью ксилола и смонтировать эмульсионной стороной вниз.
В статье [15] авторы сравнивают авторадиограммы, полученные шестью разными способами при исследовании распределения Н3-эстрадиола и Н3-мезобилирубина в печени и матке. В первой методике, о которой говорилось выше [8], использовали срезы свежезамороженного материала, полученные на криостате; применяли стеклянный нож и нарезали при температуре —70° С, получали срезы толщиной 0,5—1 мкм. Их высушивали в замороженном состоянии, помещали на тефлоновую подложку и придавливали для экспонирования к замороженной эмульсии. При этой методике была исключена возможность потери или перераспределения радиоактивного материала и получена отличная локализация мезобилирубина в желчных канальцах. Ни одна из пяти других методик не давала столь адекватной локализации радиоактивности. Из других методик использовали: 1) натягивание криостатных срезов на стекла, покрытые эмульсией, при комнатной температуре; 2) натягивание криостатных срезов на стекла при комнатной температуре с последующим покрытием жидкой эмульсией; 3) высушивание в замороженном состоянии, фиксацию в осмиевой кислоте и заключение в эпоксидную смолу методикой, сходной с описанной в работе [1]; 4) высушивание в замороженном состоянии и заключение в парафин, депарафинирование срезов и покрытие их жидкой эмульсией; 5) обычную гистологическую обработку после формалиновой фиксации, заключение в парафин и покрытие срезов жидкой эмульсией.
Из результатов этого исследования можно сделать два интересных вывода. Во-первых, воспроизводимость результатов не может служить критерием точной локализации. Некоторые методики, при которых имеются очевидная потеря и перераспределение радиоактивного материала, дают хорошую воспроизводимость. Ясно также, что потеря активности может происходить из соседних участков одного и того же среза в разной степени. Во многих случаях отличная локализация активности в просвете кровеносных сосудов сочеталась с перераспределением или даже вымыванием радиоактивного материала из прилежащих структур.
К большому, сожалению, Штампф и Рот не исследовали методику Апплетона [10], описанную в этой главе. Очевидно, монтирование среза, полученного на криостате, на эмульсию при комнатной температуре сопровождается его размораживанием и перераспределением активности. Этот источник ошибок устраняется, если эмульсию хранить при температуре —10° С или ниже. Апплетон [16] опубликовал детальный расчет разрешающей способности для Н3 и Na22, которую можно ожидать при его методике. Она лишь незначительно хуже, чем для нерастворимых изотопов, если предположить, что во время авторадиографии происходит лишь небольшое распространение радиоактивного изотопа, если оно вообще имеет место. Он также исследовал снижение чувствительности при экспонировании эмульсии Kodak AR-10 в условиях низкой температуры и пришел к выводу, что, по-видимому, оптимальной температурой экспозиции является.—25° С. Регрессия скрытого изображения при этом виде обработки может быть ограничена при продолжительности экспонирования вплоть до года.
Высушивание замороженных срезов под вакуумом до экспонирования является единственным существенным различием между методиками Штампфа и Рота и Апплетона, и было бы очень интересно выяснить, за счет чего происходит улучшение разрешения, если оно достигается при использовании этого приема.
Заслуживает внимания возможность отклеивания криостатных срезов, возрастающая при увеличении их размеров свыше некоторого предела. Наиболее приемлемый путь предотвращения этого — окунуть стекло при комнатной температуре в 1%-ный раствор желатина и высушить его. Это следует сделать по окончании экспонирования и до проявления. Желатин удерживает срез и в то же время позволяет реагентам и окрашивающим растворам свободно проникать в эмульсию и срез и не мешать микроскопированию. Наконец, Ульберг предложил использовать тонкую пленку водного раствора карбоксиметилцеллюлозы в воде для фиксации блока ткани на блокодержателе микротома. Эта методика намного лучше, чем обычно рекомендуемое применение воды или разведенного раствора желатина.



 
« Автоматизированный мониторинг больных сахарным диабетом детей и подростков   Актуальные проблемы низкорослости у детей »