Начало >> Статьи >> Архивы >> Авторадиография

Методика жидкой эмульсии для трековой авторадиографии - Авторадиография

Оглавление
Авторадиография
Области применения авторадиографии
Радиоактивные изотопы
Авторадиография в сравнении с другими методами обнаружения ионизирующих излучений
Ядерные фотоэмульсии и фотографический процесс
Кристаллы бромистого серебра
Желатин
Скрытое изображение
Проявление скрытого изображения
Физическое проявление
Фиксирование эмульсии
Специальные методики
Цветные эмульсии
Воздействие ионизирующего излучения на ядерные эмульсии
Бета-частицы
Другие виды ионизирующего излучения
Разрешающая способность авторадиографии
Факторы, определяющие разрешающую способность зернистых авторадиограмм
Разрешение в электронномикроскопической авторадиографии
Разрешающая способность трековых авторадиограмм
Эффективность авторадиографии
Эффективность при электронномикроскопической авторадиографии
Эффективность трековой авторадиографии
Эффективность макроскопической авторадиографии
Соотношение между факторами, определяющими разрешение и эффективность
Фон авторадиограмм
Хемография
Облучение внешними источниками
Уничтожение фона
Измерение фона
Микроскопия и микрофотография авторадиограмм
Оптическая система для освещения в темном поле
Микрофотография зернистых авторадиограмм
Исследование в темном поле
Исследование и фотографирование трековых авторадиограмм
Относительные измерения радиоактивности
Перекрестные эффекты
Факторы связанные с эмульсией и влияющие на относительные измерения
Относительные измерения в трековой авторадиографии
Счет зерен и треков
Фотометрическая оценка плотности зерен
Выбор визуального или фотометрического метода счета зерен
Необходимость абсолютных измерений
Абсолютные измерения радиоактивности с помощью трековой авторадиографии
Планирование и осуществление авторадиографических исследований
Выбор эмульсии
Эксперименты с двумя изотопами
Освоение новой методики
Контрольные процедуры, необходимые для каждого эксперимента
Проектирование и оборудование темной комнаты
Гистологическая техника и авторадиография
Выбор способа гистологической фиксации
Методика приготовления гистологических срезов
Непроницаемые пленки
Приготовление авторадиограмм для микроскопии
Авторадиография растворимых радиоизотопов
Способы авторадиографии растворимого материала
Хемография и артефакты от давления
Количественные исследовани растворимых радиоактивных изотопов
Методика съемной эмульсии
Недостатки методики съемной эмульсии
Подробное описание методики  съемной эмульсии
Методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Факторы, влияющие на толщину эмульсионного слоя
Выбор подходящей толщины эмульсии
Оценка и описание методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Методика жидкой эмульсии для трековой авторадиографии
Авторадиография с электронной микроскопией
Ограничения современных методик
Детальное описание методик
Авторадиография макроскопических объектов
Авторадиография  в макроскопических образцах
Описание методик авторадиографии макроскопических объектов
Послесловие

Если вспомнить историю разработки ядерных эмульсий и развития техники их использования, то становится удивительным, насколько редко биологи использовали в своих исследованиях толстослойные эмульсии для регистрации треков частиц. На ранних стадиях развития авторадиографию использовали главным образом для идентификации распределения радиоактивности в тканях, поэтому способ толстослойных ядерных эмульсий требовал больших затрат труда и времени по сравнению с методикой определения плотности зерен, в которой использовались тонкие слои жидкой или съемной эмульсии. Конечно, техника трековой авторадиографии более сложна, однако, как указывалось в гл. 10, когда возникает задача измерения радиоактивности, преимущества трековой авторадиографии становятся более существенными. Необходимая физикам информация о количестве зерен в треке и углах рассеяния представляет собой более высокий уровень экспериментальной техники по сравнению с простой регистрацией количества треков, которой достаточно при проведении количественной авторадиографии. Поэтому не вызывает сомнения, что эмульсии и техника обращения с ними, разработанная применительно к первой задаче, будет полностью пригодная и для решения второй.
Регистрация треков α-частиц — не очень сложная проблема. Количественные исследования, основанные на счете α-частиц, описаны несколькими авторами [1—3]. Малый пробег и высокая плотность ионизации α-частпц позволяют проводить исследования с помощью тонкого слоя относительно малочувствительной эмульсин. Фактически пригодными являются съемная эмульсия Kodak AR-10 и эмульсия Ilford К2 для работы с тритием (описанные соответственно в гл. 14 и 15).
Регистрация треков β-частиц^олее затруднена вследствие их большого пробега и относительно слабой ионизирующей способности, а также искривленности их траектории. Используемые слои эмульсии должны иметь большую толщину и достаточно высокую чувствительность, что обеспечивает малое расстояние между проявленными зернами серебра и соответственно простоту распознавания треков. Сложность проведения β-трековой авторадиографии обусловлена необходимостью применения для этой цели толстых слоев, обладающих высокой чувствительностью.
Большая часть основных работ по β-трековой авторадиографии выполнена Леви [4—6]. В 1954 г. ею было опубликовано подробное описание техники приготовления слоев эмульсии Ilford G5 толщиной 60 мкм [7]. Леви, Роджерс, Вайс-Вентцон и Нильсон [8] в дальнейшем детально описали режим обработки слоев эмульсии Ilford G5 толщиной 60 и 120 мкм, а также привели соотношения между начальной энергией электронов, пробегом, количеством и взаимным расположением зерен и трековым радиусом для частиц, имеющих энергию в диапазоне от 20 до 400 кэв.
В работах [9—11] β-трековая авторадиография использовалась не только для выявления локализации, но и для количественных измерений. Использованная ею техника описана в специальной главе книги «Клетка», изданной в 1961 г. под редакцией Брачета и Мирски [12].
Первой попыткой продемонстрировать количественные возможности способа следует считать работу Леви [13] (1956) и Левинталя и Томаса [14] (1957), которые измерили абсолютную скорость распада Р32 в меченых вирусах бактериофага. В последнем докладе приводится описание использованной ими методики. Бактериофаги распределялись в толстых слоях эмульсии Ilford G5, и их месторасположение фиксировалось по сосредоточению β-треков, исходящих радиально из одной точки. Основой для вычисления скорости распада, и, следовательно, числа атомов фосфора в вирусе служило количество треков.
Роджерс и соавторы [15] использовали подобную методику в измерениях ацетилхолинэстеразы в концевых пластинках двигательного нерва и мегакариоцитах с помощью диизопропилфторфосфата ДФФ [16]. Исследователям удалось найти абсолютное количество молекул энзима ацетилхолинэстеразы в указанных биологических объектах. Представляет интерес хорошая корреляция данных, полученных как с помощью счета треков, образованных от ДФФ, меченного Р32, так и с использованием жидкого сцинтиллятора и ДФФ, меченного тритием.

ОСНОВНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ β-ТРЕКОВОЙ АВТОРАДИОГРАФИИ

Многие особенности β-трековой авторадиографии уже описаны в других главах книги. Здесь же приведем краткое обсуждение наиболее важных из них.
Если требуется точно измерить скорость распада радиоактивной метки, то единственно приемлемым для этой цели способом является регистрация треков, образуемых проявленными зернами серебра в толстослойной эмульсии. Для определения локализации радиоактивности более удобным является применение тонких эмульсионных слоев. Во многих случаях также более просто измерить относительные концентрации изотопов путем сравнения плотностей зерен в тонких слоях.  Однако абсолютные измерения радиоактивности во многих случаях могут быть проведены лишь на основе трековой авторадиографии. Обычно наиболее удобный способ проведения трековой авторадиографии состоит в фиксации на предметном стекле биологического материала с последующим покрытием одной из его сторон ядерной эмульсией. Методика суспендирования источников в эмульсии, обеспечивающая регистрацию треков в полном телесном угле, не нашла распространения при проведении количественных исследований.
Основные понятия, такие, как эффективность, разрешение и фон в трековой авторадиографии, приобретают несколько иное значение, чем в случае авторадиографии с оценкой плотности зерен. Поэтому ниже дается их краткое изложение.

Эффективность

В трековой авторадиографии эффективность можно определить как процентное отношение числа распадов, приведших к образованию распознаваемых треков, к полному числу распадов, имевших место в источнике за время экспозиции. В отсутствие самопоглощения, в случае высокой начальной энергии частиц и полного окружения источника эмульсией эффективность трековой авторадиографии должна составлять 100%; такая ситуация встречалась в работе Левинталя [13, 14] с вирусами, меченными Р32 и суспендированными в эмульсии.
Эффективность регистрации может уменьшаться под воздействием трех факторов. Первый из них — самопоглощение, которое становится вес более существенным с уменьшением начальной энергии частиц и с возрастанием размера и массы источника. Для срезов ткани толщиной 5 мкм и менее, а также мазков клеточных суспензий самопоглощением можно пренебречь, за исключением случая С14. Второй фактор относится к способности частиц с низкой начальной энергией образовывать распознаваемые треки, содержащие обычно 4 или более проявленных зерен. Для С14, например, менее 4 зерен на своей траектории будут образовывать 14% общего числа частиц.
Третьим фактором, влияющим на снижение эффективности трековой авторадиографии по отношению к теоретически возможной максимальной величине 100%. является геометрия соотношения между источником и эмульсией. Если источник расположен на предметном стекле и покрыт эмульсией только с одной стороны, то видимые треки могут образовать только частицы, вылетающие из источника в направлении эмульсии. В такой ситуации (см. рис. 19) разумно предположить, что 50% частиц, вылетающих из источника, направлены в сторону эмульсии. Некоторые из них будут затем рассеяны обратно в сторону предметного стекла, и, наоборот, некоторые частицы, имевшие первоначальное направление в сторону стекла, после рассеивания попадают в эмульсию. Но в первом приближении можно считать, что количество треков в эмульсии вблизи источника клеточных размеров представляет собой половину общего числа треков, которое возникло бы в случае полного суспендирования источника в эмульсии.
Если авторадиограмма приготовлена достаточно тщательно, так что можно пренебречь регрессией скрытого изображения и потерей активности при гистологической обработке, для перехода от количества наблюдаемых треков к числу распадов в источнике достаточен учет указанных трех факторов.

Разрешение

Разрешение авторадиографического метода рассмотрено в гл. 4. Суть состоит в том, что, за исключением случая суспендирования источников малых размеров в эмульсии, нельзя точно указать точку, из которой испускаются β-частицы: можно лишь наблюдать точку, в которой β-частицы входят в эмульсию. В случае расположения тканевого среза на предметном стекле (см. рис. 19) 50% частиц испускаются источником в направлении эмульсии. Количество частиц, рассеиваемых затем через поверхность раздела стекло—эмульсия, трудно определить точно, однако из предварительных лабораторных измерений с Р32 его можно оценить величиной порядка 10% общего числа β-частиц, вылетевших из источника.
Если под разрешением способа трековой авторадиографии подразумевать минимальный радиус окружности, в пределах которой расположено 50% точек начала треков, образованных β-частицами, то оно составляет примерно 2 мкм даже для Р32.

Фон

Одним из главных преимуществ способа трековой авторадиографии является низкий уровень присущего ему фона. В гл. 6 мы видели, что множество факторов, не говоря уже об ионизирующих частицах, вызывает появление проявленных зерен в ядерной эмульсии, например тепло, свет, давление, химические вещества. Зерна, образованные при воздействии излучения на тонкий слой эмульсии, неотличимы от фоновых. Однако при воздействии любого из перечисленных фоновых факторов не образуются β-треки, поэтому способ трековой авторадиографии позволяет дискриминировать случайно образовавшиеся фоновые зерна. Фон β-треков тем не менее имеет место. Фоновые треки своим происхождением обязаны присутствию К40 в изделиях из стекла, С14 в желатине эмульсии и вторичным электронам от космических лучей. Треки, образовавшиеся в любой точке эмульсии и содержащие менее 70 зерен, связаны, вероятно, с С14; треки вторичных электронов от космических лучен обычно начинаются от трека другой заряженной частицы, проходившей через эмульсию.

Регрессия скрытого изображения

Процесс регрессии скрытого изображения обсужден в гл. 10. Скрытое изображение, образовавшееся в начале экспозиции, подвержено регрессии, особенно в присутствии окисляющих агентов и влажности. В трековой авторадиографии регрессия скрытого изображения проявляется в уменьшении числа зерен на единице длины трека; если же процесс регрессии достаточно интенсивен, по оставшимся зернам вообще трудно определить траекторию β-частицы.
Леви с сотр. [8] исследовала расположение зерен в β-треках в эмульсии Ilford G5 вплоть до энергий 400 кэв; обнаружено, что плотность зерен редко падает ниже величины 10 зерен на 25 мкм, даже в начальных участках треков частиц с энергией, близкой к верхней границе изученного диапазона энергий. Для Р32 плотность зерен не бывает ниже 7 на 25 мкм.
Поэтому, если обнаруживаются плотности зерен в треке ниже предсказываемой, следует предполагать наличие регрессии скрытого изображения. Такие «регрессированные» треки будут наблюдаться одновременно с нормальными, которые образовались в более поздний период экспозиции. Поэтому присутствие нормальных треков не может считаться доказательством отсутствия регрессии скрытого изображения; это предположение справедливо, лишь когда не обнаружено «репрессированных» треков.
Возможно, что при незначительной регрессии скрытого изображения, когда все «регрессированные» треки еще можно обнаружить, количество зарегистрированных треков не изменится; однако при наличии очевидных доказательств регрессии скрытого изображения не следует предполагать без дополнительного изучения, что потеря треков отсутствует.

Проблемы распознавания треков

Эти проблемы подробно уже обсуждались. В технически совершенном материале, имеющем достаточную плотность β-треков и низкий фон случайных зерен серебра, и при соответствующих условиях для микроскопического изучения сравнительно просто распознать и подсчитать β-треки. В нескольких случаях был проведен статистический анализ результатов измерений под микроскопом числа β-треков, выполненный сотрудниками, которые не имели опыта трековой авторадиографии, и при этом не обнаружено существенных различий. Даже в авторадиограммах хорошего качества всегда присутствуют такие конгломераты зерен серебра, которые могут быть приняты за трек, однако это явление дает лишь малый процент от общего числа треков.
Леви м Хегбен [17] показали, что вариабельность числа сосчитанных треков возрастает с повышением плотности треков. Это объясняется тем, что с увеличением частоты пересечений треков возрастает доля конгломератов зерен, которые могут быть интерпретированы различным образом. В качестве ориентира для выбора времени экспозиции и удельной активности следует считать, что на площади 500 мкм2 должно образоваться не более 8—10 треков для С14 или S35 и 12—16 треков для Р32.
Правильная интерпретация картины взаимного расположения треков очень облегчается в случае применения повторного разбухания эмульсии. После фиксирования, сушки и помещения в одну из обычных безводных гистологических сред эмульсионный слой становится значительно тоньше, чем он был во время экспозиции. Треки, которые в действительности скрещивались в эмульсии на разных уровнях, могут казаться пересекающимися в одной точке. Разбухание эмульсии до прежней толщины восстанавливает расстояние между треками и облегчает их идентификацию.
При некоторых толщинах эмульсионного слоя после обработки верхние несколько микронов слоя непригодны для исследования ввиду высокой плотности фоновых зерен, случайных царапин, частиц пыли и различных кристаллов. Добавочным преимуществом процесса восстановления толщины слоя перед микроскопическим исследованием является увеличение расстояния от биологического материала до этого полного артефактов верхнего слоя, что облегчает изучение эмульсии.

Выбор эмульсии

Эмульсия, предназначенная для β-трековой авторадиографии, должна обладать высокой чувствительностью, чтобы благодаря достаточному количеству зерен вдоль траектории β частицы трек был легко распознаваем. К этой категории среди эмульсий типа Ilford относятся только G5, К5 и L4. Достаточной чувствительностью обладает также эмульсия Easlinan- Kodak NTB-3.
Слой эмульсии невозможно просматривать на глубину более чем 20 мкм при работе по методу темного поля в проходящем свете, так как световой поток, рассеянный в эмульсии, интерферирует со светом, отраженным от зерен серебра на глубине более чем несколько микронов ниже поверхности. Поэтому зерна серебра должны быть достаточно большими, чтобы их было легко наблюдать в проходящем свете в условиях, с точки зрения микроскопического исследования далеких от идеальных.
Почти все публикации по технике исследования относятся к эмульсии Ilford G5; с эмульсией этого типа выполнены обширные исследования Леви с сотрудниками по характеристике β-треков. Поэтому, несмотря на возможность использования для исследований эмульсий типа К5 или NTB-3, предпочтение следует отдать эмульсии типа G5.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ТОЛСТЫХ СЛОЕВ ЭМУЛЬСИИ

Из обсуждения процесса обработки толстых эмульсионных слоев можно заключить, что трудности трековой авторадиографии все более усложняются по мере увеличения толщины эмульсии. Весьма заманчиво использовать возможно более тонкий слой эмульсии, не утрачивая в то же время ни одного из преимуществ способа.
Оптимальная толщина эмульсионного слоя зависит от экспериментального материала и энергии изотопа. Например, для случая среза или мазка, помещенных на предметное стекло и меченных С14 или S35, толщина эмульсии должна составлять 15—20 мкм. Такой толщины достаточно для регистрации почти всех, за исключением малого процента, треков. В подобной ситуации для Р32 является необходимой толщина 60 мкм. Если требуется суспендировать источники в эмульсии, например при исследовании меченых бактерий или морских водорослей, для изотопов С14 или S35 толщина слоя эмульсии под самым нижним и над самым верхним источниками должна составлять 20 мкм, а для Р32 — 60 мкм.
Весьма простым способом приготовления слоя эмульсии толщиной 20 мкм является модифицированная методика погружения [18]. Для приготовления более толстых слоев удобнее использовать методику нанесения с помощью пипетки на предметное стекло подогретой и разбавленной эмульсии. Если изучают источники, суспендированные в эмульсии, то первый слой эмульсии наносят на стекло, а затем высушивают. Далее несколько капель жидкой эмульсин, в которой были предварительно суспендированы меченые источники, наносят в центр стекла и также высушивают. В заключение пипеткой наносят второй эмульсионный слой и образуется «сандвич», в котором исследуемые источники находятся в тонком срединном слое.
Решающее значение для таких толстых эмульсий имеет их высушивание. До тех пор, пока оно полностью не завершено,, в более глубоких слоях, где как раз и расположен биологический материал, имеет место регрессия скрытого изображения. Если высушивание осуществляется недостаточно медленно и. плавно, вследствие появления напряжений внутри эмульсии может образоваться высокий фон случайных зерен.
Время экспонирования обычно значительно меньше по сравнению с используемыми в авторадиографии с оценкой плотности зерен. Оно редко превышает 48 ч.

ОБРАБОТКА ТОЛСТЫХ СЛОЕВ ЭМУЛЬСИИ

При обработке толстых слоев эмульсии требуется достаточна большое время, чтобы растворы продиффундировали на всю глубину эмульсии. Аналогично требуется и большее, чем для тонких слоев, время для удаления продуктов фиксации.

Например, в случае проявления слоев толщиной 60 мкм после погружения в проявитель при температуре 20°С (как это делается в случае тонких слоев) верхний слой эмульсии будет полностью проявлен, прежде чем проявитель проникнет на всю глубину эмульсии. Для эмульсий толщиной не более 30 мкм обычно бывает достаточно проявлять при более низкой температуре, чтобы увеличить время проявления по сравнению с временем проникновения. Для более толстых слоев удобнее осуществить проникновение проявителя в глубь эмульсии при температуре 5° С, при которой проявление идет очень медленно, а затем медленно повысить температуру эмульсии с таким расчетом, чтобы получить требуемое проявление. Если это повышение температуры эмульсии осуществить путем перемещения предметных стекол в проявитель с температурой, например, 20° С, то может возникнуть значительный градиент проявления, так как верхний слой нагреется быстрее глубинных. Во избежание появления этого градиента Хаузер [20] предлагает, как наиболее приемлемое, постепенное разбавление проявителя до температуры 20°. Таким образом, хотя верхний слой эмульсии и будет проявляться больше времени, чем глубокие слои, однако проявление проводится как бы с более разбавленными растворами. Требуется длительно промывать эмульсию после проявления, а также применять стоп-ванну, прекращающую проявление.
Фиксирование, также представляет собой проблему. В качестве грубого приближения можно принять, что время фиксирования возрастает как квадрат толщины эмульсии. Недавно материал, для фиксирования которого требовалось 4 ч, был приготовлен вдвое более толстым, чем предполагалось. Эта ошибка потребовала утомительной процедуры фиксации в течение 16 ч. К сожалению, кислые фиксажи, работающие более быстро, чем чисто гипосульфитные, не могут быть использованы для толстых слоев. Их длительное воздействие на эмульсию повреждает и даже может полностью удалить из нее проявленные зерна серебра. Наилучшим фиксирующим раствором является, по-видимому, раствор гипосульфита. Концентрация раствора не имеет решающего значения, поскольку существует широкий пик на кривой эффективности в диапазоне от 25 до 35%. Наилучшие результаты достигаются при механическом перемешивании большого объема фиксажа и добавлении при необходимости свежего раствора.
Промывка после фиксирования должна быть также продолжительной и тщательной.
Рекомендуется все стадии обработки проводить при горизонтальном положении предметных стекол и при постоянной температуре всех растворов несколько ниже 22° С. Если эти предосторожности не соблюдены, в дальнейшем эмульсия может повреждаться, в особенности в процессе фиксирования и высушивания.

МИКРОСКОПИЯ ТОЛСТЫХ СЛОЕВ ЭМУЛЬСИИ

Выше уже упоминалось о значении восстановления первичной толщины эмульсин. Для просмотра толстых эмульсионных слоев необходимо использовать проходящий свет и относительно большое увеличение. К сожалению, объективы, предназначенные для обычной микроскопии, редко обладают достаточно большими рабочими расстояниями, чтобы обеспечить просмотр глубинных слоев эмульсии с восстановленной толщиной. Большинство разновидностей микроскопов имеют специальные объективы для измерений с ядерными эмульсиями, такие, как, например, иммерсионные объективы Лейтц KSX53 и Х100.

Рис. 58. Микрофотография парафинового среза тонкой кишки мышц спустя 1 ч после инъекции сульфата S35 (Х1300).
На поверхности эмульсии обнаруживается множество артефактов, которые часто имеют вид мелких трещин и изломов, образующихся в процессе сушки.
Авторадиограмма приготовлена с помощью слоя эмульсии Ilford G5 толщиной 25 мкм. Видны β-треки, входящие в эмульсию вблизи поверхности ядер 3 соседних эпителиальных лимфоцитов. Можно видеть также другие участки треков, большая часть которых берет начало от высокорадиоактивной свободной поверхности клеток эпителия. Сравните с рис. 55, где тот же самый материал представлен с помощью методики авторадиографии по плотности зерен. Срез окрашен гематоксилином Гарриса и сфотографирован с помощью методики двойного экспонирования с объективом Лейтц Ультропак X100 [18].
Эти артефакты должны и могут быть исключены при изучении остальных слоев эмульсии, в особенности если проведено восстановление ее первоначальной толщины.

 Очень сложно осуществить фотографирование β-треков. Для четкого изучения зерен требуется большое увеличение, а трехмерная пространственная конфигурация треков затрудняет рассмотрение в одном положении объектива более нескольких зерен. Требуется просмотреть множество предметных стекол,

прежде чем удастся найти удобную конфигурацию трека, расположенную в одной фокальной плоскости. Иногда с целью увеличения вероятности обнаружения нескольких треков в одной фокальной плоскости можно провести экспонирование образца в течение промежутка времени, умышленно превышающего длительность экспозиции, оптимальную с точки зрения счета треков. Рис. 58 и 32 иллюстрируют такую картину, полученную с изотопами S35 и Р32.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ И ОБРАБОТКА АВТОРАДИОГРАММ С ТРЕКАМИ ЧАСТИЦ ИЗОТОПОВ С14 И S35

Приготовление авторадиограмм

Эмульсия; Ilford G5 в форме геля.
Безопасное освещение: Ilford S или Eastman-Kodak OS.
Условия в фотокомнате: температура 15,5—21,1°, относительная влажность 45—50%.
Материал: срезы или мазки, наклеенные на покрытые желатином предметные стекла.
Необходимое оборудование: термостатированная водяная баня; 1 мерный цилиндр на 50 мл; 1 мерный цилиндр на 25 мл; 1 стеклянная палочка; 1 пара зажимных пинцетов из пластмассы; установленная по горизонтальному спиртовому уровнемеру металлическая пластина, которую можно охлаждать, помещая на нее лед (см. рис. 57).

  1. С помощью черного карандаша сделать на мерном цилиндре емкостью 25 дм отметку, соответствующую объему 15 мл.
  2. Отлить в сосуд для погружения 4,8 мл дистиллированной воды и 0,2 мл глицерина.
  3. Поставить оба мерных цилиндра в водяную баню при температуре 43° С.
  4. При безопасном освещении с помощью пинцета перенести такое количество эмульсии G5 из основной посуды в мерный цилиндр емкостью 50 мл, чтобы после легкого потряхивания ее объем составил от 25 до 30 мл.
  5. Поместив мерный цилиндр емкостью 50 мл в водяную баню, дать эмульсии расплавиться в течение 10 мин, легко перемешивая ее стеклянной палочкой. Перемешивание должно быть медленным и без усилий со скоростью не более I об/сек.
  6. Держа мерный цилиндр емкостью 25 мл таким образом, чтобы была видна черная метка на уровне 15 мл, перелить в него расплавленную эмульсию из мерного цилиндра емкостью 50 мл до черной метки.
  7. Перелить отмеренные таким образом 15 мл расплавленной эмульсии в сосуд для погружения, в котором уже находятся дистиллированная вода и глицерин.
  8. Поместить сосуд для погружения в водяную баню на 2 мин, осторожно покачивая с целью полного перемешивания.
  9. Поставить сосуд для погружения в лабораторный стакан с дистиллированной водой при комнатной температуре. Окунуть чистое предметное стекло в эмульсию и затем переместить поближе к безопасному свету, чтобы убедиться, что перемешивание было полным и пузыри отсутствуют. Если эмульсия содержит много пузырей, то оставьте ее в покое в течение 1 мин, а затем окуните в эмульсию другое предметное стекло.
  10. Убедившись, что эмульсия перемешана вполне удовлетворительно и что пузыри отсутствуют, окуните предметные стекла с исследуемым биологическим материалом. После погружения предметного стекла в сосуд подержите его горизонтально срезом вверх, удалите эмульсию с нижней стороны стекла фильтровальной бумагой и поместите предметное стекло для высыхания на охлаждаемую металлическую пластину. Когда все предметные стекла будут перемещены на металлическую пластинку, а покрывающая их эмульсия застуденеет, уберите лед, дав возможность пластине постепенно приобрести комнатную температуру.
    11. Идеальные условия для сушки обеспечиваются при окружающей температуре 15,5—21,1°, относительной влажности 40—45% и легком потоке воздуха. Через 45 мин эмульсия должна затвердеть и приобрести гладкую поверхность. В процессе сушки безопасный свет выключают.
    12. Оставьте пластину на экспозицию в светонепроницаемом ящике при температуре 4° С.

Обработка авторадиограмм

  1. Приготовьте амидоловый проявитель по рецептуре и методике, описанным на стр. 247. Разбавьте его дистиллированной водой в отношении I : 2 в кювете для проявления и поместите ее в термостатированную водяную баню при температуре 17° С.
  2. При неактиничном освещении поместите предметные стекла, в основном горизонтально, в проявитель на 12—15 мин. Во время пребывания в проявителе ядерную эмульсию необходимо прикрыть от света безопасного фонаря.
  3. Перенесите предметные стекла в 1%-ный раствор уксусной кислоты на 2 мин.
  4. Переместите стекла в 30%-ный раствор гипосульфита на 20 мин, причем кювету следует осторожно покачивать. Предметные стекла на этой стадии должны полностью просветлеть.
  5. Затем стекла переместите в 10%-ный раствор гипосульфита на 20 мин, кювету необходимо осторожно покачивать.
  6. Промойте предметные стекла в медленном потоке воды в течение 40—60 мин.

Далее можно окрасить биологический материал. После, окрашивания пропитать в течение 20 мин предметные стекла 20%-ным раствором глицерина в чашке Петри. После удаления избытков поды с поверхности эмульсии срезы просветляются в глицерин - желатине или среде Фарранта.
Для получения авторадиограмм суспендированных источников, меченных С14 или S55, приготовьте по вышеописанной методике слой эмульсии на покрытом желатином предметном стекле и после высушивания нанесите пипеткой на стекло несколько капель суспензии исследуемых источников в жидкой расплавленной эмульсии. После затвердевания этого слоя нанесите сверху пипеткой 0,5 мл жидкой эмульсии по модифицированной методике, описанной ниже. Обработка ничем не отличается от обычной процедуры обработки эмульсионных слоев толщиной 60 мкм, которая описана ниже.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ И ОБРАБОТКА АВТОРАДИОГРАММ С ТРЕКАМИ ЧАСТИЦ Р33

Приготовление авторадиограмм

Эмульсия: Ilford G5 в форме геля.
Безопасное освещение: Ilford S или Eastman-Kodak О S.
Материал: срезы или мазки, нанесенные на покрытые желатином предметные стекла.
Условия в фотокомнате: температура 60—70° С, относительная влажность 45-50%.
Необходимое оборудование: водяная баня с термостатом; 1 мерный цилиндр на 50 мл, обрезанный на отметке 40 мл; 1 мерный цилиндр на 25 мл; стеклянная палочка; 1 пара пластмассовых зажимных пинцетов; 2 лабораторных стакана на 250 мл; несколько пастеровских пипеток; 1 мягкая кисточка; около 50 см резиновой трубки с коротким стеклянным наконечником на одном конце; 1 эксикатор. Кроме того, требуется определенное устройство для обеспечения потока сухого углекислого газа, а также горизонтальная поверхность с температурой в диапазоне изменения от 5 до 30° С. Пригодное для этих целей устройство показано на рис. 57. Оно состоит из металлической пластины, установленной на винтах и имеющей 55 см в длину и 17,5 см в ширину. К каждому ее концу присоединен небольшой контейнер из жесткой пластмассы. Остальная центральная часть пластины имеет съемную пластмассовую крышку, в которую с одного конца входит небольшая трубочка, а на другом конце в верхней части имеется небольшое вытяжное отверстие. Крышка может подсоединяться с помощью шланга к осушительной колбе, заполненной силикагелем, и далее к закрытому сосуду с твердой углекислотой. Крышку следует тщательно установить на пластинке, чтобы обеспечить необходимое заполнение ее углекислым газом, который образуется в результате возгонки в первом сосуде, осушается в колбе с силикагелем и поступает далее под крышку через входное отверстие.

  1. Установите сухую пластину в строго горизонтальном положении с помощью спиртового уровнемера и поместите на нее предметные стекла срезами или мазками вверх. Подогрейте пластину и стекла, поместив пластмассовые мешочки с горячей водой в контейнеры на концах пластины либо с помощью струи горячего воздуха от фена. Достаточно нагревание до 25—30° С.
  2. С помощью черного карандаша по стеклу сделайте отметку на делении 1 мл на каждой из пастеровских пипеток и присоедините одну из них к шлангу. Наполните лабораторные стаканы дистиллированной водой, поместите пипетки в один из них и поставьте оба стакана в водяную баню при температуре 43°.
  3. Перед использованием эмульсию необходимо разбавить водой в отношении 1:3 с добавлением 1% глицерина к объему смеси. Общее количество зависит от количества предметных стекол, которые должны быть покрыты: например, для покрытия 15 стекол нужно взять по 1 мл разбавленной эмульсии на стекло плюс еще 5 мл.
  4. Далее следуйте приемам, изложенным в пунктах 1—8 описанной выше методики трековой авторадиографии С11 и S35.
  5. После помещения на водяную баню сосуда для погружения с находящейся в нем расплавленной разбавленной эмульсией возьмите пастеровскую пипетку с присоединенным шлангом и мундштуком и, осторожно втягивая ртом, заполните ее эмульсией до отметки 1 мл.
  6. Вылейте раствор из пипетки на первое предметное стекло. Необходимо перед заполнением нагреть пипетку до 43° С, набрав в нее дистиллированную воду, и не слишком медлить с покрытием стекла, так как в противном случае возможно застудневание эмульсии в пипетке. Если пипетка опорожняется свободно, не следует ускорять опорожнение избыточным давлением; если делать это, то очень осторожно, так как в противном случае на поверхности стекла в эмульсии появятся пузыри. При наличии небольшого опыта операцию забора эмульсии можно выполнять очень аккуратно, не допуская возникновения пузырей.
  7. С помощью мягкой кисточки распределите эмульсию по всей поверхности предметного стекла. Если появляются пузыри, то кисточкой их можно убрать со среза или мазка. Если покрыта лишь половина стекла, то слой эмульсии будет слишком толст, что неприемлемо увеличивает время фиксирования.
  8. Ополосните пипетку несколько раз во втором лабораторном стакане с дистиллированной водой, который находится на водяной бане. Благодаря этому она перед покрытием следующего стекла станет чистой и теплой.
  9. Когда будут покрыты все предметные стекла, уберите пластмассовые мешочки с горячей водой из контейнеров и замените их мешочками со льдом. Для остудневания эмульсии оставьте стекла на охлаждаемой пластине в течение 20 мин.
  10. Замените еще раз мешочки со льдом мешочками с теплой водой, чтобы температура пластины поднялась до комнатной. Оставьте пластины сохнуть в слабом потоке воздуха. Идеальные условия создаются при температуре окружающего воздуха 18,3—21,1° С и относительной влажности 40—45%. Спустя 1,5—2 ч эмульсия затвердеет, и ее поверхность станет ровной. Во время сушки неактиничный свет должен отсутствовать.
  11. Когда эмульсия высохла, закройте пластину крышкой и в последующие 2 ч обеспечьте слабый поток сухого углекислого газа над поверхностью предметных стекол.
  12. Поместите стекла в светонепроницаемые ящики для экспонирования, которые с открытыми крышками поместите в эксикатор с сухим силикагелем и несколькими кусочками твердой углекислоты. Спустя 2—3 мин, не извлекая стекла из эксикатора, закройте ящики, заполнив их таким образом сухим углекислым газом.
  13. Оставьте на экспозицию при температуре 4° С.

Обработка авторадиограмм

  1. Приготовьте амидоловый проявитель согласно рецептуре и приемам, описанным на стр. 247.
  2. Поместите узкую кювету, наполненную свежеприготовленным концентрированным проявителем, в холодильник, установленный в фотокомнате так, чтобы температура раствора составляла не более 6° С.
  3. Разбавьте остальное количество проявителя дистиллированной водой в отношении. 1 : 2 и поместите его в кювете на водяную баню при температуре 20° С.
  4. При безопасном освещении поместите предметные стекла горизонтально в кювету с концентрированным проявителем, находящуюся в холодильнике, на 15 мин.
  5. Переместите стекла в кювету с разбавленным проявителем при температуре 20° С на 20 мин. При этом во время пребывания в проявителе их следует предохранять от воздействия неактиничного света.
  6. Поместите предметные стекла на 15 мин в 1%-ный раствор уксусной кислоты. Осторожно протрите несколько раз поверхность каждого стекла кусочком фильтровальной бумаги, смоченной уксусной кислотой.
  7. Далее поместите стекла в 30%-ный раствор гипосульфита, обеспечив его достаточное механическое перемешивание.
  8. Перенесите стекла на 1,5 ч в свежий перемешиваемый 30%-ный раствор гипосульфита, в котором они должны полностью просветлиться.
  9. Поместите стекла на 1,5 ч в 10%-ный раствор гипосульфита, который также перемешивается.
  10. Промойте стекла в слабом потоке проточной воды в течение 2 ч.

Окрашивание, восстановление первоначальной толщины путем пропитки в
20%-ном растворе глицерина и просветление осуществляются по методике, описанной выше, на стр. 259.
При проведении процедур, описанных в пп. 5—9, требуются большие объемы растворов: до 1 л раствора на 6 обрабатываемых предметных стекол. В течение проявления, фиксирования и промывки стекла должны находиться в горизонтальном положении.
Механическое перемешивание во время фиксирования должно осуществляться осторожно, причем следует обратить особое внимание на недопустимость повышения температуры раствора более 25° С.
Для приготовления авторадиограмм суспендированных источников, меченных Р32 по методике, описанной выше, на покрытую желатином поверхность предметного стекла с помощью пипетки наносят 1 мл эмульсин. После ее высыхания пипеткой отбирают несколько капель суспензии меченых источников в жидкой расплавленной эмульсии. Далее, образовавшийся после сушки «сандвич» покрывают 1 мл эмульсии. Высушенную пластинку во время нанесения второго и третьего слоев следует охлаждать.
Обработка эмульсионных слоев должна проводиться по описанной выше методике, за исключением увеличения продолжительности операции № 6 до 20 мин, соответственно требуется и большая длительность фиксирования. В операциях 7 или 8 требуется либо увеличение объемов растворов, либо их смена в каждой операции. Общая продолжительность операций 7 и 8 должна составить 6—6,5 ч. Операции 9 и 10 будут длиться соответственно 2—3 ч и 4 ч.
Даже в случае применения столь толстых слоев эмульсии нет необходимости в увеличении времени проявления.

Рис. 59. Возрастание числа зерен серебра в последних 75 мкм β-треков с увеличением времени проявления.
Время проявления, мин
А — среднее значение и статистическое рассеяние для 12 треков (при любом времени проявления). Треки зарегистрированы в эмульсии Ilford G5, обработанной амидоловым проявителем. Количество зерен в треках сначала быстро возрастает, а спустя примерно 25 мин достигает плато. После этого зерна продолжают увеличиваться, но спустя 40 мин количество фоновых зерен вне трека заметно выше, чем при времени проявления 25 мин.

Для рекомендуемого типа эмульсии Ilford 5 и выбранного амидолового проявителя в процессе проявления обнаруживается продолжительное плато, так что время проявления в операции 5 может варьировать в широких пределах — от 15 до 40 мин — без существенного изменения плотности зерен в β-треках (рис. 59). С увеличением времени обработки возрастает размер проявленных зерен в треках, а также плотность случайных зерен фона; поэтому следует выбирать продолжительность проявления, исходя из требований простоты распознавания β-треков в конкретных условиях эксперимента.



 
« Автоматизированный мониторинг больных сахарным диабетом детей и подростков   Актуальные проблемы низкорослости у детей »