Начало >> Статьи >> Архивы >> Авторадиография

Авторадиография с электронной микроскопией - Авторадиография

Оглавление
Авторадиография
Области применения авторадиографии
Радиоактивные изотопы
Авторадиография в сравнении с другими методами обнаружения ионизирующих излучений
Ядерные фотоэмульсии и фотографический процесс
Кристаллы бромистого серебра
Желатин
Скрытое изображение
Проявление скрытого изображения
Физическое проявление
Фиксирование эмульсии
Специальные методики
Цветные эмульсии
Воздействие ионизирующего излучения на ядерные эмульсии
Бета-частицы
Другие виды ионизирующего излучения
Разрешающая способность авторадиографии
Факторы, определяющие разрешающую способность зернистых авторадиограмм
Разрешение в электронномикроскопической авторадиографии
Разрешающая способность трековых авторадиограмм
Эффективность авторадиографии
Эффективность при электронномикроскопической авторадиографии
Эффективность трековой авторадиографии
Эффективность макроскопической авторадиографии
Соотношение между факторами, определяющими разрешение и эффективность
Фон авторадиограмм
Хемография
Облучение внешними источниками
Уничтожение фона
Измерение фона
Микроскопия и микрофотография авторадиограмм
Оптическая система для освещения в темном поле
Микрофотография зернистых авторадиограмм
Исследование в темном поле
Исследование и фотографирование трековых авторадиограмм
Относительные измерения радиоактивности
Перекрестные эффекты
Факторы связанные с эмульсией и влияющие на относительные измерения
Относительные измерения в трековой авторадиографии
Счет зерен и треков
Фотометрическая оценка плотности зерен
Выбор визуального или фотометрического метода счета зерен
Необходимость абсолютных измерений
Абсолютные измерения радиоактивности с помощью трековой авторадиографии
Планирование и осуществление авторадиографических исследований
Выбор эмульсии
Эксперименты с двумя изотопами
Освоение новой методики
Контрольные процедуры, необходимые для каждого эксперимента
Проектирование и оборудование темной комнаты
Гистологическая техника и авторадиография
Выбор способа гистологической фиксации
Методика приготовления гистологических срезов
Непроницаемые пленки
Приготовление авторадиограмм для микроскопии
Авторадиография растворимых радиоизотопов
Способы авторадиографии растворимого материала
Хемография и артефакты от давления
Количественные исследовани растворимых радиоактивных изотопов
Методика съемной эмульсии
Недостатки методики съемной эмульсии
Подробное описание методики  съемной эмульсии
Методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Факторы, влияющие на толщину эмульсионного слоя
Выбор подходящей толщины эмульсии
Оценка и описание методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Методика жидкой эмульсии для трековой авторадиографии
Авторадиография с электронной микроскопией
Ограничения современных методик
Детальное описание методик
Авторадиография макроскопических объектов
Авторадиография  в макроскопических образцах
Описание методик авторадиографии макроскопических объектов
Послесловие

Развитие электронной микроскопии значительно расширило сферу исследований в цитологии, позволив биологам наблюдать структуры, близкие к молекулярному уровню. Неизбежно должны были проявиться попытки связать методику авторадиографии с электронной микроскопией—попытки использовать пространственную точность и высокую разрешающую способность ядерных эмульсий так, чтобы можно было пометить все субклеточные структуры.
К сожалению, разрешение, которое можно получить с методикой авторадиографии, имеет физические границы. Эти границы частично определяются пробегом самих β-частиц, которые даже у таких изотопов с низкой энергией излучения, как тритий, очень близки к наименьшим расстояниям, различимым под электронным микроскопом.
Другим лимитирующим фактором для разрешения электронномикроскопической авторадиографии является природа фотографического процесса. Скрытый след, который оставляет в кристалле серебра β-частица, не обязательно повторяет путь этой частицы через кристалл, а соответствует какой-то чувствительной точке. Только в кристалле с очень небольшим диаметром скрытое изображение лежит очень близко к истинной траектории β-частицы. Поэтому для получения высокого разрешения требуется мелкозернистая ядерная эмульсия. Но в процессе формирования скрытого изображения требуется передача определенного количества энергии от β-частицы к электронам внутри кристалла.
Если величина кристалла меньше критического диаметра, то совершенно невероятно, что на таком коротком пути через кристалл β-частица потеряет достаточную энергию, чтобы создать скрытое изображение.
Существует большое несоответствие между разрешающей способностью электронного микроскопа, которая может быть порядка 10 А, и разрешающей способностью электронномикроскопической авторадиографии, составляющей при наилучших доступных в настоящее время методах около 700А. Маловероятно, что будущие улучшения в методике когда-либо снизят эту цифру до 100А.

Задачи, требующие более высокого разрешения, требуют применения совершенно других подходов, выходящих за пределы области использования ядерных эмульсий Мальмон [1], например, предложил использовать очень тонкие металлические пленки, чтобы обнаруживать тяжелые заряженные частицы, возникающие при нейтронном облучении биологических образцов.
В пределах этих ограничений авторадиография с электронной микроскопией остается очень ценной методикой. Разрешение 500 А уже в 10—20 раз лучше, чем то, которое обычно получается при световой микроскопии, и возможность сопоставить характер метки со структурами, видимыми под электронным микроскопом — мембранными системами, везикулами, митохондриями и т. д., — очень полезна, даже если разрешение меньше, чем у микроскопа.
Ликвир-Милвард [2] впервые сочетала авторадиографию с электронной микроскопией. Для наблюдения объекта она использовала β-радиоактивную метку и небольшое увеличение электронного микроскопа.
С тех пор усовершенствования в самих ядерных эмульсиях и технике их применения быстро прогрессировали. В 1961 г. Пелк и др. сообщили о методике, включавшей монтирование ультратонких срезов на формваровой пленке, которую натягивали под отверстием в пластикатовой пластинке. Затем на срезы пипеткой наносили тонкий слой жидкой эмульсии. Было установлено, что наилучшей для этой цели является эмульсия L4 со средним диаметром кристаллов около 1400А [3,4]. В 1962 г. Каро и Ван Туберген, также работавшие с этой эмульсией, предложили метод, в котором тонкую пленку или пузырек с эмульсией прикрепляли на проволочную петлю. Пленка застывала до желатинообразного состояния и затем ее наносили на срезы, которые были уже укреплены на своих сеточках [5]. В это же время Каро опубликовал глубокий анализ факторов, которые влияют на разрешение в электронномикроскопической авторадиографии [6|.
Для получения хороших монослоев эмульсии Кохлер и др. [7] предложили использовать центрифугирование. Дальнейшую реализацию этой идеи осуществили Дольман с сотр. [8].
Тем временем были выпущены новые эмульсии с меньшей величиной кристаллов, и в 1963 г. Гранбуле [9] описал авторадиографию с эмульсией Gevaert NUC 307, в которой средний диаметр кристаллов составлял 700А. Наименьший диаметр кристаллов по сообщению Салпетера и Бахмана [10] в эмульсии Eastman-Kodak ΝΤΕ находится в пределах 300—500 А.
Все названное ни в коей мере не завершает перечень исследований в области разработки методик авторадиографии. Мы хотели показать, что сейчас доступно несколько эмульсий и много методик их применения. Салпетер [11] представил прекрасное обсуждение проблем и методик электронномикроскопической авторадиографии.

РАЗРЕШЕНИЕ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ

Для получения наиболее высокого разрешения образец, каковым обычно является ультратонкий срез, должен быть по возможности более тонким, энергия излучения изотопа должна быть самой низкой, а срез должен находиться в непосредственном контакте с эмульсией. Сам слой эмульсии должен представлять собой плотноупакованный монослой кристаллов серебра, имеющих минимальный диаметр и высокую чувствительность. Хотя локализация проявленного зерна серебра не обязательно соответствует положению кристалла, из которого оно произошло, очевидно, что оно должно контактировать хотя бы в одной точке со скрытым изображением в родительском кристалле, и поэтому при процессах проявления, дающих мелкие зерна серебра, обеспечивается более высокое общее разрешение.
Соблюдение этих условий, дающих наилучшее разрешение, возможно не во всех экспериментальных ситуациях. Такие факторы, как возможное радиационное повреждение и пределы насыщения изучаемых клеточных механизмов, ограничивают ту концентрацию радиоактивного материала, которую можно внести в биологический объект. При толщине среза 500 А пли менее число распадов в день на квадратный микрон среза часто, к сожалению, невелико. Если, кроме того, принять во внимание относительно низкую эффективность монослоя кристаллов с малым диаметром, станет очевидным, что статистически достаточное количество зерен серебра будет получаться в приемлемые сроки экспозиции только при необычно высокой радиоактивности исследуемого материала.
Авторадиографист, использующий электронный микроскоп, часто оказывается перед проблемой выбора между низкой разрешающей способностью и недостаточным количеством зерен серебра.
Если соблюдаются все возможные условия для получения наилучшего разрешения, окончательная плотность зерен будет часто слишком низкой для приемлемого анализа. Поэтому авторадиография с высоким разрешением требует значительного внимания к проблеме получения возможно наибольшего выхода зерен серебра. Во многих случаях подходящая методика является компромиссом между требованиями этих двух факторов. Далее, при практически любой попытке улучшить разрешение путем уменьшения толщины источника или диаметра кристаллов серебра, необходимо искать способ повышения общей эффективности авторадиографии.

ВЫБОР ПОДХОДЯЩЕЙ МЕТОДИКИ

Доступные методики по получаемому эффекту подразделяют на две группы. Первая из них основывается на использовании эмульсии Ilford L 4.

Она имеет прекрасную рабочую характеристику и дает воспроизводимые результаты. Бахман и Салпетер [12] обратили внимание на то, что она относительно свободна от искажений скрытого изображения и хемографии. При среднем диаметре кристаллов в 1200—1400 А хорошо уплотненный монослой дает одно зерно серебра на каждые 12 электронов с энергией 10 кэв.

Рис. 60. Электронномикроскопическая авторадиограмма нейрона ив чувствительного ганглия тритона после включения гистидина-Н3 (Х1000). Авторадиограмма смонтирована на покрытой коллодием пластинке, на которую был нанесен монослой эмульсии Ilford L4 путем погружения. Проявитель Микродол X. Коллодиевую пленку сняли с пластинки после проявления и помещения на сеточку для изучения.
Чтобы проверить уровень и распределение полученных меток, эту же эмульсию, находящуюся на срезах толщиной 1 мкм, можно наблюдать в световом микроскопе. Методики применения эмульсии Ilford L4 для электронной микроскопии довольно просты и надежны, а эмульсия сохраняется при очень длительных сроках экспозиции. К сожалению, большая величина кристаллов означает, что разрешение лежит, вероятно, в пределах 1200—1800А. Рис. 60 и 61 иллюстрируют авторадиограммы, полученные с помощью этого метода.
В другой группе методик используют эмульсии Gevaert NUC 307 и Eastman-Kodak ΝΤΕ. При оптимальных условиях последняя эмульсия может дать разрешение 700—900 А.
Но этот выигрыш в разрешении достигается при утрате нескольких ценных качеств. Обе эти мелкозернистые эмульсии имеют репутацию непостоянных.

Рис. 61. Две электронномикроскопические авторадиограммы ядрышек из мезенхимальных клеток регенерирующих конечностей тритона после включения тимидина-Il·’ (Х28 000).
а — авторадиограмма, приготовленная с монослоем эмульсии Eastman-Kodak ΝΤΕ и проявленная в дектоле; б — авторадиограмма, приготовленная с монослоем эмульсии Ilford L4 и проявленная в физическом проявителе с фенилендиамином. Меньший размер проявленных гранул (б) создает впечатление большей точности. На самом деле разрешение (а) выше вследствие меньшего диаметра кристаллов у эмульсин NTB.
Чувствительность их варьирует от одной партии к другой; и действительно, эмульсия ΝΤΕ в последующих партиях оказалась не такой чувствительной, как в первоначальной экспериментальной партии, о которой писали Салпетер и Бахман [13]. Чувствительность се, вероятно, ниже, чем эмульсии Ilford L 4, несмотря на специальную обработку, такую, как покрытие золотом, производимое в процессе проявления. Эти эмульсии более склонны к регрессии скрытого изображения и хемографии. Длительность экспозиции для ΝΤΕ ограничивается тем, что через 12 недель быстро возникает спонтанный фон. На рис. 62 и 63 представлены изображения, которые можно получить с помощью эмульсии ΝΤΕ.
Несомненно, что любому исследователю, начинающему заниматься электронномикроскопической авторадиографией, первое время необходимо пользоваться относительно простой методикой и эмульсией Ilford L 4. По-видимому, хороша мысль создать такую стандартную методику, которую можно было бы применять сначала в любой экспериментальной ситуации. При гораздо меньшей затрате энергии она даст больше информации, чем можно получить с эмульсией ΝΤΕ. Методики, использующие эмульсию ΝΤΕ, необходимо применять тогда, когда решено добиться преимущества путем усиления разрешения, и тогда, когда авторадиограммы с эмульсией L4 показывают, что имеются приемлемые шансы получить адекватный выход зерен серебра при реально возможных сроках экспозиции.

Рис. 62. Плотный монослон кристаллов в эмульсии Eastman-Kodak ΝΤΕ, видимый под электронным микроскопом. Такой слой имеет серебристый или бледнозолотистый цвет и является идеальным для получения высокого разрешения (X 15 000).
Конфликт между разрешением и выходом зерен иллюстрируют эксперименты 1141 по фосфорилированию ацетилхолинэстеразы с диизопропилфторфосфатом, меченным тритием. Применение эмульсии L4 дало неплохие результаты, хотя разрешение было относительно низким. Даже при этой методике уровень метки находился на самой границе приемлемого обнаружения. Получение высокого разрешения с эмульсией Eastman-Kodak ΝΤΕ стало возможным с тех пор, как стал доступен диизопропилфторфосфат с высокой удельной активностью. На срезах толщиной 1000 А активность составила 1,3 расп/мкм3 за 10 дней экспозиции.

С помощью эмульсии Ilford L4 было бы очень трудно уловить активности более низкие, чем эта: в исследованиях с высоким разрешением на срезах толщиной 500 А и эмульсией ΝΤΕ для получения достаточного для анализа количества зерен было бы необходимо увеличить активность ПОЧТИ В 5 раз.


Рис. 63. Электронномикроскопическая авторадиограмма части мезенхимальной клетки тритона после включения тимидина-Н3 (Х36 000).
Авторадиограмма приготовлена с монослоем эмульсии Eastman- Kodak ΝΤΕ— таким, как на рис. 62, и с целью получения высокого разрешения контрастирован золотом и проявлен в проявителе с метол-аскорбиновой кислотой. Отмечается хороший контраст. который дает серебристый оттенок, несмотря на тонкий срез. Разрешение авторадиограммы около 600 А.

При выборе подходящей методики следует иметь в виду, что каждые из предложенных в литературе методов способен дать удовлетворительные результаты. Представленные здесь методики имеют явное преимущество в смысле простоты и воспроизводимости. Однако ясно, что они не являются единственными. Методика Нелка с соавторами 13, 4] относительно проста; ее главный недостаток состоит в том, что очень трудно создать такие устойчивые и одинаковые монослои эмульсин на тонкой формваровой мембране, которые не разрушались бы при проводке через реактивы, экспонировании и проявлении.. Петлевой метод Каро и Ван Тубергена [5] применяют довольно широко, но он очень продолжителен. Тонкие пленки эмульсии часто рвутся при остудневании, и на свету в застывших пленках видны завихрения и полосы, их структура не гомогенна. Эта методика включает также экспонирование в присутствии металлической сетки, которая поддерживает срез в электронном микроскопе. Бахман и Салпетер [12] обратили внимание на конгломерацию зерен серебра, которая может происходить вдоль полосок сетки; следует также учитывать возможность хемографии, вызванной сеткой, хотя наличие срезов обеспечивает некоторую защиту от реакции между сеточкой и эмульсией. Хэй и Ревел [15] разработали простую методику погружения после прикрепления сеточек и срезов к стеклу микроскопа; однако трудно добиться ровных монослоев на неровной, поверхности сеточки; кроме того, могут происходить склеивание зерен и хемография.
Методика, которая может быть рекомендована для получения очень высокого разрешения, основывается на использовании эмульсии Kodak ΝΤΕ. Во многих отношениях с ней сходна эмульсия Gevaert NUC 307, но она имеет несколько большую величину кристаллов. Ее использование не имеет достаточного преимущества перед эмульсией ΝΤΕ, чтобы игнорировать этот недостаток. Детальное описание ее применения в электронномикроскопической авторадиографии дано Гранбуле [9] и Юнгом и Коприва [16].
Очевидно, что авторадиография в сочетании с электронной микроскопией является сложным делом, и для получения наилучших результатов следует рассмотреть не только нанесение слоя эмульсии, но и весь процесс приготовления препарата и окраски. Работы [10, 12, 17] представляют наилучший образец того, с чего следует начинать, и служат основой для описанных ниже методик.
Ленты ультратонких срезов (если необходимо высокое разрешение, плавающие на воде срезы в отраженном свете должны иметь серебристый или сероватый цвет, и золотистый, если радиоактивность будет низкой) монтируются на чистых тонких пластинах, покрытых тонкой пленкой формвара или поливинилхлорида. Затем срезы окрашивают, например уранилацетатом, с последующей обработкой лимоннокислым свинцом [18], и покрывают слоем углерода 50—60 А. Этот тонкий углеродный слой выполняет двойную функцию, защищая эмульсию от хемографии и препятствуя окрашиванию при последующих стадиях авторадиографии. Хотя углеродный слой должен оказывать лимитирующее влияние на разрешение авторадиограммы, окрашенные таким образом срезы в дальнейшем становятся более контрастными, чем окрашенные после авторадиографии через эмульсию. Получение достаточного контраста может стать проблемой при очень тонких срезах, рассматриваемых в присутствии формваровой пленки и тонкого слоя желатина. Некоторые авторы намеренно растворяли желатин после авторадиографии и перед окрашиванием [19, 20], но при этой процедуре есть риск сместить зерна серебра.

Рис. 64. Схема, показывающая толщину в А, которой соответствует разная цветовая интерференция срезов и эмульсии.
Монослой эмульсии Eastman-Kodak ΝΤΕ имеет серебристый или бледно-золотистый оттенок: монослой эмульсии Ilford L4 — пурпурный [12].
Пластинка с помещенными на ней срезами представляет после углеродного покрытия очень однородную поверхность, так что нанести на нее монослой серебряных кристаллов относительно просто. Для эмульсии Ilford L4 достаточно погрузить пластинку в разбавленную растворенную эмульсию и поставить ее вертикально сушиться. Эмпирически подбирая концентрацию эмульсии, можно покрыть одну треть пластинки слоем, который при дневном свете имеет пурпурный оттенок (рис. 64). Бахман и Салпетер провели калибровку таких оттенков с помощью интерферометра и установили, что слой толщиной 1500 А имеет пурпурный цвет, соответствующий монослою эмульсии Ilford L4. Когда условия погружения, дающие необходимую цветную интерференцию в требуемой части пластинки, установлены, таким же образом можно погружать и экспериментальные пластинки.

Эмульсия Kodak ΝΤΕ имеет настолько высокое содержание зерен серебра, что дает плотный монослой кристаллов. Перед тем как приготовить нужное разбавление для покрытия срезов, кристаллы серебра следует сконцентрировать с помощью центрифугирования. Конечный объем эмульсии ΝΤΕ обычно довольно мал, так что более удобно наносить ее на срезы с помощью нагретой медицинской капельницы. Как и для эмульсии Ilford L4, нужное разбавление, при котором образуется монослой, определяют эмпирически, путем наблюдения цветной интерференции на пробных пластинках, вынесенных из темной комнаты. Для эмульсии ΝΤΕ удовлетворительный слой имеет оттенок от серебристого до бледно-золотистого.
Вначале желательно проверить образованные слои эмульсии непосредственно под электронным микроскопом. Идеально кристаллы должны располагаться плотно, но не наслаиваться друг на друга. Если кристаллы располагаются неплотно и отделены промежутками разного размера, они могут, как показали Бахман и Салпетер, подвергаться сильнейшему перемещению при погружении в воду. Такой слой пропускает проявитель и это может приводить к нежелательным артефактам.
После тщательного высушивания необходимо экспонировать препараты в атмосфере, лишенной кислорода, чтобы свести к минимуму регрессию скрытого изображения. Для этой цели используют азот, гелий и двуокись углерода.
Простейшим проявителем для эмульсии L4 является Микродол X, который дает типичную картину зерен серебра. Каро и Ван Тубергеи [5] предложили метод с фенилендиамином, так называемым физическим проявителем, который дает более мелкие, напоминающие по форме запятые, зерна серебра. Воспроизведение изображений при использовании этого метода хуже, чем в случае Микродола X, но разрешение лучше (см. рис. 19).
Поскольку единственным оправданием для использования эмульсии ΝΤΕ является ее высокая разрешающая способность, нет смысла стремиться к получению при ее проявлении больших зерен. Усиление скрытого изображения обработкой препаратами золота гарантирует возможность наблюдения скрытого изображения на уровне или даже ниже обычного уровня порога для проявления. Оно должно сопровождаться проявлением в смеси метола с аскорбиновой кислотой, предложенной в работе [10].

Если пластинки погружают в 1%-ную уксусную кислоту, промывают и высушивают после проявления в проявителе Дектол или метол-аскорбиновой кислоте, их можно вынести на свет и отметить цвет эмульсии над срезом перед фиксацией. Это не повредит авторадиограмме. Однако Микродол X и особенно такие физические проявители, как фенилендиамин, связывают нефиксированные кристаллы серебра, и цветовые
оттенки на этой стадии не будут отражать толщины эмульсии во время экспонирования.
Конечной стадией после фиксации и промывки является перенос коллодиевой или поливинилхлоридной пленки с пластикатовой пластинки на поверхность дистиллированной воды. Пока срезы находятся на пленке, на них можно поместить сеточки, и пленку со срезами, эмульсией и сеточками достают из воды и подсушивают.



 
« Автоматизированный мониторинг больных сахарным диабетом детей и подростков   Актуальные проблемы низкорослости у детей »