Начало >> Статьи >> Архивы >> Авторадиография

Авторадиография макроскопических объектов - Авторадиография

Оглавление
Авторадиография
Области применения авторадиографии
Радиоактивные изотопы
Авторадиография в сравнении с другими методами обнаружения ионизирующих излучений
Ядерные фотоэмульсии и фотографический процесс
Кристаллы бромистого серебра
Желатин
Скрытое изображение
Проявление скрытого изображения
Физическое проявление
Фиксирование эмульсии
Специальные методики
Цветные эмульсии
Воздействие ионизирующего излучения на ядерные эмульсии
Бета-частицы
Другие виды ионизирующего излучения
Разрешающая способность авторадиографии
Факторы, определяющие разрешающую способность зернистых авторадиограмм
Разрешение в электронномикроскопической авторадиографии
Разрешающая способность трековых авторадиограмм
Эффективность авторадиографии
Эффективность при электронномикроскопической авторадиографии
Эффективность трековой авторадиографии
Эффективность макроскопической авторадиографии
Соотношение между факторами, определяющими разрешение и эффективность
Фон авторадиограмм
Хемография
Облучение внешними источниками
Уничтожение фона
Измерение фона
Микроскопия и микрофотография авторадиограмм
Оптическая система для освещения в темном поле
Микрофотография зернистых авторадиограмм
Исследование в темном поле
Исследование и фотографирование трековых авторадиограмм
Относительные измерения радиоактивности
Перекрестные эффекты
Факторы связанные с эмульсией и влияющие на относительные измерения
Относительные измерения в трековой авторадиографии
Счет зерен и треков
Фотометрическая оценка плотности зерен
Выбор визуального или фотометрического метода счета зерен
Необходимость абсолютных измерений
Абсолютные измерения радиоактивности с помощью трековой авторадиографии
Планирование и осуществление авторадиографических исследований
Выбор эмульсии
Эксперименты с двумя изотопами
Освоение новой методики
Контрольные процедуры, необходимые для каждого эксперимента
Проектирование и оборудование темной комнаты
Гистологическая техника и авторадиография
Выбор способа гистологической фиксации
Методика приготовления гистологических срезов
Непроницаемые пленки
Приготовление авторадиограмм для микроскопии
Авторадиография растворимых радиоизотопов
Способы авторадиографии растворимого материала
Хемография и артефакты от давления
Количественные исследовани растворимых радиоактивных изотопов
Методика съемной эмульсии
Недостатки методики съемной эмульсии
Подробное описание методики  съемной эмульсии
Методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Факторы, влияющие на толщину эмульсионного слоя
Выбор подходящей толщины эмульсии
Оценка и описание методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Методика жидкой эмульсии для трековой авторадиографии
Авторадиография с электронной микроскопией
Ограничения современных методик
Детальное описание методик
Авторадиография макроскопических объектов
Авторадиография  в макроскопических образцах
Описание методик авторадиографии макроскопических объектов
Послесловие

Автрорадиографию часто используют для изучения распределения радиоактивных веществ в относительно крупных образцах. Примерами могут служить авторадиографические исследования костей [1], срезов всего тела животного или целого мозга [2] и образцов, получаемых с помощью различных методик химического разделения, таких, как хроматограммы, электрофореграммы на крахмальном геле [3] и реакции преципитации [4].
В любом случае, когда интересует распределение радиоактивности между пространственно разделенными компонентами, авторадиография представляет собой весьма удобную и простую методику определения.
Не существует принципиальных различий в приготовлении авторадиограмм для просмотра невооруженным глазом или для исследования под микроскопом. Геометрические факторы, оказывающие влияние на эффективность и разрешение, так же как и причины возникновения фона и источники артефактов, общие для обоих случаев.
Единственное различие, которое возникает при авторадиографии больших образцов, определяется условиями эксперимента. Требуемое разрешение обычно измеряется в миллиметрах, а не в микронах. Присутствие радиоактивности регистрируется по почернению пленки, а не по плотности расположения отдельных зерен серебра. Количественное измерение радиоактивности больших образцов с помощью электронных счетчиков импульсов технически намного проще, чем исследование источника клеточных размеров.
Например, для выделения радиоактивных участков на хемограмме с целью дальнейшего измерения активности сцинтилляционным методом можно использовать счетчик Гейгера с небольшим отверстием, помещаемый непосредственно над поверхностью образца, а определение содержания метки в органах трупа животного, которое было выявлено путем авторадиографии всего тела, лучше проводить непосредственной радиометрией иссеченных органов.

С помощью макроскопической авторадиографии, как правило, осуществляется быстрое и простое распознавание распределения радиоактивности между относительно крупными участками. В этих условиях эмульсии для рентгеновских пленок имеют несколько важных преимуществ перед ядерными, используемыми для приготовления авторадиограмм применительно к световой и электронной микроскопии. Последние эмульсии имеют небольшой размер кристаллов и, следовательно, небольшую величину проявленных зерен. Хотя их эффективность в смысле числа восстановленных зерен на одну β-частицу выше, для создания почернения эмульсии, определяемого невооруженным глазом, необходима очень высокая плотность восстановленных зерен. Диаметр кристаллов рентгеновских эмульсий на порядок больше, чем в эмульсиях для ядерных исследований.
Поэтому небольшое число восстановленных зерен на единицу площади дает распознаваемое почернение. Если за эффективность макроскопической авторадиографии принять оптическую плотность почернения слоя эмульсии определенной толщины при воздействии заданной дозы излучения, то можно сказать, что эффективность рентгеновских эмульсий во много раз больше, чем ядерных.
Применение рентгеновских пленок для целей макроскопической авторадиографии имеет много преимуществ. Пленки характеризуются весьма постоянной толщиной и чувствительностью эмульсии, достаточно продолжительным сроком хранения до появления фона, заметно снижающего их пригодность, и, наконец, оптимальными условиями проявления, обычно рекомендуемыми фабрикой.
Исследуемый образец должен иметь по возможности плоскую поверхность, обеспечивающую хороший контакт с пленкой. В случае хроматограмм это легко осуществить. Плотные образцы часто могут быть разрезаны, сточены или уплощены тем или иным способом. Неправильные поверхности, которые не могут быть обработаны с целью придания им удобной формы, можно покрыть расплавленной эмульсией.
Образцы, меченные тритием, представляют в некотором роде особый случай. Самопоглощение в образце снижает общую эффективность авторадиографии, которая еще больше уменьшается вследствие неизбежного образования пузырьков воздуха между источником и эмульсией при простом прикладывании образца к пленке. Предпринимались многочисленные попытки улучшить эффективность авторадиографии тритиевых образцов; позднее они будут рассмотрены в деталях. Каждая из предложенных методик имела свои недостатки, и все они были технически более сложными, чем простое наложение рентгеновской пленки. С другой стороны, даже наиболее удачные методики не дают достаточного увеличения эффективности. Возможно, только в немногих специальных случаях какая-нибудь из этих методик обнаружит значительные преимущества по сравнению с простым наложением пленки.

АВТОРАДИОГРАФИЯ ОБРАЗЦОВ С ПЛОСКОЙ ПОВЕРХНОСТЬЮ

Приготовление образца

Поскольку хроматограммы являются плоскими поверхностями, то в смысле геометрии опыта никаких осложнений не возникает. Однако некоторые затруднения возникают при их приготовлении. В большинстве случаев необходимо 10 мг соединения, чтобы можно было идентифицировать соответствующий участок с помощью окраски или спектрофотометрии; при высокой удельной активности значительное почернение на авторадиограмме может дать намного меньшее количество вещества. При хроматографии микрограммовых образцов [5] могут возникать артефакты от таких причин, как образование комплексных соединений с компонентами бумаги или даже со следами металлов. На качество хроматограммы может влиять тщательность высушивания пятна. Очевидно, полезно подобрать такие условия хроматографии, которые давали бы наиболее концентрированное пятно: при той же общей радиоактивности почернение над ним будет более интенсивное.
Тонкослойные хроматограммы с двуокисью кремния или алюминием в качестве неподвижной фазы легко осыпаются и повреждаются при манипуляциях в темной комнате в процессе приготовления авторадиограмм. Напыление на свету одним из доступных материалов, таким, как аэрозоль поливинилхлорида, делает хроматограммы намного более устойчивыми без значительного увеличения самопоглощения. Следует проследить, чтобы растворитель полностью испарился до нанесения эмульсии: если этим пренебречь, то возможна утрата чувствительности эмульсией.
Биологические объекты лучше всего готовить для авторадиографии путем приготовления срезов. Изучение распределения лекарств и гормонов во всем теле животных обычно основывается на технике, описанной Ульбергом [6—8]. Объект, которым может быть целая мышь, быстро замораживают и укрепляют на столике большого микротома. Прозрачную липкую ленту прикладывают к поверхности блока и затем нарезают срез. Температуру блока поддерживают примерно —10° С. Срез прилипает к лепте, и его можно легко снять ножом. Ульберг установил, что таким образом с целой тушки мыши можно приготовить срезы толщиной до 2 мкм. Срезы высушивают в замороженном состоянии и подвергают авторадиографии путем прикладывания их к рентгеновской пленке. После экспонирования и отделения от пленки их можно фиксировать и окрашивать. Ткань сохраняют в замороженном состоянии до конца экспозиции. Эта методика позволяет оперативно исследовать сразу многие органы и имеет дополнительное преимущество в том, что потеря или перемещение растворимых компонентов сводится к минимуму.  Она позволяет получить большое количество информации по таким показателям, как, например, степень проникновения лекарственных препаратов в головной мозг или места концентрирования лекарств и гормонов (рис. 66) [2].

Рис. 66. Авторадиограмма тотального среза тела беременной мыши через 5 мин после введения глюкозы-С14.

1— головной мозг; 2 — скелетные мышцы; 3 — легкие; 4— желудок; 5 — почка; 6 — плацента; 7 — головной мозг плода; 8 — кость плода; 9— печень; 10— миокард; 11 — глаз; 12 — обонятельные волоски. Авторадиограмма приготовлена наложением замороженного среза на рентгеновскую пленку. Белые участки соответствуют высокой плотности зерен серебра. Видно накопление радиоактивности в головном мозгу матери, но не плода, в миокарде и печени матери и в костях плода.
Очень плотные объекты, такие, как кости или зубы, можно распилить для получения плоской поверхности или готовить шлиф, хотя, если они не слишком массивны, можно попытаться получить срезы. При использовании изотопов с относительно небольшой энергией излучения, таких, как Н3 или S30, приготовляют шлиф половины кости, который накладывают затем на рентгеновскую пленку. При этом получают авторадиограммы с достаточно хорошим разрешением. В случае применения изотопов с более высокой энергией лучшее разрешение можно получить при использовании срезов, а не шлифов половины кости.
В некоторых случаях нет необходимости в приготовлении плоской поверхности образца. Внутреннюю стенку трубчатых образований можно иногда исследовать путем введения свернутой рулоном рентгеновской пленки, которая в некоторых случаях достаточно хорошо прилегает к поверхности с небольшой степенью кривизны.
Независимо от способа приготовления образца для авторадиографии должны быть приняты меры, препятствующие потере или перемещению радиоактивного материала.

Условия авторадиографии

Следует использовать высокочувствительные рентгеновские пленки. Высокая эффективность обычно более важна, чем отличное разрешение, поэтому пленки с двусторонним покрытием более предпочтительны, чем с односторонним. Любая прослойка между образцом и пленкой будет уменьшать общую чувствительность и ухудшать разрешение, так что лучше пленку непосредственно прикладывать к образцу, если есть уверенность в отсутствии хемографии. Эффективность часто может быть несколько улучшена путем помещения слоя материала с высокой плотностью и, следовательно, хорошей отражающей способностью на противоположную по отношению к образцу поверхность пленки. Прямое давление на пленку с целью более плотного прижатия ее к образцу неопасно, если оно не чрезмерно и если на поверхности образца нет неровностей, приводящих к неравномерному распределению давления. Скользящие усилия необходимо исключить, так как они являются причиной царапин на эмульсии. Ричардсон с соавт. [9] описал очень простую кассету для создания небольшого, весьма равномерно распределяющегося давления в течение экспозиции.
Для проявления и фиксации рентгеновскую пленку отделяют от образца. Обычно при сопоставлении пленки и образца для идентификации меченых участков возникают некоторые затруднения. В таких случаях может помочь маркировка образца радиоактивными чернилами до начала экспозиции. Проявление и фиксацию легче выполнить, если помещать пленку в специальных держателях, используемых во всех больничных рентгеновских отделениях.
Тзук с соавторами [5] опубликовали график для определения экспозиции при авторадиографии бумажных хроматограмм, содержащих С14 (рис. 67). Ясно, что размер пятен будет влиять на минимальное время экспозиции, необходимое для получения авторадиограммы. Почернение, слишком слабое, чтобы отличить его от фона, иногда можно определить путем наклонения пленки и осмотра ее под острым углом. Это объясняется суперпозицией почернения соседних участков, вследствие чего слабый сигнал, лишь в небольшой степени превышающий фон, может быть усилен до хорошо определяемого уровня.
Можно попытаться определить приблизительную относительную активность двух источников путем простого просмотра пленок в стандартных условиях, и при достаточном опыте такая визуальная количественная оценка может быть достаточно точной [5]· Можно измерить интенсивность почернения пленки микроденситометром, но при необходимости точной количественной оценки лучше измерять активность самого источника.
Точно так же, как при авторадиографии гистологического материала с помощью ядерных эмульсий, при контакте крупных образцов с рентгеновской пленкой возможно появление артефактов вследствие хемографии. Рис. 23 иллюстрирует случай позитивной и негативной хемографии при авторадиографии бедренной кости человека. Ричардсон с соавт. [9| и Чемберлен с соавт. [10] обращают внимание на этот артефакт даже при авторадиографии относительно чистого материала на хроматограммах. Хемографию следует всегда иметь в виду и, если возможно, исключить ее путем экспонирования не содержащих меченого материала, но сходных во всех других отношениях срезов с обычной и засвеченной эмульсией. Если хемография установлена, обычно достаточно нанести тонкий слой инертного материала между образцом и пленкой.

Рис. 67. Зависимость времени экспонирования, необходимого для получения хорошо заметного изображения, от активности С14 при авторадиографии хроматограмм с помощью рентгеновской пленки [5].
В других случаях образец можно покрыть перед экспонированием тонкой пленкой ПВХ или нитроцеллюлозы. Интенсивность хемографии может быть снижена экспонированием при низкой температуре, что, по-видимому, обусловливает успешность авторадиографии целых животных по методике Ульберга, когда можно было бы ожидать, что авторадиография нефиксированной ткани доставит массу затруднений.



 
« Автоматизированный мониторинг больных сахарным диабетом детей и подростков   Актуальные проблемы низкорослости у детей »