Начало >> Статьи >> Архивы >> Авторадиография

Проявление скрытого изображения - Авторадиография

Оглавление
Авторадиография
Области применения авторадиографии
Радиоактивные изотопы
Авторадиография в сравнении с другими методами обнаружения ионизирующих излучений
Ядерные фотоэмульсии и фотографический процесс
Кристаллы бромистого серебра
Желатин
Скрытое изображение
Проявление скрытого изображения
Физическое проявление
Фиксирование эмульсии
Специальные методики
Цветные эмульсии
Воздействие ионизирующего излучения на ядерные эмульсии
Бета-частицы
Другие виды ионизирующего излучения
Разрешающая способность авторадиографии
Факторы, определяющие разрешающую способность зернистых авторадиограмм
Разрешение в электронномикроскопической авторадиографии
Разрешающая способность трековых авторадиограмм
Эффективность авторадиографии
Эффективность при электронномикроскопической авторадиографии
Эффективность трековой авторадиографии
Эффективность макроскопической авторадиографии
Соотношение между факторами, определяющими разрешение и эффективность
Фон авторадиограмм
Хемография
Облучение внешними источниками
Уничтожение фона
Измерение фона
Микроскопия и микрофотография авторадиограмм
Оптическая система для освещения в темном поле
Микрофотография зернистых авторадиограмм
Исследование в темном поле
Исследование и фотографирование трековых авторадиограмм
Относительные измерения радиоактивности
Перекрестные эффекты
Факторы связанные с эмульсией и влияющие на относительные измерения
Относительные измерения в трековой авторадиографии
Счет зерен и треков
Фотометрическая оценка плотности зерен
Выбор визуального или фотометрического метода счета зерен
Необходимость абсолютных измерений
Абсолютные измерения радиоактивности с помощью трековой авторадиографии
Планирование и осуществление авторадиографических исследований
Выбор эмульсии
Эксперименты с двумя изотопами
Освоение новой методики
Контрольные процедуры, необходимые для каждого эксперимента
Проектирование и оборудование темной комнаты
Гистологическая техника и авторадиография
Выбор способа гистологической фиксации
Методика приготовления гистологических срезов
Непроницаемые пленки
Приготовление авторадиограмм для микроскопии
Авторадиография растворимых радиоизотопов
Способы авторадиографии растворимого материала
Хемография и артефакты от давления
Количественные исследовани растворимых радиоактивных изотопов
Методика съемной эмульсии
Недостатки методики съемной эмульсии
Подробное описание методики  съемной эмульсии
Методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Факторы, влияющие на толщину эмульсионного слоя
Выбор подходящей толщины эмульсии
Оценка и описание методики жидкой эмульсии для авторадиографии с оценкой плотности зерен
Методика жидкой эмульсии для трековой авторадиографии
Авторадиография с электронной микроскопией
Ограничения современных методик
Детальное описание методик
Авторадиография макроскопических объектов
Авторадиография  в макроскопических образцах
Описание методик авторадиографии макроскопических объектов
Послесловие

Существует два основных метода проявления скрытого изображения; первый, наиболее широко используемый, — химическое проявление, второй — физическое проявление (он будет кратко описан на стр. 29).
Принцип работы всех химических проявителей одинаков. Все они являются восстановителями, обладая обычно достаточным восстановительным потенциалом в слабощелочной среде. Поскольку процесс проявления приводит к образованию бромистоводородной кислоты, в растворы проявителя обычно вводят некоторые буферные добавки для поддержания оптимального· значения pH.
Почти любое вещество с соответствующими восстанавливающими свойствами будет работать как проявитель. Раньше использовали сахар, гемоглобин и даже старое бургундское вино [6]. Обычно проявители содержат гидрохинон, метол или амидол. При использовании гидрохинона образуются толстые нити серебра, в то время как амидол и метол дают тонкие нити. Парафенилендиамин — вещество, которое также непосредственно воздействует на кристаллы бромистого серебра, но одновременно и как проявитель, и как фиксирующее вещество. Таким образом, получаются очень мелкие зерна. Вероятно, при медленном проявлении скрытого изображения одновременно также идет травление поверхности кристалла, что приводит в конце концов к отделению скрытого изображения от остальных кристаллов бромистого серебра и предотвращению дальнейшего роста зерен.
Наши недавние лабораторные исследования навели на мысль, что выбор проявителя влияет на чувствительность эмульсии к регрессии скрытого изображения над биологическим образцом. Такая негативная хемография связана с диффузией веществ из образца и их химическим действием на скрытое изображение в соседних кристаллах бромистого серебра. Амидол — очень мягкодействующий реактив, и его действие ограничено проявлением скрытого изображения на поверхности кристаллов. Метол действует и на более глубинные участки. Скрытое изображение, образованное заряженными частицами, обычно расположено где-то внутри кристалла, тогда как эффект негативной хемографии, видимо, связан в большей степени с поверхностью кристалла. Поэтому можно ожидать, что эмульсии, обработанные амидоловым проявителем, будут более чувствительны к артефактам, чем в случае их обработки проявителем, содержащим метол.
Способность амидола проявлять ядерные эмульсии в очень слабых спиртовых растворах — ценное качество в том случае, если исследуемый образец перед экспозицией окрашивать.

Окраска часто должна сохраняться после фотографической обработки, а метол, требующий для своего применения более высоких значений pH, может ее удалить.
Кроме электронномикроскопической авторадиографии, в которой большое значение имеют размеры проявленных зерен и их соотносимость к скрытому изображению, выбор проявителя, видимо, не очень существен. Однако важно понять принципы, лежащие в основе проявления, так чтобы в каждом частном эксперименте можно было выбирать наиболее подходящие условия.

Рис. 2. Электронномикроскопические снимки 3 зерен серебра в эмульсии Ilford L4, проявленной в Микродоле X.
Хорошо виден характерный внешний вид зерен серебра после химического проявления — неправильной формы спутанная цепочка (X36 000).
Проявление быстро происходит в участке, где расположено скрытое изображение. Из атомов бромистого серебра образуются атомы металлического серебра, которые отлагаются в месте возникновения скрытого изображения, а также образуются ноны брома, диффундирующие из кристалла. Металлическое серебро отлагается в виде удлиненных тонких нитей, вероятно, благодаря присоединению большей части серебра к скрытому изображению и перемещению остальной части нити от него. Нить, напоминающая выдавленную из тюбика зубную пасту, образует спутанный клубок, который под оптическим микроскопом выглядит как твердое «зерно серебра». С помощью электронного микроскопа структуру образования можно исследовать подробнее (рис. 2).
Бахман и Салпетер [7] обнаружили, что проявленные зерна не обязательно совпадают по местоположению с материнским кристаллом, хотя зерно серебра всегда граничит с кристаллом в центре скрытого изображения.

Размер, к которому стремится в своем росте зерно, ограничен общим количеством серебра, присутствующим в материнском кристалле, если соседние кристаллы не испытывают каталитического действия этого зерна серебра. Процесс проявления может быть остановлен на любой стадии, пока размеры зерна еще не достигли максимального значения. Полностью проявленное зерно несколько больше материнского кристалла.
Проявление происходит и тогда, когда скрытое изображение отсутствует, однако в этом случае оно происходит со слишком малюй скоростью. В конце концов каждый кристалл в эмульсии превратится в серебро, если процесс проявления будет происходить достаточно долго.
Если процесс проявления резко прервать, то различия в количестве и размере начальных отложений в кристалле могут выразиться в неодинаковых размерах проявленных зерен. Кристаллы, имеющие несколько крупных центров скрытого изображения, будут проявляться быстрее тех кристаллов, в которых присутствует единственный, относительно малый центр скрытого изображения. Проявление не относится к процессам «все или ничего», однако это весьма изменчивое явление. Кристалл со скрытым изображением «проявлен», когда масса серебра в зерне достаточна для того, чтобы оно стало видимым. При постоянных условиях проявления для этого может потребоваться п атомов серебра в скрытом изображении. Изменяя один из параметров, характеризующих процесс проявления, можно добиться того, что для получения видимых зерен было бы достаточно скрытого изображения из п/2 атомов. С другой стороны, при идентичных условиях обработки, применив иной метод изучения эмульсии, можно сделать видимыми зерна, которые при прежнем методе наблюдения были слишком Малы.
Если взять эмульсию, в которой ионизирующей частицей образовано скрытое изображение в некотором количестве кристаллов, график зависимости числа проявленных кристаллов от времени будет следовать в целом зависимости, показанной на рис. 3. На нем показано число зерен как в треках, так и вне их. Спустя относительно короткий промежуток времени появляются зерна в треках, и затем их число достигает определенного значения, при котором дальнейшее увеличение продолжительности проявления не приводит к сколько-нибудь значительному возрастанию числа зерен. Одновременно появляется небольшое число хаотично распределенных зерен, скрытое изображение в которых вызвано иными процессами.

Но в то время как скрытые изображения в треках обычно содержат достаточно много серебра, случайно распределенные в эмульсии скрытые изображения образуют непрерывный спектр размеров -от малого количества кристаллов с большим количеством серебра вплоть до значительно большего числа групп, состоящих всего из нескольких атомов. Таким образом, увеличение времени проявления выражается в быстром возрастании числа зерен фона.
В течение периода, когда количество зерен серебра в треках не возрастает, размер зерен все же может продолжать увеличиваться.

Рис. 3. График, иллюстрирующим кинетику проявления эмульсии Ilford L4 в проявителе Д-19.
1 — количество наблюдаемых зерен на меченую бактерию; 2 — количество зерен фона на 100 мкм2. Спустя 2 мин после начала проявления наблюдается очень слабое увеличение числа зерен, связанных с радиоактивностью клеток. Фон медленно возрастает в течение промежутка времени до 6 мин., после чего наблюдается очень быстрое нарастание плотности зерен фона [9].
Ахмад и Демерс [8] исследовали воздействие этого эффекта на непрозрачность зерен, определяемую фотометрически, и выяснили, что в период, когда число зерен в треке достигает почти постоянной величины, любые другие характеристики, которые можно измерить фотометрически, непрерывно изменяются со временем проявления. Это положение будет обсуждено при рассмотрении значения фотометрических измерений плотности зерен (см. гл. 9).
На точную форму кривой проявления может воздействовать большое количество факторов. Возможно, что наиболее существенным из них является температура. При 5° С и ниже скорость проявления настолько мала, что для практических целей можно считать ее равной нулю. Если температура увеличивается (при неизменных прочих условиях), скорость проявления также возрастает. Этот эффект используется в так называемом циклически-температурном проявлении толстых слоев эмульсии.

Рис. 4. Микрофотография кишечника
Идентичные срезы, покрытые эмульсией типа Ilford G5, в течение возрастающих про пластинки представлено в проходящем свете (индекс Пив падающем свете по методу плохо видны в проходящем свете А1, но зато ясно и отчетливо — в падающем свете по свете Б1, а крупные — в падающем свете Б2. После 11 мин проявления зерна ясно и свете можно видеть множество крошечных зерен фона В2.
При комнатной температуре скорость диффузии проявителя в толстый слой эмульсии мала по сравнению со скоростью проявления, так что поверхностный слой может быть сильно перепроявлен, прежде чем проявитель сумеет проникнуть в более глубокие слои. Такие толстые эмульсионные слои сначала пропитываются в проявителе при температуре 5°С с таким расчетом, чтобы обеспечить проникновение проявителя во всю глубину слоя, а затем температуру поднимают до стабилизированного уровня, чтобы обеспечить требуемую степень проявления сразу по всей глубине.
Концентрация проявляющего вещества также влияет на скорость проявления, причем последняя уменьшается при разбавлении и возрастает с увеличением концентрации раствора. Часто недооценивается значение одного из прочих факторов — покачивания кювет, в которых проявляют пластины. Он до удивительной степени ускоряет проявление.
Итак, очевидно, что форму кривой проявления определяют несколько факторов: выбор проявителя, степень его разбавления, температура проявителя и степень обеспечения доступа свежего раствора. Каким образом выбрать их нужную комбинацию?
Первое, что нужно примять во внимание, это то, что оптимальная степень проявления может сильно отличаться в условиях различных экспериментов. Не существует «точного» времени.


Одно и то же поле каждой темного поля (индекс 2). Спустя 3 мин после помещения в проявитель зерна малы и методу темного поля А2. После 7 мин проявления зерна лучше видны в проходящем отчетливо видны в проходящем свете В1 на все еще низком фоне. Однако в падающем срезы окрашены гематоксилином по методу Гарриса (X 170).

На рис. 4 показана серия авторадиограмм, которые получены в одинаковых условиях, проявлены в течение возрастающих промежутков времени и исследованы при различных способах освещения. Ясно, что при использовании проходящего света выявляются только более крупные зерна серебра, которые можно легко распознать, но не видны весьма мелкие зерна фона. Время проявления при таких условиях может быть выбрано большим, чем в случае освещения авторадиограммы падающим светом по методу темного поля. На выбор наилучшего времени проявления влияет и то увеличение, при котором анализируется авторадиограмма. При слабых увеличениях будут видны только крупные зерна, и поэтому следует выбирать время обработки как можно большим. При работе с иммерсионными объективами такая степень проявления может привести к образованию столь крупных зерен, что они будут заслонять важные детали в образце, причем одновременно будут хорошо видны более мелкие многочисленные зерна фона.
Режим проявления должен соответствовать эксперименту. Наилучший способ определения оптимальных условий состоит в следующем. Возьмите серию пластинок с образцами того вида, который будет использован в основном эксперименте, экспонируйте в одинаковых условиях, а затем, произвольно выбрав подходящий проявитель, степень его разбавления и рабочею температуру, проявите авторадиограммы в течение все возрастающего промежутка времени. Изучите пластинки в тех условиях, в которых они будут использоваться при анализе авторадиограмм в ходе эксперимента, и выберите то время обработки, которое обеспечивает получение наилучших треков при достаточно низком фоне.
Может случиться, что проявление будет проведено за слишком малый промежуток времени, так что на первой пластинке треки будут отсутствовать, в то время как на второй пластинке уже появится фон. В этом случае значения произвольно выбранных параметров необходимо изменить в сторону замедления процесса проявления, увеличения продолжительности плато между проявлением активированных кристаллов и образованием фона. Разбавление проявителя или уменьшение температуры проявителя — две возможные альтернативы. Если же оптимальное время проявления неоправданно велико, то аналогично сказанному выше, проявление можно ускорить, повысив температуру и применив более интенсивное покачивание.
Продолжительность и условия проявления приведены во всех методиках, которые описаны во второй части книги. Нельзя категорически утверждать, что приводимые там сведения являются единственными для любой лаборатории предпосылками, зависящими только от условий в фотокомнате и методики микроскопического изучения. Несомненно, для каждого авторадиографического эксперимента они неприменимы.

То же справедливо и по отношению к опубликованным в литературе режимам проявления, а также рекомендациям изготовителей. Оптимальное время и условия проявления в столь значительной степени зависят от требований самого эксперимента и методов изучения готовой авторадиограммы, что нет иной альтернативы, чем их непосредственное определение в лаборатории.
Чтобы подчеркнуть относительную важность различных факторов влияющих на кривую проявления, рассмотрим серию авторадиограмм. полученных с помощью тонких слоев ядерной эмульсии При температуре 20°С можно получить достаточно обширное плато, чтобы колебание температуры на 1° в любую сторону не сказывалось существенно на окончательном результате При 25° С колебания температуры вызывают более резкие изменения. При прочих неизменных условиях путем разбавления проявителя равным объемом дистиллированной воды можно увеличить время проявления примерно на 50%· При непрерывном осторожном покачивании можно сократить наполовину время пребывания в проявителе, что приведет к лучшим результатам, чем вообще без покачивания. Очевидно, для получения воспроизводимых результатов необходимо контролировать эти различные факторы. Единственный удовлетворительный способ получить хорошие результаты в авторадиографическом эксперименте—провести простое исследование условий проявления. Лишь в немногих публикациях условия проявления приведены полностью, и нигде не даются какие-либо указания о частоте покачивания кювет с проявителем.
Результаты определения наилучших условий проявления для одной эмульсии нельзя экстраполировать для других. В этом отношении могут различаться даже эмульсии, производимые одним изготовителем. В лаборатории автора использование режима проявления, оптимального для эмульсии Ilford К2, давало неприемлемый фон для подобных слоев Ilford G5.
При работе с тонкими слоями, после ополаскивания пластинки в дистиллированной воде, концентрация проявителя настолько уменьшается, что проявление прекращается.
Для более толстых слоев эта процедура все менее эффективна, и обычно для усиления эффекта используется также сдвиг pH в кислую сторону (хорошо применять для этого 1%-ный раствор уксусной кислоты).



 
« Автоматизированный мониторинг больных сахарным диабетом детей и подростков   Актуальные проблемы низкорослости у детей »