Начало >> Статьи >> Архивы >> Феномен адаптационной стабилизации структур и защита сердца

Механизмы транскрипции и стресс-индуцированной активации синтеза hsp70 - Феномен адаптационной стабилизации структур и защита сердца

Оглавление
Феномен адаптационной стабилизации структур и защита сердца
Основные механизмы долговременной адаптации
Роль HSP70
Кардиопротекторные эффекты адаптации к стрессу
Динамика становления и обратного развития ФАСС коррелирует с изменением содержания hsp70 в миокарде
Формирование феномена адаптационной стабилизации структур
Роль инозитол-фосфатного цикла в кардиопротекторном эффекте адаптации к повторным стрессорным воздействиям
Феномен адаптационной стабилизации структур при адаптации организма к периодической гипоксии
Адаптация к гипоксии по сравнению с адаптацией к стрессу сопровождается меньшим накоплением стресс-белков
Биологическое значение белков теплового шока
Клеточная локализация и функции hsр70 в стрессированных клетках
Функции hsp 70, локализованных вдоль актиновых миофиламентов
Механизмы транскрипции и стресс-индуцированной активации синтеза hsp70
Роль hsp70 в адаптивных реакциях на примере развития термотолерантности и гипертрофии сердца
Компенсаторная гипертрофия и роль белков теплового шока в ее механизме
Механизм адаптационного накопления белков теплового шока
Роль белков теплового шока в механизме формирования феномена адаптационной стабилизации клеточных структур
Место защитной системы, связанной с hsp70 среди других клеточных систем защиты
Перспективы использования активации системы белков теплового шока в адаптационной медицине
Другие механизма феномена адаптационной стабилизации структур
Возможности воспроизведения ФАСС и его использование для защиты сердца
Механизмы ФАСС участвуют в повышении устойчивости организма к тяжелой гипоксии
Summary

Вместе с пониманием ключевой роли hsp70 в процессах клеточной репарации и защите клеток от стрессорных повреждений возникла и одна из самых важных проблем: каковы механизмы стресс-опосредованной инициации синтеза hsp70.
механизмы транскрипции HSP70 генов. К настоящему времени показано, что активация синтеза hsp может происходить по трансляционному механизму, т.е. за счет ускорения синтеза полипептидов на предсуществующих мРНК или по транскрипционному механизму, то есть за счет синтеза новых мРНК (156, 164, 195, 223).
Эти данные были получены в экспериментах McCanahon et al, (156) и vivino et al. (223), показавших, что после теплового шока или стрессорной) повреждения ДНК у Saccharomyces cereviside увеличение синтеза hsp происходит как за счет образования новых мРНК, так и за счет активации синтеза полипептидной цепи на предсуществующих мРНК (156,195,223).
Исследования самого последнего времени, проведенные на млекопитающих с использованием Northen и Dot-Blot анализа (164), показали, что ишемия миокарда вызывает в сердце собаки и кролика увеличение мРНК, кодирующей hsp70 в 6 и 18 раз соответственно. Аналогичные данные о транскрипционной активации синтеза hsp получены в опытах in vitro на человеческих и крысиных клетках (66), подвергнутых тепловому шоку.
Кроме того, на лейкоцитах человека было показано, что известный блокатор транскрипции актиномицин-Д в концентрации 20 мкг/мл эффективно блокирует накопление hsp при тепловом шоке (83). Совокупность этих данных позволяет предположить, что в клетках млекопитающих синтез hsp происходит главным образом за счет накопления новых мРНК, т.е. по транскрипционному типу. Поэтому особый интерес для нас представляет рассмотрение механизмов транскрипции hsp гена.

Рис. 46. РНК hsp70 гена из Oomycete fungus (119)

Транслируемые и нетранслируемые области указаны открытыми и заштрихованными зонами соответственно. hse - регуляторный элемент промотора, где происходит связывание факторов транскрипции; ТАТА - участок связывания РНК- полимеразы; orf - кодирующая последовательность; ААТААА - полиадениловый сайт
Как и все гены hsp70, ген содержит два основных участка: промоторную область и кодирующую последовательность (рис. 46). Промотор содержит ТАТА бокс и маркерную для hsp гена регуляторную нуклеотидную последовательность, обозначаемую как heat shock consensus element (hse); ТАТА-бокс - это область, богатая аденином и тимином, функция которой состоит в связывании РНК-полимеразы. Эта часть промотора является неспецифической и присутствует во всех известных генах, hse - это специфический элемент промотора hsp гена, состоящий из нескольких нуклеотидов: c--gaa--ttg-g. Впервые он был описан Pelham (186) в 1982 г. hse локализован на кодирующем тяже ДНК недалеко от ТАТА-бокса. Он необходим для стресс-опосредованной транскрипции hsp гена, так как именно с hse связываются белковые факторы, активирующие транскрипцию при стрессе. В самое последнее время обнаружено, что промотор человеческого hsp70 гена содержит также и другие регуляторные последовательности, ответственные за активацию гена при действии солей тяжелых металлов, сывороточных факторов и белка аденовируса eia (204) .
Hsp ген экспрессируется как первичный транскрипт (первичная мРНК), состоящий из 2241 нуклеотида и содержащий постоянную считываемую рамку - кодирующую часть - из 2025 нуклеотидов (см. рис. 46) (119). Кодирующая область начинается с ATG-стартового кодона и заканчивается стоп-кодоном-ТАА. Слева и справа от кодирующей части находятся интроны - нуклеотидные последовательности, которые не несут информации для синтеза полипептида и вырезаются при дальнейшей модификации мРНК (204). Существенно, что мРНК белков теплового шока содержит не более двух коротких интронов, в то время как для большинства мРНК других клеточных белков количество интронов достигает 17 и более (37). Эта особенность чрезвычайно важна, так как не только свидетельствует об эволюционном консерватизме hsp гена, но и позволяет предположить, что высокая скорость синтеза белков теплового шока при стрессе связана с тем, что на вырезание малого количества интронов тратится значительно меньше времени и энергии.
Регуляция транскрипции hsp гена связана по меньшей мере с двумя важными элементами: hse и факторами транскрипции.
Все известные hsp гены разных видов содержат в промоторной области одну или более hse, функция которых, состоит в связывании hstf. Как оказалось, активация транскрипции hsp гена сильно зависит как от количества hse в промоторе, так и от расстояния между этим регуляторным элементом и ТАТА-боксом. Так, Kay et al (121) установили, что активность транскрипции hsp 16 гена Caenorhabditis elegants с одной НBЕ в 10 раз меньше транскрипционной активности дикого гена, содержащего две hse. Генная конструкция, содержащая четыре hse, индуцировалась еще сильнее, чем дикий ген. Это само по себе наводило на мысль о том, что количество hse является одним из параметров, детерминирующих силу промотора. Аналогичные данные о корреляции между числом hse и силой промотора были получены для hsp70 дрозофилы (44).
Первые указания на то, что активация транскрипции hsp гена может зависеть от локализации hse в промоторе были получены в 1984 г. Dudler and Travers (89) установили, ЧТО ДЛЯ оптимальной активации hsp гена дрозофилы достаточно двух проксимальных hse, находящихся на расстоянии 50-90 оснований от ТАТА-бокса, при этом два дистальных hse, расположенных на расстоянии 180-280 оснований были менее важны для активации транскрипции. В дальнейшем подобная зависимость экспрессии hsp генов от места локализации hse была продемонстрирована на hsp 23 и hsp 26 генах дрозофилы (184). Эти данные хорошо согласуются с наблюдениями Topol et al (219) о том , что сродство проксимальных hse k hstf значительно выше , чем для дистальных элементов.
Другим важным фактором регуляции транскрипции hsp генов являются HSTF-белковые факторы, активирующие транскрипцию. Основные характеристики hstf описаны сравнительно недавно (213,231,236). Так, у дрозофилы обнаружено два типа hstf с молекулярным весом 70 и 110 кДа. У дрожжей также есть два типа hstf, но с молекулярным весом 70 и 150 кДа. Сродство hstf к hse очень высоко, константа диссоциации составляет 4 х 10”^ М. Количество молекул hstf в ядре чрезвычайно мало и в зависимости от вида и внешних условий может варьировать от 2 до 4000 молекул на ядро, hstf активируют транскрипцию hsp гена доза-зависимым образом (45). Механизм вовлечения этих белковых факторов в активацию транскрипции до конца еще не понят, однако некоторые интересные закономерности уже известны.
На бактериях было показано (204), что hstf является δ-субъединицей РНК-полимеразы. Основное функциональное значение hstf заключается в том, что при стрессе они связываются с hse, вызывая активацию РНК-полимеразы и соответственно транскрипцию hsp гена (216,235). Впервые этот факт был установлен wu (235) для hsp70 и hsp83 генов с помощью метода картирования с экзонуклеазой 3. Далее Parker и Topol (182) установили, что в hsp70 гене дрозофилы, содержащем три hse, связывание hstf с ними происходит последовательно: сначала белковый фактор транскрипции связывается с самым близким к ТАТА-боксу hse, затем с более дистальным и т. Д. Для человеческого hsp70 гена был также обнаружен белковый фактор транскрипции, который связывается с hse в ответ на стресс, при этом количество hstf в экстрактах стрессированных клеток может увеличиваться в 5-7 раз (128). Схема на рис.  47 (216) иллюстрирует основные модели, объясняющие участие hstf в активации транскрипции hsp гена.


Рис. 47. Схема, демонстрирующая различные варианты активации транскрипции hsp гена (216)
Модель А: убиквитин-зависимая протеолитическая конку рентная модель, УП - убиквитин - АТФ - зависимая протеаза, HSTF-белок, активирующий транскрипцию hsp гена, Rna pol2 - РНК- полимераза 2 , остальные обозначения как на рис.  3. Модель Б: посттрансляционное фосфорилирование hstf до его связывания с промотором (дрозофилла, HeLa ). Модель В: пост-трансляционное фосфорилирование hstf insity на ДНК ( дрожжи ). Модель Г: снятие супрессора с промотора hsp гена
Модель А - конкурентно-протеолитическая модель, основана на предположении, что в клетке постоянно синтезируется активная форма hstf. Однако в нормальных условиях в результате убиквитин-АТФ-зависимого протеолиза этот фактор инактивируется (45,98). При тепловом шоке или другой стрессорной ситуации появляются денатурированные и ненормальные белки (49,78,203), которые конкурируют с hstf в протеолитической реакции. Кроме того, большое накопление поврежденных белков в конце концов приводит к истощению протеолитической системы

Это способствует тому, что значительное количество hstf не подвергается протеолизу и остается в активной форме, связывается с hse и активирует транскрипцию гена.
Эта гипотеза подтверждается экспериментами Finley et ai (98) о том, что подавление протеолитической активностью клеток приводит к активации hsр гена, а также данными Ananthan et al (45) о том, что внутриклеточная инъекция денатурированных белков вызывает усиление транскрипции hзр гена. Вместе с тем к настоящему времени также накопились факты, которые не согласуются с этой моделью. Так, согласно модели А, для активации транскрипции необходим de novo синтез hstf. Однако zimarino и wu (241) показали, что стресс- опосредованная активация hзр гена может происходить в условиях, когда синтез hstf полностью ингибирован. Кроме того, содержание hstf даже в стрессированной клетке весьма незначительно. И не понятно, почему убиквитин-АТФ- зависимая протеаза, активность которой достаточно высока, не может полностью ингибировать этот белок (216). Наконец, было показано, что если к hsр70 гену дрозофиллы добавить hstf, выделенный из дрожжей, то несмотря на связывание белкового фактора транскрипции с hse, какой-либо активации промотора не происходит (45). Это означает, что связывание hstf с hse само по себе не является достаточным для активации транскрипции и наводит на мысль о существовании пост-трансляционной модификации hstf. Такой механизм представлен ниже в моделях Б и В.
Модели Б и В отражают разные варианты пост-трансляционной модификации hstf. Эти гипотетические модели основаны прежде всего на экспериментальных данных sorger et al (212) о том, что ДНК-hstf комплекс из контрольных и стрессированных клеток имеет различную подвижность в гелях. Причем это различие устранялось после обработки комплекса фосфатазой. Наиболее очевидное предположение, которое следует из этих экспериментов состоит в том, что в активацию hstf вовлечены процессы фосфорилирования. Это согласуется с сообщениями о том, что усиление фосфорилирования белков, возникающее в результате активации протеинкиназ, является наиболее ранним сдвигом в стрессированных клетках (129,137).
В совокупности эти данные позволяют предположить, что активация hstf происходит в результате его фосфорилирования. Причем далее было обнаружено, что фосфорилирование может происходить как до связывания hstf с ДНК, например у дрозофил и клеток (рис. 47, модель Б), так и in sity на ДНК, у дрожжей (рис. 47, модель В) (216).
Модель Г. связана со снятием супрессивного контроля промотора hsр70 гена. Moser et al (172) показали, что с промотором bsp гена связан термолабильный белок-супрессор. При тепловом шоке этот белок распадается и освобождает место для hstf. Результатом таких взаимодействий является активация транскрипции hsp гена (рис. 47).

Механизмы нейрогуморального контроля и стресс-индуцированной активации синтеза HSP70.

Большинство исследований по изучению экспрессии hsp70 генов и роли hsp70 в постстрессорном восстановлении структуры и функции клеток были выполнены in vitro на культурах клеток. На определенном этапе такой выбор был оправдан, так как имел ряд несомненных преимуществ, а именно: возможность строго стандартизовать или изменять по своему желанию условия внешней среды, проводить эксперименты на монокультурах клеток, вводить hsp непосредственно в клетки с помощью микроинъекций и т.д. Исследования in vitro весьма информативны, благодаря им было выдвинуто несколько предположений о механизме защитного эффекта этих белков; мы стали лучше понимать механизмы транскрипции hsp70 генов, роль специфических последовательностей в промоторной зоне hsp70 генов и значение белковых факторов, связывающихся с этими участками.
Другое направление исследований состояло в том, что экспрессия hsp70 генов изучалась in vivo, т.е. когда стрессорным воздействием подвергался весь организм в целом. Сравнительный анализ результатов, полученных при реализации этих двух подходов (in vitro и in vivo) наиболее последовательно был проведен в работах группы Holbrook (54,55,95). Данные такого изучения представлены ниже.
Минимальная температура, при которой начинается индукция hsp70 генов, в условиях in vivo ниже, чем in vitro (50,54). Увеличение экспрессии hsр70 генов in vivo и накопление соответствующих мРНК в отличие от in vitro может происходить уже при температуре ниже 40°С, т.е. в условиях, когда денатурация белков, по-видимому, еще не происходит и этот фактор не может играть роли в активации синтеза hsp70.
Второй факт, заслуживающий внимания, состоит в том, что в условиях in vivo в отличие от in vitro в клетках исходно до каких-либо стрессорных воздействий присутствуют в небольшом количестве мРНК индуцибельных hsp70. Для того, чтобы проанализировать это различие необходимо учитывать данные исследований Gibbs (102) И Blake et al. (54), в которых было установлено, что при действии на организм животных высокой температуры происходит выброс в кровь нескольких стресс-гормонов, включая адреналин, норадреналин, адренокортикотропные гормоны и пролактин. Эти данные позволяют предположить участие нейрогуморальных факторов в активации синтеза hsр70 и соответственно понять, почему in vivo исходно в клетках обнаруживаются мРНК, a in vitro, где влияние гормонов и нейротрансмиттеров отсутствует, нет в клетках и индуцибельных hsp70.

Предположение о физиологическом нейрогуморальном контроле активности генов, кодирующих белки теплового шока стало еще более убедительным после экспериментов Moalic et al (170), в которых, установлено, что агонисты Са2+-мобилизующих рецепторов при нормальной температуре приводят к активации синтеза и накоплению в клетках индуцибельных hsp70.
Далее мы рассмотрим возможные механизмы нейрогуморального контроля экспрессии hsp70 генов. По мимо академического наш интерес к этой проблеме будет в значительной мере определяться тем, что эти механизмы вовлечены не только в стресс-индуцированную активацию синтеза белков теплового шока, но также, вероятно, играют важную роль в адаптивных реакциях и развитии ФАСС.
Известно, что при стрессорном воздействии возникает активация высших вегетативных центров, детерминирующих стрессорную реакцию, которая приводит к многократному увеличению действующей на органы- мишени концентрации катехоламинов и кортикостероидов (11,12). В результате возникает по меньшей мере три цепи явлений, конечным звеном которых может быть увеличение содержания клеточных hsp70.
Во-первых, известно, что активация Сa2+-мобилизующих рецепторов и связанное с этим увеличение концентрации диацилглицерола через активацию протеинкиназы С и изменение внутриклеточного pH приводит к активации генов (174,189,198). Moalic et ai на изолированных сердцах крысы показали, что введение α-агониста фенилэфрина вызывало быстрое транзиторное накопление мРНК hsp70 как в желудочках, так и в аорте (169).
Таким образом, стресс-индуцированная инициация синтеза белков теплового шока может быть связана с активацией Са2+-мобилизующих рецепторов.
Во-вторых, активация β-адренорецепторов и последующее увеличение концентрации цАМФ и Са2+ в клетке приводит к активации соответствующих протеинкиназ. Показано, что одной из внутриклеточных мишеней этих протеинкиназ является фактор транскрипции гена теплового шока (216). Следовательно, результатом активации β-адренорецепторов при стрессе может стать индукция генов теплового шока и накопление hsp70.
И, наконец, в-третьих, стероидные гормоны, проникая в цитоплазму, связываются там со своим рецептором. Активированный таким образом рецептор приобретает высокое сродство к ДНК и связывается с генетической матрицей. Результатом такого взаимодействия является продукция специфических белков, которые влияют на рост и дифференцировку клетки (117,165,218). Как показали Kasambalides И banks (123), одним из таких белков является hsр68. Они установили, что синтетический глюкокортикоид дексаметазон снимает супрессию с гена hsp68 и таким образом вызывает увеличение синтеза этого белка.

Несмотря на то, что hsp70 являются эволюционно высококонсервативными белками, а белки, выделенные из разных органов одного и того же организма, вообще не отличаются по аминокислотному составу друг от друга, механизмы стрессорной активации синтеза белков теплового шока характеризуются высокой тканевой специфичностью. Так, в исследованиях in vivo установлено (54), что в мозге, легких и коке крыс индукция hsp70 зависит от продолжительности и температуры теплового шока, а в печени синтез hsp70 мРНК не связан прямо с продолжительностью и температурой теплового шока. Кроме того, максимальный синтез hsр70мРНК в мозге, коже и легких наблюдается примерно через 1 ч после теплового шока, а в печени через 6. При этом количественно наиболее интенсивное накопление hsp70 мРНК происходило в мозге и легких, а в печени и коже было в несколько раз меньше (54). В исследованиях in vitro тканевые особенности в экспрессии hsp70 генов сохранялись (96).
В чем причина тканеспецифичности в стресс-активации синтеза hsp70? Ясно, что какую-то роль в этом могут играть различия в кровеснабжении и иннервации разных органов. Вместе с тем сохранение различий в экспресии hsp70 генов в культурах клеток, выделенных из этих органов, позволяет заключить, что тканевая специфичность в стресс-активации этих генов может определяться не только нейрогуморальными факторами, но и клеточными механизмами, а именно: различием в рецепторном составе, концентрации ферментов и т.д.
Механизмы транскрипции hsp70 генов и нейрогуморального контроля синтеза hsp7o при стрессе, вероятно, в дальнейшем будут уточнены и дополнены. Тем не менее уже сейчас можно сформулировать несколько основных положений.

  1. Ключевую роль в транскрипции hep гена играет уникальный регуляторный элемент - hse. Активация гена прямо связана с количеством hse и его локализацией в промотоной области: чем больше hse и чем ближе они к ТАТА-боксу, тем сильнее будет экспрессироваться hsp ген при стрессорном воздействии.
  2. Другое важное звено регуляции транскрипции hsp гена связано с hstf, который является δ - субъединицей РНК-полимеразы, обладающей очень высоким сродством к hse. Взаимодействие hstf с hse приводит к доза-зависимому увеличению экспрессии hsp гена.
  3. Существует несколько способов активации hstf. Предполагают, что один из них связан со снятием депрессивного контроля убиквитин- АТФ-зависимой протеазы, другой с пост-трансляционной модификацией фактора транскрипции, а именно его фосфорилированием и третий - со снятием супрессивного контроля с промотора hsp70 гена.
  4. В условиях целого организма инициация синтеза hsp при стрессе связана с активацией по меньшей мере трех рецепторных систем: Са- мобилизующих и β-адренорецепторов и рецепторов стероидных гормонов.
  5. Механизмы стресс-индуцированной активации синтеза белков теплового шока являются тканеспецифичными. Вероятно, это связано с различием в нейрогуморальной регуляции разных органов и может также зависеть от клеточных механизмов.


 
« Фармакотерапия сердечной недостаточности у детей   Физико-биологические основы лучевой терапии »