Начало >> Статьи >> Архивы >> Гематология детского возраста

Окраска препаратов - Гематология детского возраста

Оглавление
Гематология детского возраста
Введение
Эмбриональное развитие кроветворного аппарата
Особенности кровотворения у детей
Теория кровотворения
Эритроциты
Зернистые лейкоциты
Лимфоциты, агранулоциты, незернистые лейкоциты
Моноциты
Плазматические клетки
Мегакариоциты
Кровяные пластинки
Эндотелиальные клетки
Классификация нейтрофилов
Гемограмма по
Общие и физические свойства крови
Кровь детей в период новорожденности
Особенности крови детей первого года жизни
Особенности крови детей в возрасте старше одного года
Особенности крови у недоношенных детей
Особенности крови и кровотворного аппарата детей с диатезами
Химические и биохимические свойства крови
Анемии
Анемии эндогенного происхождения
Врожденные гемолитические анемии новорожденных
Гемолитическая анемия
Редкие формы гемолитической анемии
Анемия недоношенных детей
Апластическая анемия Эрлиха
Хлороз (бледная немочь)
Злокачественное малокровие
Послегеморрагические анемии
Алиментарные анемии
Анемии инфекционные и послеинфекционные
Токсические анемии
Анемии на почве негигиенического образа жизни
Псевдоанемия
Профилактика малокровия у детей
Лечение малокровия у детей
Полицитемии
Агранулоцитозы
Лейкозы
Острые лейкозы
Хронические лейкозы
Лечение лейкозов
Лимфосаркома
Миеломная болезнь
Ретикуло-эндотелиозы
Спленомегалии типа Гоше и Ниман-Пикка
Спленопатии
Лимфогранулематоз
Инфекционные гранулемы
Геморрагический диатез
Гемофилия
Гипоконвертинемии
Болезнь Верльгофа
Геморрагическая тромбастении
Болезнь Шенлейн—Геноха
Дифференциальный диагноз геморрагического диатеза
Лечение различных форм геморрагического диатеза
Пароксизмальная гемоглобинурия
Гематопорфирия
Симптоматические изменения крови при различных заболеваниях детей
Влияние эндокринных расстройств на состав крови
Техника взятия крови
Определение общего количества крови
Техника исследования морфологических особенностей крови
Счет кровяных телец
Определение цветового показателя
Приготовление мазков крови
Окраска препаратов
Подсчет лейкоцитарной формулы
Лейкоцитарный профиль Ш. Д. Мошковского
Дополнительные методы исследования
Техника исследования основных физико-химических свойств крови
Определение ферментов
Определение групп крови
Определение Rh-фактора
Техника прижизненного исследования кровотворных органов
Функциональная диагностика кроветворного аппарата ребенка
Таблицы

Окраска по Романовскому — Гимза1. 1. Препарат предварительно фиксируется метиловым спиртом, как указано выше, в течение 3—4 мин.

  1. На каждый препарат берут 6 мл дистиллированной воды, к которой при постоянном энергичном покачивании добавляют 9 капель (на каждый 1 мл воды 1 — 1,5 капли краски) раствора краски Романовского—Гимза.


Рис 39 Положение препарата с мазком крови при окраске по Романовскому — Гимза.

  1. Препарат кладут мазком вниз на две тоненькие стеклянные или деревянные палочки, положенные на дно чашки Петри (рис. 39) 2. Краска подливается под препарат. Мы обращаем внимание на эту деталь и не советуем наливать краску на мазок сверху, так как при этом иногда частички ее, особенно если краска долго хранилась, выпадают из раствора и портят мазок, оседая на него. Окрашивание при хорошей краске продолжается 20—30 мин.
  2. Затем препарат хорошо промывают обыкновенной водопроводной водой и просушивают между несколькими листками фильтровальной бумаги.

Этот способ окраски мазков крови — один из самых распространенных и дает прекрасные результаты, вполне достаточные не только для повседневной практической работы, но и для большинства самых точных научных исследований. Однако при непунктуальном соблюдении в работе всех необходимых условий окраска часто получается неудачная, а иногда и совершенно непригодная даже для подсчета лейкоцитарной формулы. Поэтому мы позволим себе остановиться на некоторых деталях и наиболее частых ошибках.

  1. Препарат должен быть хорошо окрашен, для чего необходима хорошая краска 1 2 3 .
При употреблении лучших сортов красок эта предосторожность излишняя.

1              Состав раствора: азур эозин — 3,0; азур III — 0,8; метиловый алкоголь —

2375,0, глицерин— 125,0.

3 Можно приготовить самому раствор краски Романовского — Гимза из ее сухого порошка; 0,75 г сухой краски растворяют при нагревании до 60° в смеси, состоящей из 75 г метилового алкоголя (puriss) и 25 г глицерина (свободного от кислот).

  1. Вода, в которой разводится краска, должна быть надлежащей кислотности. На этикетке флакона с краской бывает обозначена наиболее подходящая концентрация водородных ионов. На практике испытание воды делается следующим образом: к 10—12 мл дистиллированной воды прибавляют чистым пинцетом несколько крупинок краски гематоксилина; если при этом вода окрасится в слабый, но вполне отчетливый фиолетовый цвет не раньше чем через 1 мин и не позже чем через 5 мин, то вода годна к употреблению, так как имеет нейтральную реакцию; если в течение 5 мин вода не окрасится, то это указывает на повышенную ее кислотность, которая легко устраняется путем прибавления нескольких капель 1%-ного раствора соды (natrium carbonicum). С подщелоченной водой вновь проделывают такую же пробу и, лишь убедившись в ее нейтральности, приступают к окраске мазка. Появление фиолетовой окраски воды скорее чем через 1 мин свидетельствует о щелочной реакции, которая легко исправляется путем добавления 1—2 капель 0,5%-ного раствора уксусной кислоты.
  2. Сосуд (измерительный, цилиндр), в котором разводится краска, должен быть, безусловно, чист и совершенно свободен от кислот и щелочей; после работы вполне достаточно сполоснуть его дистиллированной водой и нет необходимости добиваться полного удаления следов краски, прибавляя щелочи, кислоты и т. д.
  3. Каждый сорт краски требует различного времени для получения хорошей окраски мазка, что легко устанавливается ориентировочной пробой с каждым новым флаконом.
  4. Краска должна сохраняться в бутылке с хорошо притертой пробкой, и ее необходимо оберегать от всякого загрязнения. Если основной раствор стоит очень долго, то в нем увеличивается количество азура и он начинает перекрашивать препараты: ядра лейкоцитов получаются интенсивно темно-вишневого цвета, а зернистость нейтрофилов почти совсем не воспринимает окраску. В этих случаях необходимо делать более значительное разведение (1 капля на 1|2—2 мл) краски, а продолжительность окраски несколько сократить.
  5. Краска должна быть тщательно смешана с водой.

Правильно окрашенный препарат внешне имеет нежный красновато-розовый цвет с незначительным фиолетовым оттенком; ярко-красный цвет мазка свидетельствует о присутствии кислот в воде или в посуде, слишком синий или грязновато-фиолетовый — об избытке щелочи. Слишком продолжительное окрашивание дает также фиолетовый цвет, слишком кратковременное — чистый красный цвет. Уже по этим макроскопическим приметам можно судить о правильности окрашивания. Точнее в этом убеждаются, рассматривая мазок под микроскопом при помощи иммерсионной системы. Под микроскопом при правильной окраске эритроциты имеют розово-красный цвет, ядра нейтрофилов и лимфоцитов — интенсивный фиолетово-красный цвет, ядра других гранулоцитов — тот же цвет, но с преобладанием красного оттенка. Базофильные зернышки при этом бывают темно-синего цвета с фиолетовым оттенком, нейтрофильные — фиолетово-красного цвета и эозинофильные — яркого розово-красного цвета. Протоплазма лимфоцитов окрашивается в голубой цвет, моноцитов — в дымчато-серый и плазматических клетках — в интенсивный темно-синий. Азурофильная зернистость лимфоцитов — красного цвета.
Для получения интенсивного окрашивания кровяных пластинок, спирохет и малярийной зернистости эритроцитов предпочтительнее пользоваться подщелоченным раствором краски, для чего на 50 мл воды, употребляемой для разведения, добавляют 2 капли 1%-ного раствора соды. Для более отчетливого выявления эозинофильной зернистости, наоборот, воду подкисляют (на 100 мл воды 2 капли 0,5%-ного раствора уксусной кислоты).
Ускоренная окраска по Романовскому—Гимза. Нефиксированный препарат кладут в чашку Петри мазком вверх и накапывают на него 20—25 капель ex tempore приготовленной смеси; краска и ацетон или краска и метиловый алкоголь поровну. Чашку закрывают во избежание испарения. Через 0,5—1 мин добавляют около 10 мл дистиллированной воды, равномерно распределяют ее, покачивая чашку, и оставляют препарат краситься 5—10—20 мин. Препарат вынимают, промывают водой и высушивают. При этом способе (особенно с ацетоном) прекрасно окрашиваются зернистость, ядра, пла,- стинки и т. д. Красить этим способом можно только свежие (сохранявшиеся не больше 2 дней) предварительно не фиксированные препараты.
Окраска азур-эозином по Нохту. В случае отсутствия хорошей готовой краски Романовского — Гимза можно с успехом воспользоваться модификацией окрашивания азур-эозином по Нохту двумя растворами:
раствор № 1: азур II 1,0; дистиллированная вода 1000,0;
раствор № 2: эозин 1,0; дистиллированная вода 1000,0.
Каждый вновь приготовленный раствор надо протитровать; несколько свежих мазков крови окрашивают обоими растворами в различных сочетаниях: 1) 6 мл дистиллированной воды, 8 капель раствора № 1 и 8 капель раствора № 2; 2) 6 мл дистиллированной воды, 8 капель раствора № 1 и 10 капель раствора № 2; 3) 6 мл дистиллированной воды, 8 капель раствора № 1 и 12 капель раствора № 2; 4) 6 мл дистиллированной воды, 8 капель раствора № 1 и 14 капель раствора № 2 и т. д.
Просмотр мазков позволяет легко установить наиболее целесообразное соотношение обоих красящих растворов. При правильной их комбинации ядра лейкоцитов окрашиваются в фиолетово-красный цвет; если ядра имеют голубоватый оттенок, надо добавить еще эозина. Длительность окрашивания 10—15 мин. Требуется предварительная фиксация препарата.

Окраска по Май — Грюнвальду1 . При окраске по Май — Грюнвальду предварительной фиксации не требуется.

1 Раствор эозиновокислой метиленовой сини в метиловом алкоголе с глицерином. При пользовании таблетками растворяют 1 таблетку в 10 мл абсолютного, свободного от ацетона метилового спирта. При пользовании порошком 0,25 г его растворяют при постоянном взбалтывании в 100 г метилового алкоголя (purissimum) и затем фильтруют через сухой фильтр в сухую бутылку.

Препарат помещают мазком кверху на дно чашки Петри и на него наносят 20 капель краски. Чашку закрывают на 3 мин, в течение которых и происходит фиксирование препарата.
Не сливая краски, прибавляют 20 капель дистиллированной воды и, осторожно покачивая чашку, хорошо смешивают краску с водой. Чашку закрывают снова и оставляют препарат краситься в течение 10—15 мин.
Препарат промывают водопроводной водой до розового оттенка и высушивают между листками фильтровальной бумаги.
При этом способе хорошо окрашиваются эритроциты, отчетливо выявляется полихромазия и базофильная зернистость красных телец, хорошо воспринимает окраску зернистость всех гранулоцитов, сравнительно слабо окрашиваются ядра в голубой цвет и не окрашиваются азурофильная зернистость лимфоцитов и моноцитов, кольца Кабо и хроматин малярийных плазмодиев.
Окраска по Паппенгейму. Этот способ дает наилучшие результаты, в нем сочетаются преимущества окраски по способам Романовского— Гимза и Май—Грюнвальда.
Первый способ. 1. На нефиксированный мазок наливают 20 капель краски Май—Грюнвальда и оставляют в закрытой чашке Петри на 3 мин.

  1. Прибавляют 20 капель дистиллированной воды, тщательно смешивают, покачивая чашку с краской, и оставляют препарат краситься в течение 1 мин.
  2. Краску сливают с препарата, но не промывают его водой, а помещают в чашку Петри мазком вниз, так же как при окрашивании одной краской Романовского—Гимза.
  3. Под препарат подливают 6 мл разведенной краски Романовского—Гимза (по 1 капле на каждый 1 мл воды) и окрашивание продолжают еще 10—15—20 мин.
  4. Препарат вынимают из чашки, промывают водой и высушивают между листками фильтровальной бумаги.

Этот метод неизменно дает хорошие результаты: эритроциты окрашиваются в яркий розово-красный цвет, хорошо выделяется базофильная структура ядер и отчетливо выступает зернистость эритроцитов; несколько хуже выявляется базофильная зернистость и полихромазия красных кровяных телец. В остальном цветовые оттенки такие же, как и при окраске по Романовскому—Гимза.
Второй способ. Применяется панхроматический красящий раствор следующего состава:

Метиленовая   синь .. 1,0
Толуидиновая     »                           0,5
Азур 1 1,0
Метилвиолет                               0,5 1 2
Эозин .. 0,75
Метиловый алкоголь . 250,0
Глицерин .. 250,0

Ацетон        50,0

1    Препарат фиксируют 5 мин неразведенным раствором краски Май—Грюнвальда или смесью равных частей метилового и этилового алкоголя.

2   Фиксирующий раствор сливают.

  1. На 5—10 мин наливают разведенную водой краску (15 капель панхроматической краски Паппенгейма на 10 мл дистиллированной воды).
  2. Препарат промывают водой и высушивают на воздухе. При желании получить наиболее отчетливую дифференцировку высохшие мазки можно обработать смесью 3 частей метилового спирта и 1 части ацетона.

При этом способе особенно отчетливо выступает нейтрофильная зернистость.
Окраска по Романовскому—Циману. Раствор № 1: Methylenblau medic, purum 1,0; natrium biboricum purissimum 2,5; aq. dest. 100,0. Раствор должен стоять в течение 5—7 дней; чаще взбалтывать.
Раствор № 2: Eosin (Ва или Ag) 0,1; aq. dest. 100,0. Можно готовить более стойкий 1%-ный раствор и по мере надобности разводить его водой.
Смешивают 1 часть раствора № 1 с 4 частями раствора № 2, хорошо взбалтывают и подливают под предварительно зафиксированный спиртом и высушенный препарат, положенный мазком вниз, как при окраске по Романовскому — Гимза.
Красить в течение 5 мин, вынуть, промыть водой и высушить между листками фильтровальной бумаги.
Окраска по Лейшману. 1. На нефиксированный препарат наливают 15 капель готового раствора краски.

  1. Через 2,5 мин прибавляют 30 капель дистиллированной воды и красят еще 5 мин.
  2. Промывают в течение нескольких минут (2—3) дистиллированной водой и высушивают на воздухе.

Окраска по Эпштейну. Раствор № 1: Lithii citrici 1,0; Toluidinblau 1,0; aq. dest. 100,0 (профильтровать сразу после приготовления через смоченный дистиллированной водой фильтр).
Раствор №2: насыщенный при кипячении и охлажденный раствор пикриновой кислоты.

  1. Мазок фиксируют метиловым спиртом.
  2. Погружают в вертикальном положении в раствор № 1 на 10— 30 мин.
  3. Промывают водой нейтральной реакции.
  4. Погружают в вертикальном положении в раствор № 2 на 1 — 3 сек.
  5. Промывают водой и высушивают.

Окраска по Мансону. Раствор сини: 2 г метиленовой сини растворяют в 100 мл кипящего 5%-ного раствора буры. Раствор можно хранить не дольше 6 недель. Перед употреблением его несколько разводят водой, чтобы смесь была прозрачной (можно не разводить).

  1. Препарат фиксируют метиловым спиртом и высушивают. 1

1 При приготовлении из сухой краски Лейшмана 0,1 г порошка растворяют в 10 мл метилового спирта

  1. Окрашивают синью в течение 5—30 сек (в зависимости от концентрации краски).
  2. Промывают водопроводной водой и высушивают между листками фильтровальной бумаги.

Краска применяется главным образом для окраски малярийных плазмодиев.
Окраска по Фрейфельд. Раствор № 1:fuchsin basic, (для бацилл) Griibleri 1,0; spiritus absolutus 15,0 (растворяется при нагревании на водяной бане). По охлаждении добавляют: sol. ас. carbolici crystallisati 5% 100,0.
Раствор №     2: sol. 1% methylenblau medic, purum (Griibler).

  1. Препарат фиксируется в течение 3 мин метиловым спиртом и просушивается.
  2. На препарат наливается заготовленное ex tempore разведение краски: к 20 мл водопроводной воды прибавляют 7 капель раствора № 1 и после тщательного взбалтывания 5 капель раствора № 2; смесь снова взбалтывают. В этом растворе препарат остается в течение 1 ч.
  3. Препарат промывается водой и высушивается на воздухе.

Для получения хороших препаратов необходимо соблюдать следующие указания автора метода: 1) посуда должна быть безупречно чиста; 2) капли всегда должны быть одной и той же величины и 3) окраска должна проводиться быстро и аккуратно.
Окраска применяется для выявления токсических изменений в нейтрофилах. В протоплазме получаются все переходы от синеватой сетки к крупной комковатости; зернистость в ядрах; центрозома в виде красноватой точки или палочки в середине протоплазмы между сегментами ядра.
Окраска по Моммсену. Буферный раствор: нормальный раствор едкого натра 21,5 мл, нормальный раствор уксусной кислоты 27,0 мл и дистиллированной воды 1000,0 мл.
Правильно приготовленный раствор должен иметь pH = 5,4; необходимо всегда проверить концентрацию водородных ионов в получившемся растворе и довести ее до указанной.
Раствор краски: краска Романовского — Гимза 10 мл, дистиллированная вода 40,0 мл и буферный раствор до 100,0 мл.
Препарат фиксируют в течение 4—5 мин абсолютным метиловым алкоголем и кладут в чашку Петри мазком вниз (как при окрашивании по Романовскому—Гимза); под препарат подливают окраску (желательно такое количество, чтобы она покрыла стекло сверху). Окрашивание длится 2—2,5 часа. Вынутый из краски препарат промывают тем же буферным раствором и высушивают. Мазки должны быть свежими.
При этой окраске отчетливо выявляется токсичная зернистость: нормальная зернистость не окрашивается совсем.



 
« Гематологический и иммунологический мониторинг у детей больных ИЗСД в течение инсулинотерапии   Гематология детского возраста с атласом миелограмм »