Начало >> Статьи >> Архивы >> Гематология детского возраста

Дополнительные методы исследования - Гематология детского возраста

Оглавление
Гематология детского возраста
Введение
Эмбриональное развитие кроветворного аппарата
Особенности кровотворения у детей
Теория кровотворения
Эритроциты
Зернистые лейкоциты
Лимфоциты, агранулоциты, незернистые лейкоциты
Моноциты
Плазматические клетки
Мегакариоциты
Кровяные пластинки
Эндотелиальные клетки
Классификация нейтрофилов
Гемограмма по
Общие и физические свойства крови
Кровь детей в период новорожденности
Особенности крови детей первого года жизни
Особенности крови детей в возрасте старше одного года
Особенности крови у недоношенных детей
Особенности крови и кровотворного аппарата детей с диатезами
Химические и биохимические свойства крови
Анемии
Анемии эндогенного происхождения
Врожденные гемолитические анемии новорожденных
Гемолитическая анемия
Редкие формы гемолитической анемии
Анемия недоношенных детей
Апластическая анемия Эрлиха
Хлороз (бледная немочь)
Злокачественное малокровие
Послегеморрагические анемии
Алиментарные анемии
Анемии инфекционные и послеинфекционные
Токсические анемии
Анемии на почве негигиенического образа жизни
Псевдоанемия
Профилактика малокровия у детей
Лечение малокровия у детей
Полицитемии
Агранулоцитозы
Лейкозы
Острые лейкозы
Хронические лейкозы
Лечение лейкозов
Лимфосаркома
Миеломная болезнь
Ретикуло-эндотелиозы
Спленомегалии типа Гоше и Ниман-Пикка
Спленопатии
Лимфогранулематоз
Инфекционные гранулемы
Геморрагический диатез
Гемофилия
Гипоконвертинемии
Болезнь Верльгофа
Геморрагическая тромбастении
Болезнь Шенлейн—Геноха
Дифференциальный диагноз геморрагического диатеза
Лечение различных форм геморрагического диатеза
Пароксизмальная гемоглобинурия
Гематопорфирия
Симптоматические изменения крови при различных заболеваниях детей
Влияние эндокринных расстройств на состав крови
Техника взятия крови
Определение общего количества крови
Техника исследования морфологических особенностей крови
Счет кровяных телец
Определение цветового показателя
Приготовление мазков крови
Окраска препаратов
Подсчет лейкоцитарной формулы
Лейкоцитарный профиль Ш. Д. Мошковского
Дополнительные методы исследования
Техника исследования основных физико-химических свойств крови
Определение ферментов
Определение групп крови
Определение Rh-фактора
Техника прижизненного исследования кровотворных органов
Функциональная диагностика кроветворного аппарата ребенка
Таблицы

Исследование препарата свежей крови

Для получения свежего препарата неокрашенной крови поступают следующим образом: удалив, как и при всех других исследованиях, одну-две первые капли крови, выступающие из укола без всякого надавливания, к третьей прикасаются серединой поверхности чистого покровного стекла, которое сразу ставят краем на предметное стекло и быстро опускают на него так, чтобы капля оказалась между ними.

В момент соприкосновения поверхности обоих стекол слегка надавливают на покровное стекло (коротким толчкообразным движением)
Приготовление препарата свежей крови
Рис. 45. Приготовление препарата свежей крови.
Существует и другой способ: чистое покровное стекло накладывают на чистое предметное стекло так, чтобы края обоих совпали, и слегка прижимают их одно к другому пинцетом Корнета (рис. 45). Краями обоих стекол прикасаются непосредственно к капле крови, как это показано на рисунке, или переносят ее на стекла стеклянной палочкой. Кровь в силу капиллярности распространяется между обоими стеклами.
Для более или менее продолжительного наблюдения края покровного стекла смазывают слегка вазелином, что препятствует быстрому высыханию крови.
Полученный препарат исследуют под большим увеличением, но не иммерсией, при слегка опущенном осветителе Аббе и несколько затемненном поле.
Распределение эритроцитов в свежем препарате
Рис. 46. Распределение эритроцитов в свежем препарате, слева — правильное, справа — неправильное.
При правильном изготовлении препарата нормальная кровь ложится тонким равномерным слоем, и под микроскопом кровяные тельца лежат отдельно, а не склеиваются в виде монетных столбиков (рис. 46). Эритроциты должны быть правильной дискообразной формы с ровными краями; при патологических условиях (анемиях) кровяные тельца имеют неправильную форму, края их фестончаты (форма тутовой ягоды) и некоторые совсем не окрашены (тени эритроцитов).
Более детально свежий препарат крови изучается в темном поле зрения.

Исследование препарата свежей крови в темном поле зрения

Для получения темного поля пользуются параболоидным конденсором Цейсса (при микроскопе этой фирмы), который вставляется вместо обычного; для микроскопов Лейтца имеются специальные конденсоры, удобные тем, что в них поворотом рычага можно сменить светлое поле на темное и наоборот. При употреблении темного поля необходимо пользоваться сильным источником света, подбирать предметные стекла определенной толщины, указанной на конденсоре; покровные стекла не должны быть толще 0,2 мм. При этом способе видны светящиеся контуры эритроцитов, благодаря чему легко удается заметить патологические изменения их размеров и форм (пойкилоцитоз, анизоцитоз, аутоагглютинация и т. д.). Лимфоциты имеют вид гомогенных шариков с углублением на месте ядра; отчетливо заметна зернистость в полинуклеарах. При подогревании микроскопического столика видны амебовидные движения лейкоцитов и движение зернистости в нейтрофилах. Пластинки также хорошо заметны и имеют вид; блестящих небольших телец округлой формы. Отчетливо удается видеть амебовидное движение зернышек малярийных плазмодиев и движение спирохет, кажущихся блестящими (легко заметить благодаря энергичному движению соседних форменных элементов). Наконец, наблюдается энергичное броуновское движение мелких блестящих частичек, что особенно хорошо заметно при движении диафрагмы. Это — мельчайшие частички жира, так называемые гемоконии, появляющиеся в крови через 2 ч после пробного завтрака (кусок хлеба с 25—30 г масла или стакан молока); отсутствие их может указывать на нарушение функции печени или поджелудочной железы; слишком длительное присутствие гемоконий свидетельствует о нарушении способности ретикулоэндотелиальной ткани задерживать жир.

Исследование крови в «толстой капле»

Приготовить хороший препарат с «толстой каплей» гораздо легче, чем получить хороший мазок. Вытерев насухо палец и сделав обычным способом укол, умеренным надавливанием выжимают довольно большую каплю крови, к которой и прикасаются поверхностью одного из концов предметного стекла; палец вытирают, выжимают новую каплю и прикасаются к ней уже другим местом стекла. Третью каплю берут на самый конец поверхности предметного стекла. Обе первые капли размазывают обыкновенной иглой по стеклу до величины 10-копеечной монеты, третью тоже размазывают, но в виде четырехугольника (рис. 47), на котором, когда он высохнет, иглой пишут фамилию больного и дату исследования. Капли на стекле должны хорошо просохнуть на воздухе, для чего стекло оставляют лежать в горизонтальном положении, защитив надлежащим образом (проволочным или стеклянным колпаком, марлей и т. д.) от мух, которые моментально могут совершенно испортить препарат.
Ускорить высыхание капель можно, положив стекло на солнце или в термостат. Мазки с «толстой каплей» при необходимости можно подвергнуть дальнейшей обработке через 30—40 мин, но лучше несколько- позже— через 12—24 ч после взятия крови.
Окраску «толстой капли» лучше всего производить краской Романовского — Гимза. Без предварительной фиксации наливают на обе первые «толстые капли» небольшое количество обычным способом приготовленного разведения краски, которую и оставляют на 3 мин при легком покачивании предметного стекла. В течение этого времени происходит гемолиз, что легко заметить по образованию в растворе краски отчетливого красного облачка. Краску с гемоглобином осторожно сливают, слегка наклоняя стекло, и очень осторожно сбоку подливают новую порцию разведенной краски Романовского — Гимза. Остатки капли теперь почти прозрачны и имеют слабый синевато-дымчатый оттенок. Через 20—30 мин препарат очень осторожно обмывают дистиллированной водой (стекло держат горизонтально) и высушивают на воздухе в вертикальном положении. Никогда не следует пользоваться для высушивания фильтровальной бумагой.

Рис. 47. Препарат «толстой капли», справа — капля, только что взятая, посередине — капля, уже размазанная по стеклу.
Хорошо окрашенная капля имеет слабый синеватый цвет, переходящий по краям в красно-фиолетовый.
Шиллинг широко пользуется «толстой каплей» для определения степени регенерации крови (полихроматофильные эритроциты имеют голубую сетку, а базофильные зерна окрашиваются в голубой цвет), для учета количества эозинофилов и для исследования на паразитов крови. Мы пользуемся методом «толстой капли» только для определения наличия малярийных плазмодиев и спирохет возвратного тифа, так как степень регенеративных процессов гораздо лучше выявляется методом прижизненной окраски зернисто-нитчатых субстанций красных кровяных телец, а количество эозинофилов более точно и легко учитывается как на обыкновенных мазках, так и методом Дунгера.

Витальная окраска substantia granulofilamentosa

Витальная (суправитальная, премортальная) окраска применяется для выявления substantia granulofilamentosa. Наилучшие результаты дает окрашивание краской бриллиант-крезилблау. При своих исследованиях мы пользуемся несколько видоизмененным методом Паппенгейма: капля насыщенного спиртового раствора краски (1 г сухой краски бриллиант-крезилблау растворяется в 80 мл абсолютного спирта) наносится на тщательно вымытое и слегка подогретое предметное стекло, по которому быстро размазывается покровным стеклом совершенно так же, как это делается с кровью при получении мазков. Если стекло имеет ровную поверхность и безупречно чисто вымыто, краска ложится тончайшим слоем, придающим стеклу лиловатый оттенок. На таком окрашенном стекле (может храниться долгое время) делается обычным способом мазок исследуемой крови, и стекло с влажным мазком немедленно помещается во влажную камеру (чашка Петри или Коха, на дно которой положено несколько листков влажной фильтровальной бумаги), где и остается 15—20 мин, лучше всего до полного высыхания препарата.
Затем стекло вынимают, просушивают на воздухе и рассматривают под микроскопом через иммерсию. При таком способе эритроциты окрашиваются в бледный зеленовато-голубоватый цвет и у некоторых из них отчетливо видна темно-синего цвета зернисто-нитчатая структура (substantia granulofilamentosa. см. цвета, табл. IV). Препарат можно окрасить дополнительно краской Май — Грюнвальда, сперва неразведенной в течение 3 мин, а затем с разбавленной равным количеством воды еще 2 мин. При такой дополнительной окраске синяя витальная нитчато-зернистая структура отчетливо выступает на яркорозовом фоне эритроцитов. Отмечаемая некоторыми авторами потеря части зернистых эритроцитов при дополнительной окраске хотя, действительно, и имеет место, но, по нашим наблюдениям, обычно не превышает 0,5—1 % общего количества их, что вряд ли может иметь большое практическое значение для клиники.
Для определения количества витально красящихся эритроцитов· поступают совершенно так же, как при подсчете кровяных пластинок: пользуясь окуляром Эрлиха или вставив в обыкновенный окуляр вкладку Шиллинга или Сименштейна, подсчитывают в различных местах препарата 2000—3000 эритроцитов и отмечают, какое количество из них содержит substantia granulofilamentosa, Число последних обычно выражается в промиллях по отношению к числу красных кровяных телец.
Если известно абсолютное число эритроцитов в 1 мм3 исследуемой крови, легко определить и абсолютное количество в ней красных кровяных телец с суправитальной зернистостью.
Суправитальная зернистость менее отчетливо окрашивается водными растворами метиленовой сини, метилвиолета, генцианвиолета и некоторыми другими. С водными растворами поступают несколько иначе: к небольшой капле крови, взятой на предметное стекло, прибавляют маленькую каплю краски, покрывают покровным стеклом и, спустя несколько минут, рассматривают под микроскопом. При этом способе более или менее точный учет количества эритроцитов, содержащих витальную зернистость, невозможен, и он применяется главным образом для выявления телец Гейнца, появляющихся в крови при отравлениях, сопровождающихся образованием метгемоглобина. Обычно пользуются раствором метилвиолета (1,0 метилвиолета растворяют в 100 мл 0,6%-ного водного раствора поваренной соли), который окрашивает названные тельца в темно-фиолетовый цвет.
Окраска по Н. Г. Алексееву — см. стр. 303.

Витальная окраска на жир по Цезарис — Демелю

На хорошо вымытом предметном стекле делается мазок краски следующего состава: бриллиант-крезилблау 0,2, Судана III 0,04 и абсолютного спирта 15,0; после высыхания на него накладывают покровное стеклышко с каплей исследуемой крови. Жировые капли, наблюдаемые в лейкоцитах главным образом при инфекционных заболеваниях, окрашиваются при этом в оранжево-красный цвет.

Витальная окраска нильблау-сульфатом на эритроконты Шиллинга

Предметное стекло смазывается 0,5%-ным спиртовым раствором нильблау-сульфата (как бриллиант-крезилблау при исследовании суправитальной зернистости); сделанный мазок помещается на 5 минут во влажную камеру. Дополнительная окраска не производится.
Эта окраска хорошо выявляет «эритроконты» Шиллинга при гемолитических анемиях, тельца Гейнца при метгемоглобинемиях, а также substantia granulofilamentosa.

Прижизненная окраска нейтральрот-янусгрюном по Сабин

Раствор № 1: нейтральрот 0,1; спирт абсолютный 10,0.
Раствор № 2: янусгрюн 0,1; спирт абсолютный 10,0.
За несколько часов до исследования (или накануне) к 5 мл абсолютного спирта прибавляют 20 капель раствора № 1 и 5 капель раствора № 2, взбалтывают и наносят на тщательно вымытое предметное стекло. На стекло, покрытое краской, наносят каплю исследуемой крови, покрывают покровным стеклышком и помещают во влажную камеру (чашку Петри) на полчаса.
Митохондральная зернистость лимфоцитов и мононуклеаров окрашивается в зеленый цвет янусгрюном; нейтральрот окрашивает гранулы, имеющиеся также и в нейтрофилах, в оранжевый цвет, а ядра лейкоцитов остаются бесцветными. Нейтральрот-гранулы располагаются в виде розетки соответственно центросфере в мононуклеарах и в миелобластах (Е. И. Фрейфельд). В эритробластах и некоторое время в молодых эритроцитах обнаруживаются также янусгрюн-мито- хондрии и нейтральрот-гранулы.
Е. И. Фрейфельд предлагает использовать эти включения для оценки характера регенерации. В норме их мало—1,25 в препарате; при усиленной регенерации число их резко увеличивается, и такие эритроциты встречаются в каждом поле зрения. При отмирании эритроцитов исчезают и митохондрии, и нейтральрот-гранулы, выявляется лишь substantia granulofilamentosa.

Методика исследования гистиоцитов (гистиофагов) в периферической крови

Для выявления в периферической крови клеток ретикулоэндотелиальной) происхождения, так называемых гистиоцитов, или гистиофагов, можно рекомендовать видоизмененный Егоровым метод Битторфа.

  1. Кровь следует брать не утром, а днем, по крайней мере через 3—5 ч после того, как больной встал.
  2. Кровь берут из мочки уха, которая не дезинфицируется и не растирается (больной в течение 3 ч до исследования не должен лежать на стороне того уха, из которого берется кровь).
  3. Для укола используется перо Дженнера или простая игла, но ни в коем случае не игла Франка.
  4. Укол делается как можно поверхностнее, чтобы кровь появилась лишь после довольно значительного надавливания.
  5. Для мазка берется первая капля крови.
  6. Дальнейшая фиксация и окраска мазка производится, как обычно (краски Романовского — Гимза, Май — Грюнвальда, Паппенгейма и др.).

Оксидазная реакция

Способ Винклера — Шульце. Раствор № 1: 1%-ный водный раствор основного диметилпарафенилендиамина1 .
Раствор № 2: α-naphthol, natrium carbonicum аа 0,5;
aq. dest. 50,0 2 .

  1. Обычный мазок крови фиксируют в течение нескольких секунд в растворе следующего состава: 1 часть 40%-ного формальдегида и 9 частей 95°-ного спирта; можно применять также смесь равных количеств формалина (40%-ный формальдегид) и абсолютного алкоголя, в последнем случае фиксация длится 15—20 мин.
  2. Высушенный препарат погружают на 3 мин в раствор № 2.
  3. Не промывая и не высушивая препарата, покрывают его на несколько минут раствором № 1.
  4. Быстро промывают дистиллированной водой.
  5. Докрашивают препарат в течение 1/2—1 мин 0,5—1%-ным раствором сафранина, нейтральрота или сильно разведенным раствором фуксина Циля.
  6. Промывают дистиллированной водой и высушивают.

Все частицы клеток, содержащие оксидазу, окрашиваются в синий цвет, а ядра — в дополнительный красный. Реакция зависит от образования под влиянием фермента оксидазы красящего вещества индофенолблау. Резко положительную реакцию (большое количество интенсивно окрашенных частичек) дают клетки миелоидного происхождения (нейтрофилы, эозинофилы), за исключением базофилов, вопрос об отношении которых к этой реакции окончательно еще не решен. Из моноцитов только некоторые дают слабоположительную реакцию (малое число слабоокрашенных частичек). Элементы лимфоидного происхождения дают отрицательную реакцию.

1                     Растворяется без нагревания; к употреблению годен через несколько дней.

2 1 г α-naphthol в 100 мл 0,5°/о-ного раствора соды доводят до кипения, к нему прибавляют концентрированный раствор КОН до полного растворения. К употреблению годен отстоявшийся прозрачный раствор.

Пероксидазная реакция

Способ Грэхема. Так называемая пероксидазная реакция Грэхема менее чувствительна, но принципиально тождественна предыдущей.

  1. Мазок (свежий) фиксируют в течение 1 мин в свежеприготовленной смеси: 1 часть 40%-ного формальдегида и 9 частей 95°-ного спирта.
  2. Слегка промывают водой.
  3. На 5 мин погружают в раствор бензидина: к 10 мл 40°-ного спирта прибавляют несколько крупинок бензидина и 0,02 мл (1 пипетка от гемометра Сали) перекиси водорода.
  4. Промывают водой.
  5. Дополнительно окрашивают в течение 1—2 мин синькой Леффлера, раствором тионина или краской Романовского—Гимза в течение 30—40 мин.

В клетках, дающих положительную реакцию, выявляются золотисто-коричневые зерна.
Положительную реакцию дают клетки миелоидного происхождения (зрелые нейтрофилы и эозинофилы, нейтрофильные и эозинофильные метамиелоциты, миелоциты и промиелоциты, большинство миелобластов, из которых только совершенно незрелые дают отрицательную реакцию), большая часть моноцитов дает отрицательную реакцию, меньшая — слабоположительную. Лимфоциты и базофилы всегда дают отрицательную реакцию.
Способ Леля — Эпштейна. Фиксируют мазок крови (не сохраняемый долее 48 часов) смесью: 1 часть 40%-ного формальдегида и 9 частей 95°-ного спирта.

  1. Быстро промывают (15—20 сек) дистиллированной водой.
  2.  На 3 мин покрывают раствором: 40°-ного спирта 10,0, нафтола 0,1 и 3%-ной перекиси водорода 0,02.
  3. Промывают дистиллированной водой.
  4.  Погружают на 25—30 мин (до 14 ч) в краску следующего состава: толуидинблау 1,0, лимоннокислого лития 1,0 и дистиллированной воды 100,0.
  5. Промывают дистиллированной водой (1 сек).
  6. Промывают 1%-ным раствором таннина (1 сек).
  7. Просушивают фильтровальной бумагой.

Зернистость нейтрофилов, эозинофилов и моноцитов, дающая положительную пероксидазную реакцию, окрашивается в ярко-зеленый цвет. Эритроциты имеют зеленоватый цвет.

Йодная реакция

Делают мазок на покровном стекле, высушивают на воздухе и, не фиксируя, кладут на предметное стекло, на которое предварительно нанесена капля смеси: jodi puri 1,0; kalii jodati 3,0; aq. dest. 100,0; gummiarabici q. s., до консистенции канадского бальзама.
Через 2 мин смотрят мазок под микроскопом.

При положительной реакции может быть: 1) диффузное окрашивание протоплазмы нейтрофилов в бурый цвет 2) в окрашенной протоплазме — крупные зерна и глыбки коричневого цвета; 3) полное превращение протоплазмы в коричневую зернистую массу.
Положительная йодная реакция со стороны нейтрофилов (по данным одних авторов, окрашивается гликогеноподобное тело, а других — амилоидоподобное) чаще всего наблюдается при крупозном воспалении легких, при абсцессе печени, аппендиците, скарлатине, а также при других инфекциях и интоксикациях.



 
« Гематологический и иммунологический мониторинг у детей больных ИЗСД в течение инсулинотерапии   Гематология детского возраста с атласом миелограмм »