Начало >> Статьи >> Архивы >> Лазерная диагностика в биологии и медицине

Абсорбционно-трансмиссионный анализ с использованием перестраиваемых лазеров - Лазерная диагностика в биологии и медицине

Оглавление
Лазерная диагностика в биологии и медицине
Взаимодействие лазерного излучения с биологическими системами
Лазеры для диагностики биологических объектов
Техника безопасности
Лазерная нефелометрия
Лазерная поляризационная нефелометрия
Индикатор иммунологических реакций
Проточные анализаторы микрочастиц
Лазерная спектроскопия квазиупругого рассеяния
Методы обработки сигнала
Диагностика биологических объектов на основе измерения коэффициентов диффузии
Диагностика на основе регистрации скоростей направленного движения
Лазерная доплеровская спектроскопия живых клеток
Лазерная интерферометрия
Голографические методы диагностики
Абсорбционно-трансмиссионный анализ с использованием перестраиваемых лазеров
Абсорбционная спектроскопия быстропротекающих процессов
Калориметрические методы диагностики
Экспериментальные исследования оптико-акустическим методом
Конструкции спектрофонов и зондов
Области применения калориметрических методов
Физические основы спектроскопии КР
Применение спектроскопии КР в биохимических исследованиях
КР-микроскопия биологических структур
Применение спектроскопии КР в офтальмологии
Лазерный флуоресцентный анализ
Микроскопия и микроспектрофлуориметрия
Примеры применения лазерной флуоресцентной диагностики
Дистанционная флуоресцентная диагностика растений
Заключение

АБСОРБЦИОННЫЕ И КАЛОРИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
ДИАГНОСТИКИ
При решении целого ряда диагностических задач в биологии и медицине хорошо себя зарекомендовали абсорбционные методы, которые обычно применяются в лазерной аналитической спектроскопии или спектроскопии ультрабыстрых процессов, [П. 1 — П. 3, П. 40 — П. 43, 1.12, 1]. Эти методы относятся к методам микродиагностики, поскольку в них используется информация об атомной и молекулярной структуре исследуемого вещества биообъекта. Схематическое представление некоторых методов микродиагностики дано на рис. 5.1. В общем случае к абсорбционным методам относятся как абсорбционно-трансмиссионные, основанные на измерении интенсивности падающего /» и прошедшего / света разных длин волн, так и методы, основанные на регистрации поглощенной энергии путем измерения температуры АТ нагрева биообъекта (оптико-калориметрические методы) или интенсивности /ф его флуоресценции (лазерный флуоресцентный анализ).
Поскольку лазерный флуоресцентный анализ в применении к биологии получил весьма широкое распространение и имеет самостоятельное значение, он будет рассмотрен в отдельной главе, а здесь будут обсуждены возможности абсорбционно-трансмиссионных методов, а также перспективы применения оптико-калориметрических методов. Классификация абсорбционных методов диагностики и некоторые их модификации даны на схеме 2.

Абсорбционно-трансмиссионный анализ
с использованием перестраиваемых лазеров

Методика измерений, предельная чувствительность. Измерение спектра пропускания вещества в различных агрегатных состояниях является основой спектрофотометрического способа, который успешно применяется на протяжении многих лет в различных областях науки, в том числе в биологии и медицине. Его отличает чрезвычайная простота, универсальность, сравнительно высокая чувствительность и точность анализа, вполне достаточные при решении многих задач биомедицины.

Классификация абсорбционных методов диагностики
2. Классификация абсорбционных методов диагностики и некоторые их модификации

представление ряда методов микродиагностики
Рис. 5.1. Схематическое представление ряда методов микродиагностики
Измерение спектра пропускания основано на регистрации интенсивности падающего (/0) и интенсивности прошедшего в поглощающей среде путь г света (/) в зависимости от длины волны к:
(5.1)
(5.2)
где а (А,) — коэффициент поглощения; а (λ,) — эффективное сечение поглощающих частиц (см2); N — их концентрация (см-3). Предполагается, что интенсивность падающего света очень мала. Для небольших коэффициентов поглощения, когда ехр(—az)«l—аг, легко найти, что
(5.3)
В нелазерных спектрофотометрах используются широкополосные источники света, а перестройку по длинам волн осуществляют с помощью призм или дифракционных решеток. Для узких линий поглощения чувствительность зависит не только от способности прибора зарегистрировать малые изменения А/ на фоне значительного прошедшего сигнала, но и от разрешающей способности прибора. Обычно предельная чувствительность достигается при А///>10-4— 10-5.
Использование лазеров позволяет: 1) существенно повысить спектральную разрешающую способность метода, определить форму и структуру линий поглощения молекул; 2) для узких линий поглощения несколько повысить чувствительность; 3) в некоторых случаях упростить и удешевить экспериментальную установку, поскольку монохрома- гор (обычно составляющий наиболее объемную и дорогую часть установки) при наличии лазера оказывается ненужным (следует помнить, что некоторые перестраиваемые лазеры также представляют собой технически сложные и дорогие устройства); 4) за счет высокой спектральной плотности излучения лазеров снизить влияние шумов фотоприемного устройства (сам лазер за счет нестабильности выходной мощности и частоты может внести погрешности в результаты измерений, поэтому необходим контроль или стабилизация параметров лазера, что довольно просто реализуется на практике); 5) за счет высокой направленности и пространственной когерентности лазерного излучения осуществить дистанционные и трассовые измерения поглощения. В случае измерения слабых поглощений в газах и жидкостях можно применять многоходовые кюветы, насчитывающие до 30—100 проходов [П. 42], а также полые стеклянные и кварцевые оптические волокна длиной до 150 м [П. 43].
Преимущества лазерных источников света особенно проявляются в ИК области спектра при исследованиях отдельных вращательных линий колебательных полос, которые обычными спектральными приборами не разрешаются.
Итак, пороговая чувствительность абсорбционного метода определяется способностью регистрирующей аппаратуры определять наименьшее значение отношения A/min/7. Чувствительность метода может быть охарактеризована по- Разному [П. 42]. Пороговая чувствительность по оптической плотности

или по коэффициенту поглощения

где I — длина образца. Обычно система регистрации с использованием лазеров обеспечивает значение A/min//=10-5.
Минимальное число детектируемых на пути лазерного пучка радиуса w молекул

их концентрация
а также минимально обнаруживаемая концентрация примесных молекул
При а>=0,6 см, сг=10-17 см2, /=10 см, N0= 1018 см-3 (полное число молекул) и Д/т1п//=1и-6 имеем Afmln«1012; Nmin«10u см-3>' «min «10-® см-1; Cmin «10-7 (100 ppb) [П. 42]. Это характеристика следовых количеств одного вещества в другом: ррш (млн-1, частей на миллион, мкг/г); ppb (млрд-1, частей на миллиард, нг/г); ppt (трлн-1, частей на триллион, пг/г).
Применения многоходовых кювет, модуляционных и дифференциальных методик измерения полезного сигнала, позволяют существенно повысить чувствительность метода. Если амплитудная модуляция интенсивности зондирующего излучения и модуляция поглощения могут быть реализованы для любых источников света, то многократное прохождение среды (до 100 раз) и частотную модуляцию зондирующего излучения можно получить только при использовании лазеров. Таким образом была реализована рекордная для ИК спектрометров на инжекционных лазерах пороговая чувствительность amln »3-10-10 см-1. Для лазерных спектрометров из-за высокой когерентности света сильным мешающим фактором являются интерференционные эффекты в оптической схеме устройства. Этим в основном и определяются достигнутые значения аю1п [П. 42].
Существенно повысить чувствительность метода (в 102— 10Б раз) можно при использовании внутрирезонаторного поглощения, когда кювета с исследуемым веществом размещается внутри резонатора [П. 42, П. 43, 1.12]. Это повышение происходит по трем главным причинам. Во-первых, автоматически реализуется большое число проходов (до нескольких сотен, если исследуемый объект не вносит значительных потерь). Во-вторых, благодаря характерной для лазеров зависимости выходной мощности от потерь в резонаторе устраняется основная причина малой чувствительности абсорбционного метода, поскольку фактически измеряется не отношение А///, а само значение А/. И в-третьих, в режимах генерации связанных волн (многомодовый двухзеркальный лазер или кольцевой лазер) эффекты конкуренции связанных волн существенно повышают чувствительность лазеров к изменениям потерь внутри резонатора.
Внутрирезонаторный метод перспективен для регистрации очень слабых линий поглощения веществ, загрязняющих атмосферу, короткоживущих продуктов химических (биохимических) реакций, радикалов и нестабильных молекул. Для создания высокочувствительных спектрометров, работающих на принципе измерения внутрирезонаторного поглощения, в большей степени подходят перестраиваемые лазеры с широкими линиями и значительным запасом по усилению. В видимой области — это лазеры на красителях, в ИК области — лазеры на центрах окраски.
Основные области применения в биологии и медицине. Абсорбционно-трансмиссионный анализ весьма универсален и может быть с успехом применен при исследовании газов, жидкостей и твердых тел. Исследование сред в различных агрегатных состояниях является предметом биомедицинской диагностики. Газовый анализ, например, необходим при определении газообразных компонентов жизнедеятельности живых организмов, определении следовых концентраций загрязняющих веществ (задачи санитарии и профпатологии) и пр.
Для лазерного контроля загрязнений атмосферы разработаны многочисленные средства, многие из которых основаны на измерении поглощения [П. 40, П. 42]. Контроль осуществляют путем отбора проб с последующим абсорбционным анализом в многоходовых кюветах пониженного давления. Проводят трассовые измерения поглощения загрязняющих компонентов с применением разнесенных источника света и фотоприемника, удаленных зеркального отражателя или естественного рассеивателя, используя при этом дифференциальные методики измерений. Применяют также гетеродинные измерения.
Обычно загрязнители имеют характерные линии поглощения в ИК области спектра, поэтому наиболее часто используются лазерные спектрометры на основе инжекционных и молекулярных СО и С02 лазеров, обеспечивающих необходимую перестройку в диапазоне 2,5—46,2 мкм.
С инжекционным лазером порог обнаружения таких загрязнителей воздуха, как SO2, N20, NH3 и N02, находится в пределах от 1 ррb до 10 ppt, а для НСl — 0,1 ppm, HF — 0,5 ррш. Можно определять содержание HCN, Н20, СН4, С2Нв в сигаретном дыме, а также содержание токсических
примесей в выхлопных газах автомобилей, например бензола, на уровне 1 ppm [П. 42]. Для С02 лазера с дискретной перестройкой частоты измерения при атмосферном давлении методом дифференциального поглощения (зондирование атмосферы на двух длинах волн) дают порог обнаружения типичных органических молекул загрязнителей порядка 2,5-10-7—5,5* 10—5% на одном километре [П. 40].
Биологические объекты по большей части представляют собой конденсированные среды — жидкости или твердые тела. Линии поглощения таких сред значительно уширены, поэтому в принципе не требуется высокая степень монохроматичности лазерного излучения. Однако лазеры и в этих случаях оказываются весьма полезными. Во-первых, узкая линия их излучения позволяет отстраиваться от центра линии поглощения сред с высокой оптической плотностью и тем самым обеспечивать линейную зависимость поглощения от концентрации. Во-вторых, высокая спектральная яркость лазеров позволяет проводить измерения поглощения в оптически плотных образцах. Например, для инжекционных лазеров Dmax = (a/)max«12 [П. 42].
Биологические среды — это оптически неоднородные среды, поэтому они, как правило, сильно рассеивают свет. Это обстоятельство в значительной мере усложняет или даже делает невозможным измерение спектров пропускания, вызывает необходимость переходить к другим способам измерения спектров поглощения. При наличии рассеяния коэффициент а (А,) из (5.1), (5.2) имеет уже смысл коэффициента ослабления и определяется концентрацией не только поглотителей, но и рассеивателей на пути лазерного пучка. Выражения (5.1) и (5.2) сохраняют свою форму, однако а=ст0. Эффективное сечение ослабления учитывает как поглощение, так и рассеяние:

Для сферических частиц радиуса а

коэффициенты Qn и Qp в общем случае определяются на основании теории Ми. Максимальное значение этих коэффициентов достигается при и составляет 1—5 [П. 40]. При наличии многих компонентов, поглощающих и рассеивающих свет, что также характерно для биосистем, (5.2) имеет вид
где а0*=стпг+огрг, Nt — концентрация частиц t-ro компонента.
Очевидно, что в таких условиях в рамках спектрофотометрической методики поглощение уже не может быть определено без привлечения характеристик рассеяния. Для сравнительно прозрачных сред используют комбинированные методики, в основе которых лежит измерение спектров диффузного отражения биообъектов и спектров пропускания. Например, при исследованиях параметров крови (определении процентного содержания кислорода в цельной крови, концентрации общего (тотального) гемоглобина крови, концентрации метагемоглобинов) представляет большой интерес метод, использующий измерение диффузного коэффициента отражения Rn и относительного пропускания слоев крови двух толщин т12 [2, 3]. В этом случае показатель поглощения единичной толщины


где /2 и /х — толщины двух слоев; у — параметр, определяемый по измеряемому коэффициенту отражения
Лазеры довольно успешно используются для диагностики различных заболеваний, хотя пока лазерные методы не приобрели должной популярности. В [П. 39] представлен краткий обзор методов медицинской диагностики, написанный в основном по материалам зарубежных патентов, многие из которых используют абсорбционные или комбинированные методики измерений. Например, предлагается простой и быстрый способ подсчета эритроцитов и тромбоцитов, основанный на измерении интенсивности прошедшего и рассеянного света на длинах волн сильного поглощения эритроцитов (415 или 540 нм). Частицы крови проходят по одной через область, освещаемую излучением. В качестве источников света может быть взят либо лазер на красителях, либо Ат лазер с А=413,1 нм. Перспективен для этих целей и Не — Ne лазер с λ,=543,3 нм.
Можно реализовать подсчет и классификацию частиц крови по размеру и их жизнеспособности при измерениях интенсивности поглощенного частицей излучения Не — Ne лазера с λ,=632,8 нм. С использованием этого лазера можно также определять концентрацию жизнеспособных тромбоцитов в пробе крови, предназначенной для переливания. Обзор оптических методов и устройств для счета частиц, в том числе и биологического происхождения, взвешенных
в жидких средах, дан в [П. 48]. Рассмотрены методы, основанные на поглощении и рассеянии света, а также теневые и дифракционные.
Содержание кислорода, углекислого газа, окиси углерода и других веществ, включая различные продукты метаболизма (мочевина, глюкоза, этиловый спирт, полипептиды и пр.), растворенных в крови человека, является важнейшей информацией о жизненно важных процессах, происходящих в организме. Измерение степени насыщения крови кислородом основано на значительных изменениях в спектрах поглощения насыщенной и не насыщенной кислородом крови.
Из данных табл. 1.1 вытекает, что уменьшение насыщенности крови кислородом приводит к почти трехкратному возрастанию коэффициента поглощения вблизи А=620 нм. Отсюда следует простой метод оценки содержания кислорода в крови при использовании самого доступного Не — Ne лазера с Л=632,8 нм. Однако точные измерения с погрешностью 1—5 % могут обеспечить только более сложные методики [2, 3], использующие измерение как прошедшего, так и диффузно отраженного света на нескольких длинах волн, включая изобестическую длину волны Х=805 нм, для которой коэффициенты поглощения насыщенной и не насыщенной кислородом крови совпадают (табл. 1.1).
Преимущества лазеров в полной мере раскрываются при измерении концентрации растворенных в крови газов и продуктов метаболизма непосредственно через кожу человека [П. 39]. Метод основан на том, что окись углерода, кислород, углекислый газ и разнообразные органические вещества хорошо поглощают в ИК области спектра, где работают перестраиваемые СО, С02 и инжекционные лазеры. Например, для крови с большим содержанием СО, С02 и 02 максимумы поглощения наблюдаются на длинах волн 4,3; 5,13 и 9 мкм. Для глюкозы характерные линии поглощения находятся на 2,8; 4,8 и 6,1 мкм.
Техника измерений может быть различной. Можно измерять коэффициент пропускания тонкого слоя ткани в области между большим и указательным пальцами человека, в ушной раковине и т. д. либо использовать пластинку полного внутреннего отражения, по которой пропускается свет (5 отражений) и которая прикладывается к исследуемому объекту (кожа, язык и пр.). При исследовании внутренних органов можно использовать волоконно-оптический катетер. Для определения количественного содержания указанных веществ в крови необходима предварительная калибровка устройств с помощью эталонных проб. Точность определения существенно зависит от стабильности излучения лазеров. Многие из предлагаемых устройств могут быть использованы и в лабораторной диагностике проб крови и других биологических жидкостей, например мочи.
Измерение коэффициентов отражения биотканей в процессе их коагуляции необходимо для контроля термохимических процессов в очаге коагуляции, определяющих конечный результат воздействия. Такой контроль, в частности, применяют в офтальмологии для коагуляции тканей глазного дна 14]. Обнаружено, например, сильное увеличение отражения излучения на λ=441,6 нм от тканей глазного дна при коагуляции сетчатки излучением аргонового лазера (514,5 нм).
Специально для медицинских применений разработаны лазерные биофотометры, предназначенные для определения отраженной, поглощенной и прошедшей энергии биотканями поверхностных и внутренних органов [П. 28, П. 37]. В сочетании с перестраиваемыми лазерами (или набором лазеров разных длин волн), волоконно-оптическими устройствами канализации излучения и обработкой результатов измерений на ЭВМ такие фотометры окажутся полезными для диагностики патологических тканей во многих разделах медицины (например, стоматологии, офтальмологии и пр.).
При исследовании оптически плотных биологических образцов единственным информативным параметром остается коэффициент диффузного отражения, который несет информацию о спектре поглощения вещества. Примерами таких исследований являются экспрессные методы анализа биологической ценности зерна различных сельскохозяйственных культур, успешно реализованные в устройствах с тепловыми источниками, в которых селекция по длинам волн осуществляется с помощью набора узкополосных фильтров [5]. Зондирование образца (целого, размолотого зерна (шрота или муки)) на характерных длинах волн в диапазоне 1,5—2,5 мкм при соответствующей калибровке и математической обработке результатов на ЭВМ позволяет определять содержание в нем белка, жира и влаги.
Калибровка, являющаяся наиболее трудоемкой частью методики, заключается в установлении корреляционной зависимости между спектром анализируемого компонента и спектром отражения целого и размолотого зерна с последующим нахождением функциональной зависимости содержания компонента, определяемого химическим путем и из спектров отражения на отдельных длинах волн. Калибровка проводится на большом массиве образцов (30—60). Типичные значения коэффициентов корреляции на рабочих длинах волн для разных культур лежат в диапазоне 0,78— 0,99. Среднеквадратическая погрешность спектрофотометрического анализа обычно составляет 10—25 % при достоверности 90—98 %. Аналогичные исследования в видимой области (410—500 нм) позволяют определять содержание каротиноидов в крупке пшеницы (среднеквадратическая погрешность 24 % при достоверности 90 %, коэффициент корреляции 0,9).
Применение лазеров в рамках рассматриваемой методики, помимо увеличения отношения сигнал/шум, должно обеспечить высокую локальность анализа, вплоть до исследования отдельного зерна и даже отдельных малых областей целого зерна, что можно использовать в селекционной работе при разбраковке семян.



 
« Кровохарканье и легочное кровотечение   Лапароскопическая аппендэктомия у детей »