Начало >> Статьи >> Архивы >> Лазерная диагностика в биологии и медицине

Взаимодействие лазерного излучения с биологическими системами - Лазерная диагностика в биологии и медицине

Оглавление
Лазерная диагностика в биологии и медицине
Взаимодействие лазерного излучения с биологическими системами
Лазеры для диагностики биологических объектов
Техника безопасности
Лазерная нефелометрия
Лазерная поляризационная нефелометрия
Индикатор иммунологических реакций
Проточные анализаторы микрочастиц
Лазерная спектроскопия квазиупругого рассеяния
Методы обработки сигнала
Диагностика биологических объектов на основе измерения коэффициентов диффузии
Диагностика на основе регистрации скоростей направленного движения
Лазерная доплеровская спектроскопия живых клеток
Лазерная интерферометрия
Голографические методы диагностики
Абсорбционно-трансмиссионный анализ с использованием перестраиваемых лазеров
Абсорбционная спектроскопия быстропротекающих процессов
Калориметрические методы диагностики
Экспериментальные исследования оптико-акустическим методом
Конструкции спектрофонов и зондов
Области применения калориметрических методов
Физические основы спектроскопии КР
Применение спектроскопии КР в биохимических исследованиях
КР-микроскопия биологических структур
Применение спектроскопии КР в офтальмологии
Лазерный флуоресцентный анализ
Микроскопия и микроспектрофлуориметрия
Примеры применения лазерной флуоресцентной диагностики
Дистанционная флуоресцентная диагностика растений
Заключение

Глава 1
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О ЛАЗЕРАХ,
ОБЛАСТЯХ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ
В данной главе кратко обсуждены общие закономерности взаимодействия света с биологическими системами; проанализированы свойства лазерного излучения и особенности его взаимодействия с биологическими объектами; рассмотрены принципы лазерной терапии, хирургии и диагностики; приведены наиболее типичные примеры из указанных областей применения лазеров. Представлены также сведения о принципах работы и параметрах лазеров и лазерных систем. В заключение обсуждены вопросы техники безопасности при работе с лазерами.
Особенности взаимодействия лазерного излучения
с биологическими системами
Общие принципы и закономерности взаимодействия света с биообъектами. Применение лазеров в биологии и медицине основано на использовании широкого круга явлений, связанных с разнообразными проявлениями взаимодействия света с биологическими объектами [П. 1, П. 26, П. 33]. Лазерное излучение, так же как и обычный свет, может отражаться, поглощаться, рассеиваться, переизлучаться биологической средой, и каждый из этих процессов несет информацию о микро- и макроструктуре этой среды, движении и форме отдельных ее составляющих. Видимый и УФ свет могут оказывать фотобиохимическое действие. Яркими примерами этого являются фотосинтез растений и бактерий, а также механизм зрения [П. 1 — П. 3, 1]. Высокоинтенсивное световое излучение УФ, видимого и ИК диапазонов длин волн оказывает разрушающее (деструктивное) действие на биологические объекты.  Необходимые интенсивности можно создать и не только с помощью лазеров. Существуют, например, фотокоагуляторы тканей глаза на основе мощных ксеноновых ламп [П. 22, П. 32].
Таким образом, процессы, характеризующие виды взаимодействий лазерного излучения с биообъектами, можно разделить на три группы. К первой относятся все невозмущающие взаимодействия (по крайней мере, в пределах погрешностей измерений не оказывающие заметного действия на биообъект), ко второй — процессы, в которых проявляется фотохимическое действие, и к третьей — процессы, приводящие к фоторазрушению. На схеме 1 представлена классификация основных принципов применения лазеров в биологии и медицине, учитывающая указанные группы процессов.
Поскольку мы имеем дело с живыми объектами, то помимо физико-химических проявлений действия лазерного излучения необходимо учитывать его влияние и на функционирование живой материи [П. 34, 1]. Эго влияние определяется степенью гомеостаза живого объекта. Степень гомеостаза характеризует состояния и процессы, обеспечивающие устойчивость организма к внешним возмущениям, она является функцией эволюционного развития и оказывается наинизшей у биологических молекул и наивысшей у позвоночных животных. Свет малой интенсивности не запускает адаптационные механизмы биосистемы. По мере роста интенсивности сначала затрагивается гомеостаз живой системы на локальном уровне, затем включаются общие адаптационные и регуляционные механизмы системы, полностью ее восстанавливающие, далее они уже не справляются с полным восстановлением и частично происходят необратимые процессы, которые нарастают и приводят к разрушениям в системе. Однако объект можно еще считать «живым». При высоких интенсивностях разрушения оказываются настолько значительными, что объект уже не может считаться «живым».
С точки зрения применения физических методов исследования наибольший интерес представляют области очень малых и очень больших интенсивностей. В первой из них возможно применение ряда наиболее чувствительных физических методов исследования, не требующих сильных световых потоков и, следовательно, не вносящих искажений в результаты измерений за счет гомеостаза живой материи даже на локальном уровне. Вторая область интересна тем, что результаты измерений также оказываются неискаженными за счет регуляторных механизмов биосистемы, поскольку она уже «неживая».


1. Классификация основных принципов применения лазеров в биологии и медицине

Однако исследователь в этом случае имеет дело лишь с органической материей, состав и свойства которой соответствуют моменту прекращения жизнедеятельности.
Для взаимодействия света с биологическими объектами оказывается важной и длительность облучения. В этом также может проявить себя гомеостазная природа живой материи. В зависимости от длины волны и интенсивности света пороговая длительность облучения, при которой начинают происходить морфологические изменения, может быть весьма различной для одного и того же объекта. При этом в зависимости от периодичности световых импульсов возможны резонансные явления, поскольку известно, что период колебаний фотоотклика биологических систем изменяется в пределах от 10-8 до 10+8 с [П. 34, 1].
Поглощение света является одной из характеристик эффективности взаимодействия света с исследуемым биологическим объектом. Спектры поглощения биообъектов определяются типом доминирующих поглощающих центров, так называемых хромофоров, и содержащейся в них водой.

Рис. 1.1. Зависимость доли световой энергии ДЕ/Е, поглощенной кровенаполненной биотканью толщиной 1 мм, от длины волны [2]
У белков хромофорами являются различные остатки аминокислот, которые поглощают в УФ области (А,=200—300 нм), нуклеиновые кислоты также поглощают в этой области. Поглощение видимого излучения обусловлено такими биомолекулами, как гемоглобин, хлорофилл, флавины, каротиноиды, фикобилины и фитохром [П. 71.
В качестве примера на рис. 1.1 показан спектр поглощения типичной кровенаполненной биологической ткани толщиной 1 мм [2]. Свет с длинами волн 0,6—1,5 мкм относительно слабо поглощается и довольно глубоко проникает в биоткань. Например, излучение с А,= 1,06 мкм проникает на глубину в 1 см. Однако в спектральном диапазоне 2—12 мкм из-за поглощения воды, содержащейся в биоткани, свет слабо проникает в глубь ткани. В области длин волн 4—6 мкм глубина проникновения порядка 100— 150 мкм, а в области 7—12 мкм сравнима с длиной волны света. На λ=0,45—0,50 мкм поглощение определяется гемоглобином крови, а в УФ диапазоне многие биоткани сильно поглощают за счет содержащихся в них белков.
Таблица 1.1
Коэффициенты поглощения а некоторых биотканей на отдельных длинах волн X [П. 26, П. 32, 3)

Коэффициенты поглощения некоторых биотканей на отдельных длинах волн представлены в табл. 1.1, они лежат в пределах 10"1—104 см-1.
Следует отметить, что ткани передней части глаза являются в видимой области чрезвычайно прозрачными и поглощение в них очень мало [П. 32, П. 35, 4]. В то же время спектр пропускания в области коротких длин волн определяется светорассеянием. Рассеяние света биообъектами — это одно из самых характерных для них явлений. Оно связано со структурой биосистем, которые, как правило, состоят из большого числа случайно распределенных в объеме рассеивающих центров (исключение составляют лишь некоторые типы тканей, например прозрачные ткани глаза, в которых эта структура упорядочена (гл. 2)).
Для многих типов биотканей в УФ и ИК диапазонах длин волн преобладает поглощение, а рассеяние оказывается существенным в видимой и ближней ИК областях: для длин волн 0,45—0,59 мкм поглощение и рассеяние дают примерно равные вклады в коэффициент пропускания ткани, а для длин волн 0,59—1,5 мкм рассеяние превалирует над поглощением [5].
Важной оптической характеристикой биообъекта является также коэффициент отражения. Например, для большинства внутренних органов животных коэффициент отражения на отдельных длинах волн в видимой и ближней ИК областях составляет 10—30 %, кожный покров человека отражает в видимой области 10—60 % световой энергии, а коэффициент отражения глазного дна человека изменяется от 2 до 20 % при изменении длины волны от 0,4 до 1,0 мкм [П. 26, П. 35, 61. Отражение обусловлено как скачком показателя преломления на границе биообъект — воздух (френелевское отражение, обычно 4—5 %), так и обратным рассеянием от глубинных слоев ткани. При этом на глубине 4—5 мм, равной примерно трем оптическим толщинам ткани, коллимированный лазерный пучок дает сферически симметричное, близкое к изотропному излучение [5].
Следует отметить, что характер отражения, поглощения, рассеяния и флуоресценции биообъекта можно эффективно изменять разнообразными искусственными приемами. Например, окрашиванием можно изменять спектры отражения и поглощения. Такие биообъекты называются сенсибилизированными, т. е. их чувствительность к свету изменена. Сенсибилизацию биологического материала широко используют при изучении механизмов взаимодействия света с отдельными компонентами этого материала, а также в практической биомедицине для диагностики и селективной фотодеструкции отдельных компонентов биообъекта.
Для мягких кровенаполненных биологических тканей можно существенно, до 40 раз, увеличить их пропускание за счет несильного сдавливания [7]. «Просветление» живой
ткани связано с повышением ее оптической однородности за счет уплотнения рассеивающих центров (коллагеновых волокон мышечной ткани) и вытеснения крови из области надавливания, что способствует повышению показателя преломления базового вещества, который становится сравним с пoкaзaтeлeм преломления мышечной ткани [4]. Выравнивание показателей преломления светорассеивающих центров и базового вещества можно осуществить и за счет введения в ткань соответствующих препаратов. Такое «просветление» склеры глаза описано в [41.
Свойства излучения и особенности его взаимодействия с биологическими системами. Традиционная фотобиология с использованием обычных (тепловых) источников света довольно успешно развивалась в течение многих лет (есть свидетельства о том, что еще в Древнем Египте и Индии тысячи лет назад применялась фототерапия с помощью солнечного света и лекарственных препаратов, изготовленных из фруктов и растений) с выходом в практическую фотомедицину по трем главным направлениям: диагностика, терапия и хирургия [П. 19, П. 22, П. 34, 81. Многое было сделано для понимания процессов фотосинтеза растений и бактерий, выяснения природы зрения, фотопериодических явлений и пр. с помощью этих источников света [П. 1, П. 2, П. 12, 1, 9]. Появление принципиально нового инструмента — лазера подняло все эти исследования и приложения на новый, более высокий уровень, стимулировало постановку и успешное решение таких проблем, которые раньше или вовсе не ставились, или решались косвенным путем.
Прежде чем обсуждать особенности взаимодействия лазерного излучения с биологическими объектами и те новые возможности, которые оно дает в фотобиологии и фотомедицине, необходимо рассмотреть свойства лазерного излучения и их принципиальные отличия от свойств излучения тепловых некогерентных источников света (ламп накаливания, дуговых ламп, Солнца и пр.).
Напомним, что лазер представляет собой генератор оптических колебаний, использующий энергию индуцирование излучающих атомов или молекул в средах с инверсной заселенностью уровней энергии, которые обладают свойством усиливать свет определенных длин волн [10— 13]. В качестве обратной связи в лазерах используют зеркала, которые образуют оптический резонатор и обеспечивают достаточное число проходов светового пучка через усиливающую среду, чтобы все потери света в системе
были скомпенсированы за счет усиления активной среды. На рис. 1.2 схематически показано устройство лазера, включающее отражающие зеркала и активный элемент, в котором за счет различных способов накачки создается активная среда.

Рис. 1.2. Схема устройства лазера (справа показано распределение интенсивности в лазерном пучке)
При указанных условиях в лазере возникает генерация, спектр которой показан на рис. 1.3, т. е. лазер излучает несколько волн, отличающихся частотой и интенсивностью, это так называемые продольные моды лазера.
Обычный (тепловой) источник света отличается от лазера тем, что основной вклад в излучение дают спонтанные переходы, в системе отсутствуют инверсия и оптическая обратная связь.

Рис. 1.3. Спектр продольных мод лазера
Все это приводит к существенным различиям в свойствах лазерных и нелазерных источников света. Лазерные источники обладают высокой степенью монохроматичности (временной когерентности), пространственной когерентности, направленности, поляризованности, интенсивности и яркости, сверхкороткой длительностью импульсов и перестраиваемостью длины волны излучения.
Монохроматичность или высокая спектральная плотность мощности (интенсивности) излучения, или знача-
тельная временная когерентность лазерного излучения обеспечивают, во-первых, проведение спектрального анализа с разрешением, на много порядков превышающим разрешение традиционных спектрометров; во-вторых, высокую степень селективности возбуждения определенного сорта молекул в их смеси, что очень важно именно в биологии; в-третьих, позволяют,* реализовывать голографические и интерферометрические методы диагностики биообъектов.
Степень монохроматичности одномодового газового лазера определяется шириной линии генерации fiv этой моды, которая обусловлена квантовыми флуктуациями, вибрациями, акустическими шумами, плазменными колебаниями в активной среде и т. д. и составляет величину от десятков герц до десятков мегагерц [14].
Высокая монохроматичность определяет значительную спектральную плотность излучения. Например, для лазера с выходной мощностью Р=1 Вт, 6v=l МГц, радиусом пучка W—2 мм и А,=500 нм спектральная плотность мощности, падающая на единицу поверхности, равна 2,6 X X107 Вт/(нм -см2). Для сравнения, аналогичная величина для солнечного излучения равна 1,3 -10-4 Вт/(нм-см2).
Для импульсных лазеров ширина линии ограничена длительностью импульса ти, 6v«1/t„ и может составлять довольно значительные величины для лазеров с короткой длительностью импульсов (6v»l ГГц для т„=10-в с).
В зависимости от решаемых задач и конкретных условий измерений для лазеров, работающих на многих модах, можно обеспечить различную степень монохроматичности. С одной стороны, отдельная мода практически сохраняет свою высокую монохроматичность (узкую ширину линии 6v), а с другой — мод становится много и их спектр занимает уже ширину AvivNc/2nL, где N — число продольных мод, c/2nL — частотное расстояние между ними, определяемое оптической длиной резонатора nL, с — скорость света, п — показатель преломления активной среды (рис. 1.3).
Изменения в степени монохроматичности находят отражение и во временной когерентности такого источника, т. е. его способности образовывать четкую интерференционную картину при соответствующей временной задержке складываемых световых пучков. Удобно временную [когерентность характеризовать длиной когерентности
Для одномодовых лазеров длина когерентности может быть чрезвычайно большой — 3 -108—3 *10? см, что превосходит типичные потребности биологических и медицинских исследований.

Лазеры характеризуются высокой степенью поляризованности излучения. В этом проявляются когерентные свойства их излучения. Однако вид поляризации (линейная, круговая, эллиптическая) у разных лазеров может быть разным. В большинстве случаев это связано со свойствами оптического резонатора. Резонаторы с брюстеровскими окошками разрядной трубки или внутренними призмами имеют устойчивую линейную поляризацию. Для промышленных лазеров с линейной поляризацией степень поляризованности, т. е. отношение интенсивностей света при взаимно ортогональных положениях поляризационного анализатора, /ц : /х=500 : 1. При этом для лазеров с малым усилением квантовые и технические флуктуации практически не приводят к деполяризации излучения [14].

Другой класс часто используемых резонаторов лазеров — это изотропные резонаторы. Например, промышленность выпускает лазеры с внутренними зеркалами. Высокое качество зеркал таких лазеров обеспечивает идеальную круговую поляризацию излучения, /ц : /j.=l : 1. Однако степень поляризации (азимут и эллиптичность) у этих лазеров оказывается более чувствительной к возмущениям, чем в случае сильно анизотропных резонаторов [14].
Передача лазерного излучения по волоконным световодам круглого сечения приводит к деполяризации излучения за счет возбуждения многих волноводных мод. В зависимости от типа световода длина, на которой происходит полная деполяризация излучения, изменяется от нескольких десятков сантиметров до нескольких метров. Сравнительно широкие медицинские световоды с диаметром сердцевины 400—1000 мкм имеют малую длину деполяризации (несколько десятков сантиметров). Разработаны специальные одномодовые анизотропные световоды (например, с эллиптическим сечением сердцевины), которые сохраняют состояние поляризации на расстояниях в несколько сотен метров, однако поперечные размеры сердцевины таких световодов чрезвычайно малы, 5—7 мкм, поэтому существует проблема ввода излучения.
Чрезвычайно высокая интенсивность лазерного излучения позволяет сконцентрировать в малом объеме значительную световую энергию, тем самым вызвать многофотонные и другие нелинейные процессы в биологической среде, локальный тепловой нагрев, быстрое испарение, гидродинамический взрыв и т. д.
Выше уже приводился ряд примеров, иллюстрирующих высокую интенсивность лазерных пучков. Однако с точки зрения приложений не интенсивность, а яркость является наиболее важным параметром любого источника, в том числе и лазерного. Яркость В определяется как мощность, приходящаяся на единицу площади и единицу телесного угла, или интенсивность в единице телесного угла. Для пучка кругового сечения радиусом w(0), расходимостью 0 и полной мощностью Р яркость

или с учетом (1.1) для лазерных пучков В=Р/Х2 Вт/(см2 -ср), где ср — стерадиан — единица телесного угла.
Интенсивность, которую можно получить в фокусе линзы, оказывается тем больше, чем больше яркость пучка. Оптическая обработка пучка с помощью системы линз и других оптических элементов, как правило, не может увеличить яркость, поскольку сжатие пучка всегда сопровождается увеличением его расходимости.
Свойство перестраиваемости длины волны лазерного излучения в совокупности с его чрезвычайной монохроматичностью позволяет использовать лазеры в качестве спектрометров ультравысокого разрешения. В принципе любой лазер допускает перестройку частоты (длины волны). Правда, для одних лазеров она может быть только дискретной с очень узким диапазоном вблизи дискретных длин волн, а для других непрерывной в довольно широком диапазоне длин волн. Наличие перестраиваемых лазеров во всей области от УФ до ИК позволяет селективно возбуждать практически любые состояния биомолекул и отдельных ее фрагментов.
Обсуждая свойства лазерного излучения, нельзя не обратить внимание на одно важное для применения свойство — способность формировать спекл-картину при отражении от шероховатой поверхности. Рассеянный этой поверхностью свет состоит из хаотического скопления темных и светлых пятен (спеклов). Причина этого явления состоит в высокой когерентности лазерного излучения, и оно обусловлено сложной интерференцией вторичных волн от небольших рассеивающих центров, расположенных на поверхности объекта. Поскольку биообъекты в большинстве своем шероховаты, то они всегда должны формировать спекл-картину и в этом смысле вносить некоторые искажения в результаты исследований. С другой стороны, спекл-поле несет информацию о свойствах поверхности биообъекта, что можно использовать, например, в диагностических целях.
Если спекл-картина наблюдается на достаточно удаленном от объекта экране, то средний диаметр зерна (спекла) определяется соотношением dttMlw, где I — расстояние от объекта до экрана, w — радиус лазерного пучка на объекте [13].
Принципы лазерной диагностики, наиболее типичные примеры. Настоящая книга целиком посвящена лазерной диагностике в биологии и медицине. В последующих главах будут разобраны наиболее интересные методы неразрушающей диагностики, оценены их возможности и перспективы. Здесь, в вводной главе, определены лишь главные принципы и приведены некоторые из наиболее ярких примеров [П. 33]. Как уже отмечалось, методы лазерной диагностики делятся на микродиагностические (на уровне атомов и молекул) и макродиагностические (на уровне клеток и органов). Микродиагностика использует все средства линейной и нелинейной лазерной спектроскопии, а макродиагностика — методы упругого и квазиупругого рассеяния, интерферометрию и голографию.
Традиционно, спектральный анализ широко применяется в биологии для анализа, например, следовых концентраций веществ при изучении метаболизма живых организмов и в токсикологии. Однако нелазерные источники света позволяют в лучшем случае обеспечить детектирование сигнала от 1010 атомов или молекул одного сорта. С использованием лазеров удается реализовать сверхчувствительные методы, позволяющие детектировать даже отдельные атомы или молекулы, проводить атомный анализ непосредственно на реальных объектах, не прибегая к их предварительной подготовке. Одним из примеров является метод прямой резонансной фотоионизации, успешно примененной к определению следовых концентраций алюминия в крови человека [П. 42].
Сочетание резонансной фотоионизации молекул с традиционной масс-спектрометрией позволяет существенно повысить чувствительность и получать ее для случая определения содержания триптофана в воде на уровне 10“14 г.
Лазерная спектроскопия оказывается особенно эффективной при исследовании загрязнений окружающей среды (флоры и фауны, пищевых продуктов и пр.) токсическими и патогенными веществами и анализе путей их проникновения в человеческий организм. Даже сравнительно простой флуоресцентный анализ в комбинации с хроматографией при использовании лазеров оказывается очень чувствительным. Лазерно-флуоресцентная спектроскопия с применением сенсибилизаторов патологических тканей, например производных гематопорфирина, оказывается очень эффективной при ранней диагностике раковых и других заболеваний [П. 36].
Оптико-акустическая спектроскопия имеет свои особые преимущества при исследовании биологических объектов, главное из которых состоит в малом влиянии рассеяния на результаты измерения спектров поглощения, что очень важно для неоднородных по структуре биологических сред 1П. 23, П. 41]. Лазерное возбуждение обеспечивает и здесь высокое спектральное разрешение, локальность и дистанционность анализа, возможность использования волоконной техники.
Жесткая фокусировка мощных лазерных пучков используется в целом ряде методик, реализующих микро- спектральный анализ биологических объектов. Лазерный отбор микропробы с поверхности биообъекта путем испарения микрообъема вещества (1 мкм*) с последующим масс- спектральным анализом этого пара лежит в основе лазерной микроаналитической масс-спектроскопии (ЛАММА-метод) и промышленных лазерных масс-анализаторов [П. 42, П. 47].
Существуют и неразрушающие методы микроспектрального анализа биообъектов, например лазерная микро- флуориметрия отдельных живых клеток или органелл [П. 7]. Пространственное и временное разрешение метода составляет, соответственно, 0,3 мкм и 0,2 не. Он может быть полезен при флуоресцентном картировании генов. Для прямого наблюдения первичной структуры ДНК может оказаться наиболее подходящим комбинированный метод, сочетающий селективную лазерную ионизацию молекул хромофоров с ионно-полевой микроскопией. Изотопически-селективное детектирование отдельных атомов может быть использовано для анализа путей метаболизма живых организмов in vivo * ) в том числе на клеточном уровне.

*На живом (лат.).


Лазерные импульсы пикосекундной и субпикосекундной длительности нашли самое широкое применение для изучения первичных процессов фотосинтеза, зрения и биохимических реакций с участием гемоглобина, ДНК и других биологически важных молекул [П. 1 — П. 3]. Ультрабыстрые процессы являются характерными для биологии, причем для одного и того же объекта времена фото- физических и фотохимических процессов могут занимать очень широкий диапазон, например, для гемоглобина 10-6— 10-16 с [П. 24]. Исследования этих процессов требуют применения импульсных лазеров и новых методик спектроскопии, включая спектроскопию комбинационного рассеяния (КР) в наносекундном и пикосекундном диапазонах, быстродействующие абсорбционные методы во временном масштабе от наносекунд до фемтосекунд и пикосекундную флуоресцентную спектроскопию [П. 1].
Получило развитие и такое направление в диагностике, как дистанционное лазерное зондирование биологических объектов (фитопланктона] и нефтяных загрязнений водных сред, биологически активных примесей в атмосфере, наземной растительности и пр.), основанное на КР и флуоресцентной спектроскопии [П. 16, П. 17].
В основе биомедицинской макродиагностики лежит использование высокой монохроматичности и когерентности лазерного излучения, которая позволяет измерять положение, скорость, малые перемещения и форму различных компонентов биологических объектов. Заметим, что большинство из перечисленных ниже примеров в принципе не может быть реализовано с помощью тепловых источников света.
Одним из первых эффективных применений лазеров в биомедицине была пролетная цитометрия, когда лазер был применен для ускорения анализов и сепарации отдельных клеток млекопитающих за счет точных измерений их оптических свойств — характеристик вызванной лазером флуоресценции [16]. Цитофлуориметры первого поколения на основе Аг лазеров с λ=488 нм выпускаются промышленностью. Готовятся к выпуску цитофлуориметры второго поколения на основе более коротковолнового Не — Cd лазера с λ=441,6 нм.
Другое не менее эффективное применение лазеров — это лазерная анемометрия, которая заключается в измерении малых скоростей движения биологических жидкостей (например, скорости кровотока в сосудах, подвижности бактерий, сперматозоидов и пр.). Этот метод основан на измерении доплеровского сдвига частоты излучения лазера, который возникает при обратном рассеянии света от движущихся частиц микронного размера.
Голография и интерферометрия являются мощными средствами диагностики вообще и биомедицинской в частности. Голографические методы позволяют получать трехмерные изображения биообъектов, контуры этих объектов могут быть картированы, а их деформации проанализированы в реальном масштабе времени. Эти новые возможности могут оказать влияние на развитие многих разделов медицины: ортопедию, радиологию, офтальмологию, урологию и отологию. Большие потенциальные возможности в этом смысле имеет классическая интерферометрия при использовании лазерных источников (например, при создании ретинометров — устройств для определения ретинальной остроты зрения), а также спекл-интерферометрия (например, для определения структуры и шероховатости некоторых биотканей).
Упругое рассеяние при использовании лазерных источников света в сочетании с полным анализом поляризационных характеристик индикатрисы рассеяния позволяет эффективно изучать слабопоглощающие анизотропные двухкомпонентные биоткани, например ткани глаза [17]. Упругое светорассеяние оказывается также эффективным в ряде задач иммунологии, вирусологии и гематологии. Применение лазеров в этих исследованиях позволяет существенно упростить измерения и повысить их надежность.
Обсуждая проблемы лазерной диагностики, нельзя не затронуть две другие области биомедицинских применений лазеров: лазерную терапию и хирургию, хотя бы потому, что, проводя диагностику, необходимо знать, какие последствия могут иметь место, если уровни мощности и дозы лазерной засветки соответствуют терапевтическим или хирургическим. Как и раньше, при изложении будем в основном следовать работе [П. 33].
Физико-химические основы лазерной терапии, типичные примеры. В основе лазерной терапии лежит управление биохимическими процессами с помощью света, который возбуждает биомолекулы. Возбужденная молекула либо сама принимает участие в химической реакции, либо передает свое возбуждение другой молекуле, участвующей в химических превращениях. Различают однофотонное возбуждение (малые интенсивности света — линейная фотобиология) и многофотонное (большие интенсивности — нелинейная фотобиология), когда молекула может поглотить более чем один фотон.
Однофотонные, фотобиохимические процессы, лежащие в основе фототерапии или фотохимиотерапии желтухи новорожденных (избыточной билирубинемии), различных заболеваний кожи [8], а также рака [П. 36], хорошо известны в фотобиологии. Фотохимиотерапия рака при использовании производных гематопорфирина (ПГП) является классическим примером. При введении в организм молекулы ПГП имеют тенденцию накапливаться в клетках патологических тканей. Один из возможных механизмов, лежащих в основе терапии, заключается в следующем. Молекулы ПГП хорошо возбуждаются видимым светом и передают это возбуждение через триплетные состояния молекулам кислорода, присутствующим в тканях. В свою очередь молекулы кислорода возбуждаются в синглетное состояние, которое является химически активным и разрушает клетки. Этот процесс называют фотодинамическим эффектом.
Рассматриваемые процессы возможны при сравнительно малых интенсивностях света (около 1 Вт/см2), которые можно получить от нелазерных источников света. Тем не менее применение лазеров дало новый весьма существенный толчок в развитии фотодинамической терапии, поскольку благодаря высокой спектральной интенсивности, пространственной когерентности и малой расходимости их излучения оказалось возможным обеспечить значительную селективность воздействия и эффективную доставку излучения к труднодоступным тканям с помощью волоконных световодов.
Терапия с помощью красного света (>.=632,8 нм) Не — Ne лазера нашла широкое применение для лечения трофических и долго не заживающих ран и язв (например, [П. 25]). Часто терапевтический эффект красного лазерного света связывают с его когерентностью или высокой поляризованностыо. Однако эти аргументы представляются несостоятельными только по той причине, что при используемых интенсивностях скорость возбуждения молекул оказывается в 1010раз более медленной, чем скорость релаксации возбужденных молекул (скорость потери когерентности) в конденсированной среде при нормальной температуре. Действительно, терапевтический эффект наблюдается и с нелазерными источниками света при облучении на ряде длин волн в диапазоне 400—850 нм, однако лазеры в соответствии с перечисленными выше причинами оказываются более удобным инструментом. Местный лечебный эффект низкоинтенсивного излучения на длинах волн Не — Ne (Х=632,8 нм), Не — Cd (А,=441,6 нм) и GaAs (А,=830 нм) лазеров, по-видимому, связан с регуляторным действием света этих длин волн на пролиферативную активность клетки (скорость прохождения клеточного цикла), когда свет выступает в роли триггерного регулятора клеточного метаболизма [18, 19]. Фотоакцепторами низкоинтенсивного монохроматического лазерного излучения в клетке являются эндогенные сенсибилизаторы.
Перечислим другие терапевтические применения лазеров малой мощности [20]. В дерматологии — это лечение нейродермита, экземы, красного плоского и опоясывающего лишая, рецидивирующего герпеса, липоидного некробиоза, келоидных рубцов, локального зуда кожи и др. Лазерная терапия применяется в ортопедии, в том числе при замедленной консолидации и несрастающихся переломах костей, а также при лечении ревматоидного артрита. В невропатологии ее используют при лечении многих заболеваний периферической и центральной нервной системы: остеохондроза позвоночника, невралгий тройничного нерва, рассеянного склероза и пр. При этом применяют лазерную рефлексотерапию (лазеропунктуру), облучая биологически активные точки, рекомендуемые при соответствующем заболевании в классической рефлексотерапии. Лазеры успешно применяют в гинекологии, стоматологии [П. 31], при лечении хронических тонзилитов, воспалительных заболеваний среднего уха, недостаточного кровоснабжения конечностей (путем внутривенного облучения крови) и пр.
Многофотонное возбуждение биомолекул можно обеспечить с помощью короткого лазерного импульса сравнительно небольшой энергии, но большой пиковой мощности.
При этом для двухступенчатого возбуждения триплетных уровней достаточно импульсов наносекундной длительности, а для более короткоживущих синглетных уровней необходимы длительности в пикосекундном диапазоне.  Например, использование двухквантового возбуждения электронных состояний биомолекул в растворах приводит к диссоциации и образованию радикалов молекул растворителя. Принципиальное отличие такого фотолиза от у- радиолиза состоит в том, что молекулы растворителя диссоциируют только вблизи молекул-хромофоров, которые поглощают лазерное излучение, а не во всем облучаемом объеме, как это происходит при у-радиолизе. Этот эффект может найти применение в лазерной терапии раковых опухолей, поскольку он обеспечивает продуцирование радикалов воды, которые поражают раковые клетки.
За счет исключения синглет-триплетной конверсии двухквантовое возбуждение по сравнению с одноквантовым позволяет повысить эффективность фотохимической реакции. Например, переход от низкоинтенсивного возбуждения (1 Вт/см2) к высокоинтенсивному (10е Вт/см2) повышает квантовую эффективность фотомодификации порфирина в растворе в 100 раз. Подобные эксперименты с ПГП показывают, что такое возбуждение дает более сильный цитотоксический эффект, чем низкоинтенсивное.
Двухквантовые фотохимические реакции наблюдались в биологических системах разного уровня организации (вирусы, дрожжи и клетки). Этот подход должен найти применение в генной инженерии. Например, при исследованиях in vivo удается наблюдать различные типы повреждений молекул нуклеиновых кислот (разрывы и сшивки), что открывает возможность изучения пространственной структуры и функций сложных биомолекул (белки, нуклеиновые кислоты) [П. 1).
Таким образом, многофотонное возбуждение биомолекул является основой новой эффективной нелинейной фототерапии, использующей короткие лазерные импульсы, способные производить значительные фотохимические эффекты при таких малых средних интенсивностях, когда тепловые эффекты отсутствуют.
Основы лазерной хирургии, типичные примеры. Преимущества лазерной хирургии хорошо известны — это бесконтактность, дающая абсолютную стерильность; селективность, позволяющая выбором длины волны облучения разрушать патологические ткани, не затрагивая окружающие здоровые; широкий диапазон интенсивностей, что дает возможность обеспечивать требуемое воздействие на биообъект: плавление и выпаривание при сравнительно небольшом разогреве, гидродинамическое разрушение за счет локального интенсивного импульсного нагрева или фотохимическое разрушение [П. 18 — П. 22, П. 26 — П. 30, П. 33, П. 37, 21]. Отметим еще бескровность лазерных операций, а также широкие возможности при микрохирургии тканей и клеток благодаря высокой степени фокусировки пучка и пороговому характеру фоторазрушения.
Наиболее значительные достижения лазерная хирургия имеет в офтальмологии [П. 22, П. 32, П. 37, 22]. Это операции на стекловидном теле, фотокоагуляция сетчатки, лечение диабетической ретинопатии, приваривание отслоившейся сетчатки, пробивка отверстий для обеспечения нормального функционирования шлеммова канала при лечении глаукомы и пр.
Широкие возможности открываются у лазерной хирургии при использовании волоконных световодов, способных передавать значительные мощности. Например, применение волоконно-оптических катетеров позволяет реализовать лазерную ангиопластику — разрушение (абляцию) склеротических бляшек в кровеносных сосудах [П. 26, 23— 26]. Для испарения бляшки достаточно в течение 1—40 с облучать ее светом аргонового лазера мощностью 3—4 Вт. Наиболее перспективными для этих целей считаются эксимерные лазеры (А=200—300 нм), поскольку разрушающее действие импульсного УФ излучения на бляшки носит в основном фотохимический характер, требуемая энергия при этом существенно меньше, поэтому снижается опасность повреждения стенок сосудов. Малая глубина проникновения УФ излучения в ткань позволяет осуществлять тонкий послойный контроль за процессом абляции.
В последнее время УФ излучение эксимерных лазеров начинает использоваться при лечении различных кератозов, а также для коррекции дефектов зрения за счет послойной абляции тканей роговицы.
Значительные перспективы в биологии имеет лазерная микрохирургия живых клеток. Локальность воздействия может быть доведена до 0,01 мкм. Широкие пределы изменения длины волны лазерного излучения и длительности импульса позволяют реализовать любой из видов фоторазрушения от теплового до многофотонного фотохимического. Все это дает новые возможности в микрохирургии хромосом, митатических органелл и цитоплазмы, имеет выход в генетическую инженерию.



 
« Кровохарканье и легочное кровотечение   Лапароскопическая аппендэктомия у детей »