Начало >> Статьи >> Архивы >> Лазерная диагностика в биологии и медицине

Конструкции спектрофонов и зондов - Лазерная диагностика в биологии и медицине

Оглавление
Лазерная диагностика в биологии и медицине
Взаимодействие лазерного излучения с биологическими системами
Лазеры для диагностики биологических объектов
Техника безопасности
Лазерная нефелометрия
Лазерная поляризационная нефелометрия
Индикатор иммунологических реакций
Проточные анализаторы микрочастиц
Лазерная спектроскопия квазиупругого рассеяния
Методы обработки сигнала
Диагностика биологических объектов на основе измерения коэффициентов диффузии
Диагностика на основе регистрации скоростей направленного движения
Лазерная доплеровская спектроскопия живых клеток
Лазерная интерферометрия
Голографические методы диагностики
Абсорбционно-трансмиссионный анализ с использованием перестраиваемых лазеров
Абсорбционная спектроскопия быстропротекающих процессов
Калориметрические методы диагностики
Экспериментальные исследования оптико-акустическим методом
Конструкции спектрофонов и зондов
Области применения калориметрических методов
Физические основы спектроскопии КР
Применение спектроскопии КР в биохимических исследованиях
КР-микроскопия биологических структур
Применение спектроскопии КР в офтальмологии
Лазерный флуоресцентный анализ
Микроскопия и микроспектрофлуориметрия
Примеры применения лазерной флуоресцентной диагностики
Дистанционная флуоресцентная диагностика растений
Заключение

Конструкции спектрофонов и зондов
Нерезонансные спектрофоны и зонды. Под нерезонансным спектрофоном понимают такую ОА ячейку, которая не обладает заметными акустическими резонансными свойствами. Наиболее простой и самой распространенной конструкцией спектрофонов, используемых при исследовании газов, является цилиндр с прозрачными для лазерного излучения окнами на торцах и с микрофоном в боковой стенке цилиндра (рис. 5.6а).

Увеличения чувствительности можно добиться оптимизацией формы ячейки или многократным пропусканием лазерного пучка через ячейку. Насколько это возможно, стремятся уменьшить эффективное сечение ячейки, так как, согласно (5.7) и (5.10), амплитуда ОА сигнала обратно пропорциональна сечению (R2). Однако для снижения влияния стенок отношение радиусов светового пучка и ячейки, как правило, не должно превышать 0,2.


Рис. 5.6. Спектрофоны и зонды, используемые при исследовании газообразных веществ (а, б), жидкостей (в — д), порошков, тонких пленок и биотканей (е — и): 1 — пучок света, 2 — ОА детектор, микрофон или пьезоэлектрический преобразователь, 3 — окошко, 4 — исследуемый биообъект, 5 — кварц, 6 — липкая лента
Поскольку реальная чувствительность спектрофона определяется уровнем фоновых сигналов, то конструирование ОА ячеек идет по пути максимального снижения влияния этих сигналов. Один из возможных путей — это сравнение сигналов от двух идентичных ячеек, заполненных газами с близкими термодинамическими параметрами и освещаемых одинаковыми пучками света. Возможно как параллельное, так и последовательное расположение ячеек. В общем случае при равных объемах камер их длины и соответственно диаметры могут быть различными, поскольку, согласно и (5.10), полезные сигналы от таких камер сильно различаются по амплитуде, а фоновые остаются одинаковыми и «вычитаются» на дифференциальном микрофоне.
Хороших результатов можно достигнуть, существенно уменьшая объем ячейки, используя, например, явление полного внутреннего отражения на границе измерительная призма — исследуемый газ (или жидкость). Оптимизация размеров такой ячейки позволяет снизить ее объем до 0,25 мкл и обеспечить чувствительность на уровне пг.
Важным преимуществом миниатюрных ячеек является возможность работы на сравнительно высоких частотах модуляции 0,1—1,3 кГц, так как время тепловой релаксации ячейки уменьшается пропорционально площади ее поперечного сечения R2 (5.8). Это обеспечивает низкий уровень шумов электронной схемы и возрастание быстродействия всего устройства в целом.
При исследовании паров различных веществ можно использовать простую ячейку, изготовленную из цилиндрической кварцевой 1-миллиметровой кюветы, соединенной с кварцевой трубкой (длиной 60 мм, внутренним диаметром 2 мм), открытый конец которой закрывается тефлоновой пробкой, внутри которой расположен микрофон (рис. 5.66). Изменение давления паров передается микрофону по узкому каналу диаметром 0,2 мм, высверленному внутри пробки. С целью устранения попадания паров в полость микрофона соединительный канал перегорожен тефлоновой диафрагмой.
Для регистрации ОА сигнала в жидкости используют три основных типа спектрофонов: газомикрофонные, жидкостные открытого и закрытого типов. В газомикрофонных ячейках в качестве измерителя амплитуды акустического сигнала используют обычные микрофоны, а передатчиком акустических колебаний, возникающих при поглощении света в жидкости, является газ. Устройство закрытых жидкостных спектрофонов аналогично устройству газомикрофонных. Однако в качестве датчика ОА сигнала (гидрофона) обычно применяют пьезоэлектрический преобразователь,  находящийся в непосредственном контакте с жидкостью или связанный с ней через согласующие или защитные элементы.
Благодаря простоте конструкции довольно широкое распространение получила жидкостная ячейка, выполненная на основе пьезокерамического цилиндра, который одновременно является и боковой стенкой ячейки, и приемником ОА сигнала (рис. 5.6в). С помощью такой ячейки была достигнута пороговая чувствительность устройства по поглощению а=2,2- li/-5 см-1. Одна из схем открытой ячейки показана на рис. 5.5. При определенных условиях, например при расположении преобразователя на достаточном удалении от окон (переднего и заднего), фоновые сигналы будут ослаблены и преобразователь должен регистрировать в основном сигнал от жидкости.
Часто бывают необходимы проточные ячейки, в которых исследуемая жидкость омывает окно рабочей камеры. В данном случае окно не только пропускает излучение в ячейку, но и служит приемником оптического сигнала, который преобразуется в электрический с помощью плотно контактирующих с окном одного или нескольких пьезоэлектрических преобразователей. Материал окна должен обладать необходимыми акустическими свойствами, поэтому часто используют сапфир. Объем исследуемой жидкости существенно меньше объема рабочей камеры и может составлять 1 мкл, так как при таком способе регистрации ОА сигнала основное влияние оказывает поглощение в тонкой пленке вблизи окна.
Наиболее удобны в биологических исследованиях такие спектрофоны, которые допускают быструю смену исследуемой жидкости и работу со стандартными кюветами. Одна из таких конструкций представлена на рис. 5.6г. Кварцевая кювета с исследуемой жидкостью плотно прилегает к кварцевому цилиндру, что обеспечивается с помощью тонкой пленки смазки (например, капли глицерина). Между кварцевым цилиндром и опорным металлическим цилиндром с помощью винта закрепляется пьезоэлектрический преобразователь. Для уменьшения фоновых сигналов от окон применяется дифференциальное включение двух последовательно расположенных ячеек. Для повышения отношения сигнал/шум кварцевый цилиндр между кюветой и пьезопреобразователем иногда заменяют на зеркало, отражающее рассеянный в жидкости свет, а металлическое основание размещают в среде, поглощающей акустические колебания.
Для спектроскопических исследований конденсированных сред удобными в эксплуатации оказываются ОА зонды, один из которых показан на рис. 5.6(5. Основной элемент — стержень из плавленого кварца (диаметр 8 мм, длина 20 см) является акустическим волноводом. К стержню с помощью клея прикреплен пьезоэлектрический преобразователь (диаметр 12,7 мм, толщина 3 мм), который фиксируется диэлектрическим винтом. Эта часть устройства размещена в металлической коробке, являющейся электрическим экраном. Резиновая прокладка уменьшает акустическую связь коробки и стержня. Стержень опущен в кювету с жидкостью, через которую на 3 мм ниже нижнего среза зонда пропускается лазерный луч. Такой зонд удобен для применения в биологии и медицине. Его достоинства заключаются в том, что импульсы света и звука сдвинуты во времени, преобразователь акустических колебаний удален от источника колебаний, его устройство допускает охлаждение и работу с коррозирующими жидкостями.
При исследовании порошков, тонких пленок и биологических тканей возможно применение различных типов спектрофонов. Их можно разделить на три группы.
К первой относятся спектрофоны, в которых используется непосредственный контакт либо преобразователя, либо кварцевого звукопровода с исследуемым объектом с помощью акустически связующей тонкой пленки жидкости (рис. 5.5) или струбцины (рис. 5.6е). Спектрофоны, представленные на рис. 5.5, удобны для измерения коэффициентов поглощения в объемных телах, а устройство, показанное на рис. 5.6е,— в порошках и тонких пленках. В этих схемах ослабление влияния рассеянного света на датчик, вызывающего фоновый сигнал, обусловленный пироэлектрическим эффектом, достигается за счет сложной конфигурации звукопровода. Устранить влияние рассеянного света можно либо напылением зеркального слоя в месте контакта звукопровода с пьезоэлектрическим элементом, либо использованием дифференциальной схемы с двумя пьезоэлементами, один из которых механически не связан со звукопроводом, но облучается рассеянным излучением той же интенсивности, что и рабочий.
Удобным для исследования спектров в условиях низких температур оказывается датчик, представленный на рис. 5.6ж. Основой датчика является кварцевый блок размером 2,5x1,2x0,18 см, который зажимается между медной скобкой и пьезоэлектрическим преобразователем. Малые габариты датчика позволяют размещать его в криостате Целиком. Датчик был использован для исследования ОА спектров порошков, растворенных в глицерине при 10 К. Он прост в изготовлении и может найти применение в биологических исследованиях при низких температурах.
Ко второй группе спектрофонов относятся газомикрофонные ячейки. В настоящее время это наиболее распространенный тип спектрофонов, используемых в биологии и медицине. Подстройка объема рабочей камеры, давления газа, его состава и частоты модуляции необходимы для оптимизации ОА сигнала как по амплитуде, так и по фазовому сдвигу. Интересный вариант спектрофона представлен на рис. 5.6з. Дифференциальный микрофон смонтирован между двумя идентичными ячейками. В одну из них введен световод для освещения объекта, а в другую — винт, который позволяет изменять объем ячейки и добиваться минимума влияния фоновых сигналов. Такой детектор приклеивается липкой лентой к исследуемому объекту, например к поверхности кожи человека, листа растения.
Наконец, к третьей группе следует отнести конструкции, в которых жидкость используется в качестве преобразователя тепловых колебаний образца в акустические. Пример такой ячейки показан на врезке рис. 5.5.
Резонансные спектрофоны [П. 23, П. 41]. В резонансных спектрофонах реализуется значительное отношение объема ячейки к ее поверхности, что позволяет с большой надежностью работать с газами, поглощаемыми стенками ячейки. Пространственное распределение акустических полей в соответствии с установившимися типами колебаний позволяет вводить необходимые конструктивные элементы (неоднородности), например трубки для ввода и вывода газа, в те места ячейки, где находится узел стоячей акустической волны, не искажая ее. Более того, одним из важнейших направлений конструирования резонансных ОА ячеек является устранение фоновых сигналов от окон и других элементов конструкции. Прием тот же самый: в акустическом резонаторе необходимо возбудить такой тип колебаний, чтобы в области локализации окон и этих элементов стоячая волна имела узел.
Типичные значения частоты и добротности акустических резонаторов соответственно равны /р=102—101 Гц, Q= = 102—10:‘. Сравнительно высокая частота колебаний снижает амплитуду ОА сигнала. При этом уменьшение амплитуды не может быть полностью скомпенсировано увеличением добротности Q резонатора (для резонансных ячеек в формулу (5.10) необходимо подставить частоту рабочего резонатора и домножить на параметр Q). С другой стороны, увеличение частоты способствует повышению быстродействия и увеличению отношения сигнал/шум измерительного устройства. В принципе любая из конструкций, представленных на рис. 5.6, будет проявлять резонансные свойства на определенных частотах; однако эти ячейки не оптимизированы по своим резонансным свойствам, и поэтому акустические резонансы, возникающие в системе, как правило, являются мешающими факторами.
Сравнительно низкие резонансные частоты, возможность управления параметрами имеют так называемые резонаторы Гельмгольца (рис. 5.6ы). Они успешно применяются при исследовании как газообразных, так и конденсированных сред, в том числе при исследованиях биологических тканей in vivo [П. 46]. Особенно полезными они оказываются, при исследованиях поглощения в твердых телах и жидкостях при низких температурах. В таких случаях используются протяженные ячейки, т. е. микрофонный отсек, содержащийся при комнатной температуре, соединяется узким длинным каналом с рабочим отсеком, находящимся в криостате. Чем длиннее соединительный канал, тем отчетливее резонанс. Снижение температуры образца позволяет существенно (более чем на три порядка) увеличить чувствительность метода. При этом частота резонанса f$~Txl2y где Т — температура буферного газа, а добротность ~1 /Т.
Приемники акустических сигналов. В качестве приемников акустического сигнала наибольшее распространение получили микрофоны различных конструкций: цилиндрические, плоские, конденсаторные, а также электретные. Неравномерность частотной характеристики и уровень шумов электретных микрофонов несколько выше, чем у конденсаторных, однако электретные микрофоны имеют малые размеры и не требуют источника напряжения поляризации. Чувствительность лучших микрофонов составляет 50— 100 мВ/Па.
Наряду с микрофонами для приема акустических колебаний непосредственно от жидкостей и твердых тел применяются разнообразные пьезоэлектрические преобразователи, чувствительность которых составляет 0,01—1 мВ/Па. На рис. 5.5 схематически показана одна из конструкций таких преобразователей. Она состоит из куска плавленого кварца Т-образной формы диаметром 0,63 см и длиной каждого плеча 2,5 см. На нижнюю часть вертикального отростка нанесено отражающее покрытие, на которое наклеен пьезокерамический цилиндр. Эта часть приемника защищена латунным стаканом, который выполняет также функции электрической экранировки. Кварцевый блок сделан таким, чтобы, являясь хорошим проводником для звуковых волн, мог свести к минимуму влияние рассеянного лазерного излучения на работу пьезопреобразователя. Собственная резонансная частота ОА детектора составляет 250 кГц.
Применяются и другие типы универсальных пьезоэлектрических ОА детекторов, изготовленных в виде болта, ввинчивающегося в боковую стенку закрытой ячейки или соприкасающегося со стандартной кюветой (кварцевым звукопроводом, рис. 5.6е) с помощью струбцины [П. 43], а также изготовленных в виде параллелепипеда, на грани которого напылены электроды (одной из этих граней детектор приклеивается к образцу). Рассмотренные приемники являются резонансными и используются для приема импульсных сигналов длительностью от 1 мкс до 80 не. Применение тонких (9 мкм) поливинилиденфторидных пьезоэлектрических пленок позволяет повысить быстродействие до» 4 не [9].
По сравнению с традиционными микрофонами и пьезопреобразователями лазерные и волоконно-оптические приемники ОА сигналов имеют ряд преимуществ: отсутствие собственных колебаний, возможность снизить шумы электронной аппаратуры за счет перехода на высокие частоты (отсюда и быстродействие), а также возможность работы с агрессивными средами в условиях высоких температур при наличии значительных электрических и магнитных полей [П. 23, П. 41, П. 43].
В качестве «приемника» акустической волны можно, например, использовать пробный лазерный пучок, отклоняющийся за счет изменения показателя преломления (концентрации частиц) в области прохождения акустической волны 1П. 43]. Отклонение лазерного пучка регистрируется с помощью позиционно-чувствительного фотоприемника. Изменяя расстояние между рабочим и пробным лазерными пучками и регулируя длительность импульса возбуждения, можно выделить акустический сигнал и измерить скорость распространения звука в различных средах.
Динамические калориметрические системы. Важным классом диагностических задач в биологии и медицине является анализ перемещающихся газовых и жидкостных потоков, например газовая и жидкостная хроматография, исследование кровотока, счет одиночных биочастиц (биомолекулы, клетки) и пр. В потоках изменяется характер

тепловой диффузии.

где a”=av*d — «потоковый» коэффициент диффузии, а — экспериментально определяемый коэффициент ((3—4)- 10~а),

Рис. 5.7. Примеры динамических калориметрических систем [ 10]
(5.12)'
Время теплозой релаксации вместо
определяется соотношением [10]

v* — сдвиговая скорость, d — диаметр потока. Для типичных условий а?=7,7- 10-3ur (v — скорость потока, г — его радиус).
Некоторые примеры динамических калориметрических систем схематически показаны на рис. 5.7, где 1 — поток, 2 — возбуждающий лазерный пучок. Для динамических измерений в потоках можно использовать традиционные схемы (рис. 5.6а, в). Выбор оптимального соотношения между скоростью потока, частотой модуляции света и расстоянием между зонами возбуждения и регистрации позволяет в схеме рис. 5.7а достичь пороговой чувствительности по поглощению на уровне 10“7 см-1. Дифференциальный пироприемник 3 в данной схеме исключает влияние рассеянного излучения.
Схема рис. 5.75 перспективна для применения в жидкостной капиллярной хроматографии. Здесь 3 — пьезодатчик. Еще одна схема (рис. 5.7в) предназначена для детектирования одиночных частиц, которые, попадая при своем движении в область жесткой фокусировки лазерного пучка, скачком сильно увеличивают амплитуду ОА сигнала (<? — микрофон или пьзодатчик). Схема рис. 5.7г реализует бесконтактный дефлекционный метод. Эта схема имеет высокое пространственное разрешение, высокую чувствительность и возможность одновременного измерения скорости потока, концентрации поглощающих частиц и температуры среды. Она обладает значительным динамическим диапазоном (0,1—100 см/с) и возможностью определения профиля скоростей в сечении потока. Здесь 3 — позиционно-чувствительный фотоприемник, 4 — пробный лазерный пучок.



 
« Кровохарканье и легочное кровотечение   Лапароскопическая аппендэктомия у детей »