Начало >> Статьи >> Архивы >> Лазерная диагностика в биологии и медицине

Физические основы спектроскопии КР - Лазерная диагностика в биологии и медицине

Оглавление
Лазерная диагностика в биологии и медицине
Взаимодействие лазерного излучения с биологическими системами
Лазеры для диагностики биологических объектов
Техника безопасности
Лазерная нефелометрия
Лазерная поляризационная нефелометрия
Индикатор иммунологических реакций
Проточные анализаторы микрочастиц
Лазерная спектроскопия квазиупругого рассеяния
Методы обработки сигнала
Диагностика биологических объектов на основе измерения коэффициентов диффузии
Диагностика на основе регистрации скоростей направленного движения
Лазерная доплеровская спектроскопия живых клеток
Лазерная интерферометрия
Голографические методы диагностики
Абсорбционно-трансмиссионный анализ с использованием перестраиваемых лазеров
Абсорбционная спектроскопия быстропротекающих процессов
Калориметрические методы диагностики
Экспериментальные исследования оптико-акустическим методом
Конструкции спектрофонов и зондов
Области применения калориметрических методов
Физические основы спектроскопии КР
Применение спектроскопии КР в биохимических исследованиях
КР-микроскопия биологических структур
Применение спектроскопии КР в офтальмологии
Лазерный флуоресцентный анализ
Микроскопия и микроспектрофлуориметрия
Примеры применения лазерной флуоресцентной диагностики
Дистанционная флуоресцентная диагностика растений
Заключение

ЛАЗЕРНАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ КОМБИНАЦИОННОГО
РАССЕЯНИЯ
В этой главе рассматриваются методы микродиагностики, основанные на неупругом (комбинационном) рассеянии (КР) света биологическими молекулами. Так как биологические объекты в большинстве случаев исследуются в водных растворах или содержат в себе большое количество воды, то методы спектроскопии КР имеют важные преимущества перед другими методами микродиагностики, применение которых к изучению биомолекул в естественной среде затруднено вследствие поглощения водой.
К настоящему времени накоплен большой экспериментальный материал по спектроскопии КР биологических молекул, в частности белков и нуклеиновых кислот. Некоторые примеры таких исследований представлены в этой главе.
Кроме биомолекул и их комплексов объектами спектроскопии КР все чаще становятся живые клетки и многоклеточные структуры. Большие перспективы здесь открываются в связи с развитием техники микроскопии КР.
Кроме методов спектроскопии спонтанного КР, даны основные сведения о сравнительно новых и наиболее перспективных методах: спектроскопии гигантского КР и активной спектроскопии КР.
Физические основы спектроскопии комбинационного рассеяния и ее разновидностей
Спонтанное комбинационное рассеяние. Одним из результатов взаимодействия света с биологическими объектами является его неупругое рассеяние, вследствие которого изменяется не только направление, но и частота излучения. На рис. 6.1 показаны возможные варианты и следствия взаимодействия кванта света с молекулой. Здесь основное

и первое электронно-возбужденное состояния обозначены через S0 и соответственно. Каждый из этих уровней энергии состоит из множества колебательных подуровней У, 2, 3 и т. д. Переходы между различными уровнями и подуровнями показаны стрелками, причем длины стрелок, направленных вверх, пропорциональны частоте падающего света.

Рис. 6.1. Возможные энергетические переходы в молекуле, неупругого взаимодействующей с квантом света
Длины стрелок, направленных вниз, пропорциональны частоте рассеянного света.
В результате взаимодействия за время порядка периода световых колебаний, т. е. примерно за 10~15 с, молекула переходит в более высокое энергетическое состояние. Далее через интервал времени порядка 10”11 с может произойти высвобождение кванта света, но уже с частотой, которая является комбинацией частоты падающего света и частоты колебательного перехода. При этом если высвобожденный квант имеет частоту, меньшую частоты падающего света, а именно v0 — vK0J1 (стрелка заканчивается на колебательном уровне, расположенном выше исходного), то наблюдается так называемый стоксов компонент комбинационного рассеяния света. Если же происходит энергетический переход в состояние ниже исходного уровня, т. е. энергия высвобожденного кванта больше энергии падающего (v0+vKOJI), то такой компонент КР называется антистоксовым. В обоих случаях разность частот падающего и рассеянного света V0—(v0±vKOJI) равна частоте молекулярного колебания.
Вероятность спонтанного КР существенно меньше вероятности рэлеевского (упругого) рассеяния, поэтому интенсивность сигнала весьма низкая. При этом в нормальных условиях интенсивность антистоксова компонента рассеянного света значительно меньше интенсивности стоксова компонента. Интенсивность сигнала зависит от частоты падающего света: вдали от области электронного поглощения она пропорциональна vj, при приближении к полосе поглощения наблюдается более быстрый рост интенсивности КР. При попадании частоты v0 в область полосы поглощения исследуемого вещества наблюдается так называемое резонансное комбинационное рассеяние (РКР).
Интенсивность линий РКР может на несколько порядков превышать интенсивность обычного КР. Благодаря этому, используя РКР, можно селективно регистрировать свет, рассеянный отдельными соединениями в многокомпонентных биологических системах. Интенсивность обычного КР от остальных компонентов системы при этом настолько мала, что практически не отличается от фона.

Так как любая биомолекула состоит из большого числа атомов и атомных групп, то интенсивный падающий свет,
Рис. 6.2. КР-спектр жидкой воды, получаемый при возбуждении Аг лазером (λ,= =488 нм, Л-1=20 492 см”1). По оси абсцисс отложены абсолютные и относительные единицы (волновые числа)
взаимодействуя одновременно со многими атомами, дает целый спектр линий КР. При этом положение линий в спектре определяется только частотами колебаний основных электронных состояний (значениями vK0JI j). Поэтому спектроскопия КР — это вариант колебательной спектроскопии. Аналогично ИК спектроскопии смысл применения спектроскопии КР при исследовании биологических объектов состоит в том, чтобы связать КР-спектры с химическими свойствами составляющих эти объекты биомолекул и их ближайшего окружения, хорошо характеризуемыми колебательными спектрами.
На рис. 6.2 изображен в качестве простейшего примера КР-спектр жидкой воды — естественного физиологического растворителя биологических соединений. Спектр получен путем возбуждения воды излучением Аг лазера (А,=488 нм). По горизонтальной оси отложены длины волн в нанометрах, соответствующие им волновые числа, а также сдвиги относительно волнового числа возбуждающего излучения (А,-1= =20 492 см-1). Наиболее интенсивная линия в спектре <3415 см-1) появляется в результате обмена энергии падающего света с энергией валентных колебательных движений, соответствующих растяжению связи О—Н. Колебания,, происходящие при деформации угла Н—О—Н в молекуле воды, проявляются в КР-спектре существенно слабее (линия 1619 см-1).
Важной особенностью КР-спектра воды является то, что за исключением линии валентного колебания интенсивность этого спектра мала. Это позволяет на его фоне получать четкие линии КР-спектров растворенных в воде веществ. Этим спектроскопия КР принципиально отличается от ИК спектроскопии, так как вода очень сильно поглощает ИК излучение.
Сравнение интенсивности линий в КР-спектрах, полученных от большого числа различных молекул, позволило сформулировать некоторые обобщенные правила [1, П. 8]. Так, например, валентные колебания проявляются в КР-спектрах сильнее деформационных колебаний (мы уже видели это на примере воды); линии колебаний кратных связей должны быть более интенсивными, чем линии колебаний простых связей; линии, обусловленные синфазными колебаниями валентных связей, более интенсивны, чем линии, обусловленные противофазными колебаниями этих связей.
Как правило, в КР-спектры многоатомных молекул преобладающий вклад вносят колебания некоторых групп атомов. Это такие часто встречающиеся в органических молекулах группы, как С—Н, О—Н, N—Н, S—Н, С=С, С=0 и др. Точное положение в спектрах линий, соответствующих этим групповым колебаниям, зависит от типа связи с другими атомами. Так, в спектрах молекул, имеющих группу =С—Н, имеется линия 3300 см-1, группесоответствует линия 2960 см-1, а группелиния 3020 см-1.
Примером более сложной группы атомов, выступающей в качестве независимого осциллятора в молекулах всех полипептидов и белков, является так называемая амидная группа

образующаяся при связывании аминокислот друг с другом, различные типы колебаний этой группы проявляются в КР-спектрах в виде так называемых полос амид-1, амид-2, амид-8. Наиболее сильные полосы амид-1 и амид-3 расположены вблизи волновых чисел 1660 см-1 и 1250 см-1 соответственно. Полоса амид-2 в КР-спектрах белков проявляется слабо. Точное положение максимумов полос и форма их контуров определяются вторичной структурой белка.
Аналогично, колебания фосфатных групп

основной цепи молекул ДНК и РНК обусловливают появление в КР-спектрах этих макромолекул двух сильных характерных линий вблизи 800 и 1100 см-1. Интенсивность и положение первой из них зависит от конформации и упорядоченности вторичной структуры.
Характерные линии имеются в КР-спектрах и других биологических макромолекул. Кроме этих характерных линий КР-спектры биологических макромолекул и систем содержат большое число других линий, приписка которых определенным внутримолекулярным колебаниям составляет одну из задач спектроскопии КР биологических объектов.

Рис. 6.3. Блок-схема установки для регистрации КР-спектров в обычном эксперименте: 1 — лазер, 2 — фокусирующая линза, 3 — кювета с исследуемым образцом, 4 — конденсор, 5 — входная щель, 6 — монохроматор, 7 — фотоумножитель или многоканальный анализатор

Общие сведения о технике эксперимента. На рис. 6.3 представлены основные оптические элементы, необходимые для регистрации спонтанных КР-спектров в обычном эксперименте. Использование лазера в качестве источника интенсивного монохроматического излучения в экспериментах по возбуждению и регистрации КР было необходимым условием быстрого развития этого метода и широкого внедрения его в химию и биологию.

Лазеры сняли большинство казавшихся ранее непреодолимыми трудностей и ограничений, связанных с исследуемыми объектами и, как уже говорилось выше, их водными растворами. Чаще всего используются непрерывные Аг и Кг лазеры с дискретной перестройкой длины волны, а также лазеры на красителях и параметрические генераторы света с плавной перестройкой длины волны. Импульсные лазеры позволяют получать' высокую импульсную мощность зондирующего излучения при сравнительно низкой средней мощности и, что особенно важно, высокое временное разрешение регистрируемых спектров.
Регистрация КР-спектра осуществляется либо с помощью фотоумножителя, соединенного со сканирующим монохроматором (как правило, двойным для надежной отстройки от упруго рассеянного света), либо с помощью оптического многоканального анализатора. Этот анализатор представляет собой линейку из нескольких сотен миниатюрных фотоприемников или высокочувствительную телекамеру. В сканирующем спектрометре линии спектра регистрируются последовательно, причем весь спектр в диапазоне от десятков до тысяч обратных сантиметров с разрешением до нескольких обратных сантиметров получают за время порядка нескольких секунд.
Использование оптического многоканального анализатора позволяет регистрировать все линии спектра одновременно, на что требуется существенно меньше времени вплоть- до нано- и пикосекунд.
Одним из препятствий при регистрации КР-спектров выступает фоновая люминесценция образцов — более вероятный процесс, чем КР (см. гл. 7). Источниками люминесценции являются примеси или эндогенные хромофоры. Уменьшения нежелательного люминесцентного фона, перекрывающего иногда слабые линии КР, добиваются тщательной очисткой образца, подбором оптимальной длины волны возбуждающего излучения или добавлением в раствор исследуемого вещества специальных тушителей. В некоторых случаях возможно выжигание люминесцирующих примесей путем длительного облучения образца интенсивным лазерным излучением. Последний способ, правда, может привести к фотохимической модификации и даже разрушению образца.
Более перспективным путем отделения КР-спектров от люминесценции является использование для возбуждения КР лазерных импульсов пикосекундной длительности. Так как времена жизни даже быстрой люминесценции (флуоресценции) лежат в наносекундном диапазоне (см. гл. 7) в отличие от пикосекундного диапазона у КР, то, используя быстродействующую систему регистрации, отключающуюся после приема КР-излучения до прихода квантов люминесценции, можно устранить фоновые линии из спектра.
Активная спектроскопия комбинационного рассеяния (АСКР). Принципиально иным методом регистрации КР- спектров от объектов с высоким уровнем флуоресценции является АСКР [2]. Для реализации этого метода используют два перестраиваемых лазера с частотой излучения Vj и v2. Пересекаясь в образце, пучки излучения этих лазеров наводят в нем дипольный момент, характеризуемый нелинейной восприимчивостью третьего порядка. В результате происходит когерентное антистоксово рассеяние с частотой va=2vx—v2. Направление распространения сигнала определяется выполнением условия фазового синхронизма для волновых векторов взаимодействующих волн и отличается от направления распространения излучений накачки. Интенсивность этого рассеянного излучения существенно возрастает, если разностная частота vx—v2 совпадает с частотой исследуемого внутримолекулярного колебания. Варьируя vx—vs путем перестройки частоты лазеров, можно прописывать КР-спектры в широком диапазоне и при этом эффективно отстраиваться от флуоресценции в более коротковолновую антистоксову область.
Другим достоинством АСКР является возможность разрешать близко расположенные и перекрывающиеся спектральные линии, связанная с тем, что спектральное разрешение спектрометра АСКР определяется не монохроматором, а шириной линий используемых лазеров [2].
Получению качественных спектров АСКР препятствует наличие нерезонансного нелинейно-оптического сигнала, обусловленного вкладом молекул растворителя. Подавление его осуществляют с помощью поляризационных элементов, используя различия поляризационных характеристик резонансного и нерезонансного вкладов [3, 4].
Гигантское комбинационное рассеяние (ГКР). В последние годы в молекулярной биологии и биохимии начали использовать другую разновидность колебательной спектроскопии, основанную на явлениях ГКР света [5—7]. Суть этого явления состоит в огромном (до 105—10е раз) увеличении сечения КР молекулами, адсорбированными на поверхности металла. Вследствие этого ГКР-спектры удается регистрировать при концентрациях, на несколько порядков меньших, чем в обычной спектроскопии КР.
В основе явления ГКР лежат два механизма: электромагнитный, связанный с увеличением локального электромагнитного поля вблизи поверхности, и молекулярный, связанный с образованием возбужденных состояний комплексов молекул с металлом [8]. Интенсивное ГКР наблюдается чаще всего на специально приготовленных металлических поверхностях с сильной шероховатостью. ГКР-спектры биологических молекул, как правило, получают в электрохимических ячейках, в гидрозолях металлов и на металлических пленках с регулярными неоднородностями. Для регистрации спектров используется та же аппаратура, что и для получения обычных КР-спектров. Для возбуждения применяют лазерное излучение видимого диапазона, мощность которого обычно не превышает нескольких десятков милливатт.



 
« Кровохарканье и легочное кровотечение   Лапароскопическая аппендэктомия у детей »