Начало >> Статьи >> Архивы >> Лазерная диагностика в биологии и медицине

Примеры применения лазерной флуоресцентной диагностики - Лазерная диагностика в биологии и медицине

Оглавление
Лазерная диагностика в биологии и медицине
Взаимодействие лазерного излучения с биологическими системами
Лазеры для диагностики биологических объектов
Техника безопасности
Лазерная нефелометрия
Лазерная поляризационная нефелометрия
Индикатор иммунологических реакций
Проточные анализаторы микрочастиц
Лазерная спектроскопия квазиупругого рассеяния
Методы обработки сигнала
Диагностика биологических объектов на основе измерения коэффициентов диффузии
Диагностика на основе регистрации скоростей направленного движения
Лазерная доплеровская спектроскопия живых клеток
Лазерная интерферометрия
Голографические методы диагностики
Абсорбционно-трансмиссионный анализ с использованием перестраиваемых лазеров
Абсорбционная спектроскопия быстропротекающих процессов
Калориметрические методы диагностики
Экспериментальные исследования оптико-акустическим методом
Конструкции спектрофонов и зондов
Области применения калориметрических методов
Физические основы спектроскопии КР
Применение спектроскопии КР в биохимических исследованиях
КР-микроскопия биологических структур
Применение спектроскопии КР в офтальмологии
Лазерный флуоресцентный анализ
Микроскопия и микроспектрофлуориметрия
Примеры применения лазерной флуоресцентной диагностики
Дистанционная флуоресцентная диагностика растений
Заключение

Примеры применения лазерной
флуоресцентной диагностики в медицине
Диагностика рака. Накопленный к настоящему времени опыт лечения онкологических заболеваний дает основание считать, что ранняя диагностика рака с последующим хирургическим или терапевтическим (возможно, лазерным) лечением могут существенно повысить вероятность выздоровления. В связи с этим в разных научных центрах, в том числе и в нашей стране, ведется поиск новых, более эффективных методов диагностики. Еще до применения лазеров было установлено, что спектры флуоресценции в видимом диапазоне, получаемые от нормальных и опухолевых тканей, отличаются. Применение лазерных флуоресцентных спектрометров с высокой спектральной плотностью мощности возбуждения позволило повысить скорость и качества получения спектров и поднять общий уровень исследований в этом направлении.
На рис. 7.3 показаны спектры флуоресценции, полученные от здоровых и опухолевых почки и предстательной железы крысы [12, 13]. Видно, что основные максимумы спектров от опухолевых тканей (А.=521—522 нм) существенно сдвинуты в синюю область по сравнению со здоровыми (А,= =531—533 нм). Да и сама форма спектров достоверно отличается. Подобные отличия спектров флуоресценции, по- видимому, должны наблюдаться и при исследовании тканей и органов человека. Эти отличия объясняются либо изменениями среды, окружающей флуорофоры, либо производством новых флуорофоров, индуцированным биохимическими изменениями в клетках или в окружающей их среде. В области длин волн А,=520—530 нм флуоресцируют флавины, причем максимумы спектров флуоресценции могут несколько смещаться в зависимости от условий среды. Следовательно, если не говорить о производстве новых флуорофоров, то можно предположить, что в данном случае флуоресцируют флавины. Общие пики в спектрах в области λ=590—640 нм можно приписать порфиринам, содержащимся в цитохроме митохондрий. Их флуоресценция многократно усиливается при удалении ионов Fe и Си.

Рис. 7.3. Спектры флуоресценции от почки (а) и предстательной железы (б) крысы: 1 — здоровый орган, 2 — опухолевый


Рис. 7.4. Схема лазерного флуориметра: 1 — Аг лазер, 2 — прерыватель, 3 — объект, 4 — фокусирующая система, 5 — монохроматор, 6 — ФЭУ, 7 — усилитель, 8 — самописец [121

Схема установки, на которой были получены приведенные выше спектры, изображена на рис. 7.4. Непрерывное излучение Аг лазера (^=488 нм), промодулированное с помощью прерывателя с частотой 200 Гц, фокусировалось на поверхность исследуемой ткани. Флуоресцентный сигнал с помощью системы линз направлялся на входную щель двойного монохроматора, который осуществлял развертку спектра с разрешением ДЛ,= 1,8 нм в диапазоне λ=500— 800 нм, так что рассеянный свет не попадал на фотоумножитель. Сигнал ФЭУ синхронно с прерывателем усиливался и регистрировался на самописце. Мощность зондирующего лазерного излучения составляла 100 мВт, диаметр пятна в области измерения — 100 мкм. Спектры снимались по нескольку раз, и при этом наблюдалась их полная воспроизводимость.
Заметим в качестве отступления, что такая же установка может, быть использована для диагностики кариеса зубов. Показано, что существуют достоверные различия в спектрах флуоресценции и упругого рассеяния в видимой области от пораженных кариесом и здоровых участков зуба. Более подробную информацию заинтересованный читатель найдет в [14].
Другой перспективный метод лазерной флуоресцентной диагностики рака основан на способности злокачественных клеток и тканей накапливать повышенную по сравнению с обычными клетками и тканями концентрацию флуоресцирующих красителей [15, П. 36]. Проведение оптического обследования тканей в спектральном диапазоне флуоресценции красителя дает возможность оперативно выявлять места его повышенной концентрации и, следовательно, локализации опухоли.
Использование лазеров в этой методике является принципиальным не только с точки зрения необходимости высокой спектральной плотности мощности излучения, но также с точки зрения необходимости использования световолоконных трактов для подведения возбуждающего излучения к внутренним органам и отведения оттуда флуоресценции.
Выбор оптимального красителя для флуоресцентной диагностики опухолей проводится в соответствии с рядом требований. Красителю должны быть свойственны: высокая селективность накопления в злокачественных клетках и тканях (по сравнению с нормальными), высокий квантовый выход флуоресценции, быстрое выведение из организма, отсутствие побочных эффектов на ткани и организм в целом. Не должен быть высоким квантовый выход фотоиндуцированной генерации синглетного кислорода или каких-либо других циготоксических агентов в отличие от противоположного требования к красителям, используемым для фото динамической терапии опухолей.
В настоящее время в лабораториях, разрабатывающих методику лазерной флуоресцентной диагностики рака, чаще всего используются в качестве красителей гематопорфирин (ГП), производные гематопорфирина (ПГП) [П. 36, 16, 171 и флюренат (динатриевая соль флюоресцеина) [15, 18]. В то время как первые два красителя используются также и для фотодинамической терапии, флюренат оказывается более подходящим именно для диагностики. Так, он обеспечивает контрастность наблюдения опухоли в свете флуоресценции на фоне нормальных тканей не менее 50 : 1 по сравнению с 5 : 1 у ПГП.
Для возбуждения флуоресценции флюрената больше всего подходит излучение Не—-Cd лазера (Л,=441,6 нм), попадающее в полосу его поглощения. При наличии у больного, в кровь которого введен флюренат, злокачественной опухоли, например желудочно-кишечного тракта, эта опухоль светится салатовым светом на темно-синем фоне непораженной слизистой. Это свечение с достоверностью 98 % соответствует месту нахождения опухоли. Некротическая ткань дает несветящиеся участки. Такие участки часто наблюдаются на крупных опухолях, которые в целом светятся слабее.
В ряде случаев площадь свечения при лазерном возбуждении значительно превышает область опухоли, видимую при обычном освещении. Это означает высокую инфильтрацию злокачественной ткани в стенку органа. Такое наблюдение позволяет правильно спланировать операцию.
Метастазы светятся так же, как и опухоли. Применение флуоресцентной диагностики существенно увеличивает процент их выявления. В некоторых случаях только благодаря флуоресценции обнаруживается внутриорганное метастазирование в виде просовидных высыпаний вдали от опухоли.
Интересно отметить имевшиеся в практике случаи [15], когда у больных с диагнозами рака, например, толстой кишки, поставленными пальпаторно и рентгенологически, не наблюдалось флуоресцентного свечения. Даже во время операции диагноз рака не вызывал сомнения. Однако последующее гистологическое исследование этот диагноз не подтвердило: за опухоль были приняты воспалительные инфильтраты. Эго показывает высокую надежность лазерной флуоресцентной диагностики.
В настоящее время продолжаются работы по клиническому испытанию этого метода и по исследованию механизмов избирательного накопления красителей в раковых клетках [17, 19], а также по изучению механизмов фотодинамического повреждения биомолекул, клеток и биоструктур тканей [20, 211. Важным этапом этих работ является изучение стационарных и разрешенных во времени спектров флуоресценции красителей в растворах и в живых клетках, которое проводится с помощью лазерных пикосекундных спектрометров и микроспектрофлуориметров.
В работах [22, 23] регистрировались флуоресцентные спектры ГП, диацетата ГП (ДГП) и дигематопорфиринэфира (фотофрина 2) в водных растворах (рН=4,0—11,0), в фосфатном буферном растворе (рИ=7,4) и в растворе диметилформамида в модельных системах: искусственных липидных пузырьках — липосомах и тенях эритроцитов, а также в культивируемых клетках почки свиньи и фибробластов человека.
Схема установки, на которой были получены эти спектры, изображена на рис. 7.5.

Рис. 7.5. Схема пикосекундного флуоресцентного микроскопа: 1 — фокусирующий объектив, 2 — объект, 3 — монохроматор, 4 — ФЭУ, 5 — счетчик фотонов, 6 — микро-ЭВМ [22]
Флуоресценция возбуждалась одиночными импульсами либо второй гармоники АИГ : Nd лазера, либо импульсами лазера на красителе длительностью 70±10 пс. Короткофокусный объектив фокусировал возбуждающий лазерный луч на объект и собирал флуоресценцию. Диаметр пучка в области зондирования был меньше 1 мкм. Флуоресцентное излучение направлялось сквозь

прозрачное в диапазоне 600—700 нм дихроичное зеркало на монохроматор и далее на ФЭУ, работающий в режиме счета фогонов. Вся система функционировала под управлением микро-ЭВМ.
В клетках главный максимум флуоресцентного спектра приходится на 635 нм. Стационарные спектры имеют максимумы на 612 нм для водных растворов и на 625 нм — для

Рис. 7.6. Распределение интенсивности флуоресценции по раковой клетке человека, сенсибилизированной ПГП [25]
органического растворителя. Это говорит о том, что характер флуоресценции молекул красителя существенно зависит от их непосредственного окружения (молекул воды, растворителя, липидов и др.).
Кинетические измерения показали, что характер затухания флуоресценции зависит от того, находятся молекулы красителя в форме мономеров или имеет место их агрегация и комплексообразование с другими, например внутриклеточными, структурами. Так, кинетика затухания флуоресценции от раствора мономеров ГП в воде в области максимума с хорошей точностью моделируется одной экспонентой с временем т=15—16 не. Появление в растворе агрегатов (олигомеров) красителя влечет за собой появление еще одной «быстрой» экспоненты с т=0,5 не. Быстрая кинетика появляется также в полосе главного максимума спектров флуоресценции молекул красителя в клетках, что указывает на то, что эти молекулы образуют комплексы с внутриклеточными структурами, скорее всего с мембранами.
При повышении дозы светового воздействия в растворах красителей возникают устойчивые фотопродукты, дающие в кинетических и стационарных спектрах флуоресценции боковые полосы с пикосекундным затуханием (для ГП ?.тах=644 нм, т=100 пс) [24]. На рис. 7.6 приведен пример измерения распределения интенсивности флуоресценции по раковой клетке человека после 1-часового содержания ее в растворе ПГП [25]. Концентрация красителя составляла 50 мкг/см3, плотность мощности излучения аргонового лазера на поверхности клетки — около 0,4 мВт/см2. Отношение сигнал/шум составляло несколько десятков в области максимальной флуоресценции. Измерения проводились на лазерном флуоресцентном микроскопе, оборудованном высокочувствительной системой регистрации, цифровой обработки и представления изображений.
Видно, что интенсивность флуоресценции меньше в центральной части, чем в периферийных областях. Этот результат означает, что ПГП накапливается главным образом в области внешней мембраны культивируемых раковых клеток, что соответствует результатам других авторов [26]. Учитывая этот факт, а также представления о комплексообразовании молекул красителей с мембранами, можно предположить, что разрушение раковых клеток при фото- динамической терапии опухолей развивается в основном в мембранах клеток.
На приведенном рисунке размеры минимального элемента изображения соответствуют области в 0,25 мкм на исследуемом объекте, что находится на грани пространственного разрешения оптической системы. Время получения флуоресцентного изображения составляет 1 с в отличие от нескольких десятков секунд, необходимых при использовании обычной техники, дающей к тому же недостаточное пространственное разрешение.
Увеличивающееся с каждым годом число работ в области развития и испытания методик лазерной флуоресцентной диагностики злокачественных образований позволяет надеяться на то, что в недалеком будущем эти методики вместе с лазерной фотодинамической терапией рака займут прочное место в клиниках.
Диагностика ишемии сердечной мышцы. Многие флуориметрические исследования живых клеток основаны на регистрации отношения концентраций восстановленной и окисленной форм пиридин-нуклеотидов [НАДН]/[НАД+], являющихся коферментами многих внутриклеточных реакций. Это отношение несет важную информацию о состоянии клеток и состоящих из них тканей и органов. Возможность ее флуоресцентной регистрации определяется свойствами НАДН поглощать свет на длине волны Хх=340 нм и высвечивать флуоресценцию с максимумом на длине волны Я2= =480 нм. НАД+ на длине волны    не поглощает, а его флуоресценция в области Я2 существенно слабее.
Одним из интересных примеров применения этого подхода является регистрация ишемии сердечной мышцы в нормальных физиологических условиях [13]. Характерной особенностью работы с перфузируемыми кровью органами

Рис. 7.7. Схема лазерного волоконного флуориметра [13]
является сильное возмущение, вносимое в сигнал флуоресценции тканевой циркуляцией крови. Компенсировать это возмущение оказалось возможным путем одновременной регистрации интенсивности флуоресценции на длине волны λ, и интенсивности отраженного тканью излучения в максимуме  полосы поглощения гемоглобина (Я3=805 нм).
4На рис. 7.7 изображена схема лазерного волоконного флуориметра, созданного для подобных измерений. Устройство включает в себя два лазера: азотный (/) и на красителе (2), как источники УФ и ИК излучения, два фотодиода (3), регистрирующих отношение выходных мощностей лазеров, два ФЭУ (4), измеряющих интенсивность флуоресценции, индуцированной УФ излучением, и интенсивность отраженного ИК излучения. Эта схема, естественно, снабжена электронным блоком и микро-ЭВМ. Параметры азотного лазера: частота повторения импульсов 140 Гц, энергия в импульсе 150 мкДж, пиковая мощность 30 кВт, средняя мощность при частоте повторения импульсов 100 Гц —

мВт. Длительность импульса лазера на красителе при той же частоте повторения — 6 не.
В качестве иллюстрации результата применения описанного прибора для регистрации ишемии сердечной мышцы на рис. 7.8 приведена временная зависимость интенсивности отраженного света (/) и флуоресценции (2) во время приступа ишемии (остановки перфузии) изолированной перфузируемой модели сердца крысы. Уменьшение отражения

Рис. 7.8. Кинетика изменения отражения (1) и флуоресценции (2) во время приступа ишемии, вызванной остановкой перфузии сердца крысы_(момент tx) и возобновленной через 50 с (момент t2)  
происходит за счет уменьшения концентрации внутритканевых красных кровяных телец, в то время как увеличение интенсивности флуоресценции происходит за счет увеличения внутриклеточного отношения [НАДН]/[НАД+].
Лазерный волоконный флуориметр может с успехом применяться при операциях на сердце для изучения метаболизма сердечной мышцы через световодный катетер. Более того, очевидно, что любой орган, доступный для фиброскопа или катетера, может быть объектом изучения с помощью такого флуориметра. Заметим, что нелазерный флуориметр, построенный ранее на базе ртутной лампы, монохроматора, фильтров и УФ микроскопа, не позволял получать достоверные результаты главным образом из-за недостатка чувствительности.
Диагностика атеросклероза. Еще одним перспективным применением флуоресцентной диагностики в медицине становится диагностика атеросклеротических бляшек и, в частности, фиброзных бляшек, являющихся первой стадией атеросклеротического поражения сосудов.
Как показано в работе [26], наличие в сосуде атеросклеротической бляшки может быть определено путем сравнения интенсивности флуоресценции на длинах волн 580 и 600 нм при возбуждении на длине волны 480 нм. На рис. 7.9

Рис. 7.9. Спектры флуоресценции от нормальной (/) и пораженной атеросклерозом (2) артерий [26]
представлены характерные спектры флуоресценции, полученные от нормальной и пораженной атеросклерозом артерий. Видно, что они сильно отличаются.
Используя тот факт, что высота пика на 600 нм относительно минимума, приходящегося на 580 нм, намного больше в случае здоровых артерий по сравнению с пораженными, можно составить отношение контраста /(600)//(580). Значение этого отношения, полученное в экспериментах, подтвержденных соответствующим гистологическим анализом, равно примерно 2 для нормальных артерий и примерно 1 для атеросклеротических.
Многочисленные эксперименты показывают, что можно достоверно различать нормальную артерию и артерию, имеющую бляшку толщиной 0,5 мм и более. И хотя к настоящему времени результаты получены только на трупных артериях, можно рассчитывать, что прямая лазерная диагностика атеросклероза in vivo через световодный катетер скоро станет возможной. При этом в случае положительного диагноза можно будет по тому же катетеру передавать большие дозы лазерного излучения в область поражения сосуда атеросклерозом с целью разрушения бляшек.



 
« Кровохарканье и легочное кровотечение   Лапароскопическая аппендэктомия у детей »