Начало >> Статьи >> Архивы >> Лазерная диагностика в биологии и медицине

Лазерная поляризационная нефелометрия - Лазерная диагностика в биологии и медицине

Оглавление
Лазерная диагностика в биологии и медицине
Взаимодействие лазерного излучения с биологическими системами
Лазеры для диагностики биологических объектов
Техника безопасности
Лазерная нефелометрия
Лазерная поляризационная нефелометрия
Индикатор иммунологических реакций
Проточные анализаторы микрочастиц
Лазерная спектроскопия квазиупругого рассеяния
Методы обработки сигнала
Диагностика биологических объектов на основе измерения коэффициентов диффузии
Диагностика на основе регистрации скоростей направленного движения
Лазерная доплеровская спектроскопия живых клеток
Лазерная интерферометрия
Голографические методы диагностики
Абсорбционно-трансмиссионный анализ с использованием перестраиваемых лазеров
Абсорбционная спектроскопия быстропротекающих процессов
Калориметрические методы диагностики
Экспериментальные исследования оптико-акустическим методом
Конструкции спектрофонов и зондов
Области применения калориметрических методов
Физические основы спектроскопии КР
Применение спектроскопии КР в биохимических исследованиях
КР-микроскопия биологических структур
Применение спектроскопии КР в офтальмологии
Лазерный флуоресцентный анализ
Микроскопия и микроспектрофлуориметрия
Примеры применения лазерной флуоресцентной диагностики
Дистанционная флуоресцентная диагностика растений
Заключение

Лазерная поляризационная нефелометрия
Общие сведения. Распространение света в рассеивающей и поглощающей среде сопровождается как ослаблением мощности зондирующего пучка, так и появлением рассеянного света. Количественно эти явления характеризуются с помощью коэффициента поглощения а, сечения рассеяния о и индикатрисы рассеяния I (0). Однако эта система является неполной. В ней не учитываются изменения состояния поляризации при рассеянии.
Наиболее полное упругое рассеяние света отдельными частицами или ансамблями частиц описывается с помощью матрицы рассеяния света (МРС) — матрицы Мюллера, каждый из 16 элементов которой является функцией длины волны, размера, формы и состава частиц [17]. Хотя полная МРС содержит в себе значительную информацию, свойства всех ее элементов еще не исследованы в достаточной степени. Остановимся на поляризационных характеристиках рассеянного излучения и возможностях их использования для диагностических целей.
Как известно, биологические объекты имеют весьма сложное строение, и поэтому для описания их свойств необходимо проводить измерения многих параметров, и в то же время измерения должны производиться достаточно быстро, до наступления необратимых изменений в объектах in vitro * ), или за время наступления сенсорно-моторной реакции на объектах in vivo. В связи с этим в основу устройств для исследования угловых и поляризационных характеристик могут быть положены быстродействующие методы и средства, используемые в современной эллипсометрии [18]. Однако в связи с ограниченностью априорных знаний об исследуемых биологических объектах автоматические нуль- эллипсометры с ячейками Фарадея [19], имеющие большую точность, высокое быстродействие и значительные перспективы в эллипсометрии поверхности твердых тел, не могут быть широко использованы в биологии и медицине. В биологических исследованиях универсальность метода важна, даже если это дается ценой некоторых уступок в точности и быстродействии, т. е. необходимы измерения полной МРС.

*В пробирке (лат.).

Измерения полной МРС сопряжены с определенными трудностями. Вероятно, простейшим способом измерения всех элементов МРС является использование оптических элементов, помещаемых перед и за рассеивающей средой [2и]. В качестве оптических элементов используются линейные поляризаторы и фазовые пластинки — компенсаторы, оптические оси которых можно выставлять определенным образом относительно горизонтальной плоскости. Измеряя интенсивности света при определенных наборе и положениях оптических элементов нефелометра, можно определить все 16 элементов МРС с помощью соответствующих вычислений [17]. Основным недостатком метода измерения МРС является возможность возникновения больших относительных погрешностей при измерениях малых интенсивностей, получаемых в виде разностей больших сигналов.
Поляризационный нефелометр. К настоящему времени разработано несколько типов поляризационных нефелометров для измерения МРС, в том числе и основанных на модуляции поляризации, в которых основным элементом является поляризационно-оптический модулятор [17]. Рассмотрим один из вариантов поляризационного нефелометра, хорошо себя зарекомендовавшего при исследовании биологических тканей [21]. Главным его принципом является модуляция светового пучка посредством вращения поляризационных элементов вокруг оси луча с последующим фотоэлектронным детектированием сигнала, аналого-цифровым преобразованием значений фототока и расчетом по полученным данным оптических характеристик объекта с помощью сопряженной с нефелометром микро-ЭВМ. В установке была реализована схема с вращающимися компенсаторами, которая имеет сравнительно простой алгоритм обработки и невысокие требования к электронному обеспечению [18].
Оптическая схема установки для измерения всех 16 элементов МРС представлена на рис. 2.1. Установка содержит фиксированные поляризатор Р и анализатор А и две вращающиеся фазовые пластинки F и F', расположенные перед и за исследуемым объектом. Поляризатор и анализатор ориентированы параллельно друг другу, и их плоскости пропускания перпендикулярны плоскости рассеяния; быстрые оси фазовых пластинок F и F' составляют с плоскостью рассеяния углы <р и ср', а вносимые ими разности фаз равны
б    и б' соответственно. Тогда если 50{/0, Qo, U0, У0} — вектор-параметр Стокса на входе системы, a S{I, Q, U, V} — вектор-параметр Стокса на ее выходе, то матричное уравнение, связывающее между собой эти векторы, имеет вид
S = AxF'xMxFxPxS,  (2.4)
где A, F', М, F, Р — матрицы Мюллера анализатора, фазовой пластинки, расположенной за объектом, самого объекта, фазовой пластинки, расположенной перед объектом, и поляризатора соответственно, явный вид которых можно найти, например, в [22]. Соотношение скоростей вращения фазовых пластинок F и F' было выбрано равным 1 : 5, т. е. ф'=5ф, так как в этом случае однозначно определяются все 16 элементов МРС [23].
-
Блок-схема поляризационного нефелометра
Рис. 2.1. Блок-схема поляризационного нефелометра
Перемножая матрицы Мюллера в уравнении (2.4) и проводя соответствующие тригонометрические преобразования, можно показать, что интенсивность I на выходе системы можно представить в виде ряда Фурье:
(2.5)

Коэффициенты ряда могут быть рассчитаны по формулам дискретного преобразования Фурье:

(2.6)

если известны I (<рг) — значения интенсивности излучения, регистрируемые фотодетектором при ориентации быстрой оси фазовой пластинки под углом <рг к плоскости рассеяния.
Значения коэффициентов Фурье а2к и b2ь. определяются параметрами исследуемого объекта и используемых поляризационных устройств. Их явные выражения имеют наиболее простой вид, если б=б'=я/2, однако на практике точное изготовление таких пластинок представляет собой довольно сложную задачу и отклонение реально полученных значений б от л/2 нельзя считать пренебрежимо малым. Поэтому обычно используются общие выражения для коэффициентов a2k и b2й, полученные при произвольных б и б'. Нетрудно показать, что в этом случае элементы МРС исследуемого объекта выражаются через коэффициенты Фурье ath и явный вид которых приведен в [21].
Таким образом, для определения всех 16 элементов МРС необходимо провести измерения интенсивности 1 света на выходе системы при различных угловых положениях фазовых пластинок F и F', причем, как указано выше, скорость вращения фазовой пластинки F в пять раз больше скорости вращения пластинки F. Определив затем коэффициенты а2к и bik по формулам (2.6), где N для эффективной реализации быстрых преобразований Фурье выбрано равным 256, можно определить элементы МРС MiS.
В качестве источника света в поляризационном нефелометре [21] используется Не—Ne лазер 1 типа ЛГН-207А (λ=632,8 нм) (рис. 2.1). На плечах гониометра ГС-5 вместо коллиматора и зрительной трубы смонтированы оптические угломерные головки с точностью визуального отсчета углов поворота Г, по которым можно контролировать углы повороты поляризатора 2, анализатора 3 и компенсаторов 4 и 5. Вращение угломерных головок поляризационных элементов осуществляется с помощью шаговых двигателей 11 и 12 соответственно. Управляющие импульсы подаются на шаговые двигатели через усилители мощности 14 и 15 посредством устройства сопряжения 10 по команде с микро-ЭВМ 6. Поворот узла анализатора с дискретностью 4' осуществляется шаговым двигателем 13 и усилителем мощности 16 по команде с микро-ЭВМ.
Наибольшая точность и чувствительность при измерении слабых световых потоков может быть достигнута применением метода счета фотонов. Поэтому в качестве фотоприемника 7 используется ФЭУ-79, имеющий удовлетворительный участок счетной характеристики и малое количество темновых импульсов. Сигнал с ФЭУ поступает на амплитудный дискриминатор 8 — пороговое устройство с усилителем. Дискриминатор частично отсекает шумовые импульсы с ФЭУ, а также усиливает и стандартизирует сигнальные импульсы. Сигнал постоянной амплитуды с дискриминатора, частота которого пропорциональна интенсивности падающего на ФЭУ света, регистрируется частотомером 9. Взаимодействие всех элементов схемы и микро-ЭВМ обеспечивается устройством сопряжения 10.
Микро-ЭВМ выдает серию импульсов, которые через устройство сопряжения поступают нг шаговые двигатели,
I при повороте фазовых пластинок на заданный угол изменяемый сигнал с ФЭУ регистрируется частотомером. Значения интенсивности света, регистрируемые частотомером при заданных угловых положениях фазовых пластинок, подвергается затем фурье-анализу для определении поляризационных характеристик рассеянного излучения.

Рис. 2.2. Индикатрисы элементов МРС нормального (а) и мутного ф) хрусталиков глаза человека

Методы калибровки установки достаточно подробно описаны в [21]. Оценка аппаратных погрешностей и анализ соответствующих искажений, вносимых нефелометром в структуру и угловые зависимости компонентов МРС, проведенные с помощью экспериментов на суспензиях полистироловых латексов, показали, что наибольшие отклонения значений элементов матрицы от теоретических значений
не превышают 3 %, а для компонентов четвертой строки и четвертого столбца — 5 %.
Матрицы рассеяния света прозрачного и мутного хрусталиков. Измерения МРС проводились на интактных хрусталиках трупных глаз человека, причем время после смерти до начала измерений в среднем не превышало 8 часов. Мутные хрусталики были получены непосредственно после операций по поводу катаракты. Проведенные исследования показали, что наблюдается хорошая воспроизводимость результатов измерений, выполненных с интервалом времени не более 2 часов, при этом ошибка определения любого матричного элемента не превышает аппаратурной погрешности. Индивидуальные различия прозрачных хрусталиков находятся в пределах 5—10 %, в то время как вариации свойств мутных хрусталиков выражены более заметно, что объясняется различной степенью зрелости катаракты.
Измерения угловых зависимостей элементов МРС прозрачного и мутного (зрелая ядерная катаракта) хрусталиков глаза проводились в диапазоне углов от 20 до 140°. На рис. 2.2 представлены результаты соответствующих измерений. Анализ всех компонентов МРС различных хрусталиков показывает, что с точностью до погрешностей измерений приведенная МРС (т. е. все элементы МРС нормированы на первый элемент) имеет следующую структуру:
(2.7)
При этом различия элементов М33 и М44 не превышают 10 %. Наличие ненулевых значений элементов М13 и М23 свидетельствует о том, что рассеивающим частицам хрусталика свойствен отличный от нуля коэффициент перекрестной поляризации [17]. Возможным объяснением этого может быть оптическая активность вещества хрусталика или, что более вероятно, рассеяние на структурах хрусталика, оси симметрии которых наклонены к плоскости симметрии. Сглаженный характер всех полученных кривых объясняется полидисперсностью рассеивающих частиц. Отметим, что во всем диапазоне углов элементы МРС прозрачного хрусталика удовлетворяют неравенству
(2.8)
справедливому для скопления сферических частиц, неоднородных по размеру или составу [24].
Как видно из рис. 2.2, угловые характеристики МРС мутного хрусталика существенно изменены по сравнению с- прозрачным хрусталиком. Значения элементов М12 и М21, оставаясь отрицательными, уменьшаются по абсолютной величине, и точка экстремума смещается в сторону больших углов рассеяния. Характер угловой зависимости элемента М22 указывает на появление в среде крупных несферических рассеивающих частиц. Частицы крупных размеров обусловливают и смещение точки пересечения кривой Мз3 с осью абсцисс в сторону углов, больших 100°. Следует так» же заметить, что при малых углах рассеяния (<20°) матричные элементы мутного хрусталика не удовлетворяют неравенству (2.8).
Для сравнения рассеивающих свойств локальных участков хрусталиков были проведены измерения МРС при перемещении его вдоль луча для нескольких фиксированных углов рассеяния. При этом визируемый объем смещался на 4 мм в обе стороны от центра. Было получено, что смещение хрусталика в пределах ±2 мм не приводит к заметным изменениям элементов МРС. Это свидетельствует об' однородности рассеивающих свойств в пределах ядра хрусталика, что позволяет проводить измерения МРС на объектах in vivo, не накладывая жестких ограничений на стабильность положения хрусталика глаза.
Таким образом, проведенные исследования показывают, что элементы МРС прозрачного и катарактального хрусталиков имеют ярко выраженные различия по абсолютному значению и их угловым зависимостям. Однако для ранней диагностики катаракты необходимы исследования МРС на всех стадиях зарождения и развития катаракты. В связи с этим на животных изучались характерные изменения элементов МРС в зависимости от степени помутнения хрусталика. Хрусталики с разной степенью помутнений получали от кроликов, которые подвергались ежедневным затравкам нафталина в течение 5 суток (1,5 грамма нафталина на 1 кг массы животного в сутки) [25]. Сравнение результатов для нормальных хрусталиков глаза кроликов и человека свидетельствует о почти полном совпадении их рассеивающих свойств. Это соответствует выводам, полученным на основании биохимических исследований, о большой специфичности органа и малой специфичности вида для состава и строения хрусталика [26].
На рис. 2.3 представлены угловые зависимости элементов МРС хрусталиков кроликов, подвергавшихся затравкам нафталина в течение 2 и 5 суток соответственно. Традиционные методы клинических исследований не позволили в этом случае диагностировать наличие помутнений, в то время как в угловых зависимостях элементов МРС отчетливо прослеживаются отличия от соответствующих характеристик прозрачного хрусталика. После 5 суток затравки в большинстве случаев наблюдалось выраженное помутнение хрусталика. Качественное изменение характеристик рассеяния сходно с соответствующей картиной для зрелой катаракты глаза человека, однако имеется ряд отличий, связанных с тем, что нафталиновая катаракта моделирует несколько иной типа катаракты, чем бурая ядерная катаракта [27].


Рис. 2.3. Индикатрисы элементов МРС хрусталика глаза кролика при сроке нафталиновой затравки 2 суток (а) и 5 суток (б)
Выявление элементов МРС, наиболее чувствительных к конкретным изменениям параметров рассеивающей среды, является основной задачей интерпретации экспериментальных результатов светорассеяния [17]. Такими критериями могут быть значения углов рассеяния, при которых индикатрисы того или иного элемента МРС пересекают нулевую линию. Состояние среды может также характеризоваться экстремальным значением некоторых элементов МРС или их относительным соотношением. Подробный анализ характера изменений элементов МРС приведен в [21]. Следует только подчеркнуть, что срок затравки не может однозначно характеризовать степень помутнения. Последняя зависит от целого ряда факторов, таких как общее состояние организма животного, индивидуальные особенности его тканей и даже особенности поведения.
Однако наблюдается общая тенденция развития помутнения по мере увеличения сроков затравки. На основании закономерностей поведения элементов МРС можно заключить, что на ранней стадии развития помутнений увеличение размеров рассеивателей незначительно сказывается на характеристиках светорассеяния. Возможно, процесс развития помутнений начинается с незначительного увеличения размеров большого числа рассеивателей или с появлением крупных рассеивателей, слабо меняющих поляризационные характеристики рассеянного света. Это приводит к нарушению в расположении частиц нормального хрусталика. Следует также заметить, что нафталиновая катаракта — это модель, хотя и не полно описывающая бурую ядерную катаракту. Очевидно, в каждом конкретном случае характеристики меняются в зависимости от этиологии помутнения среды.
Поляризационные характеристики роговой оболочки глаза. Наиболее полно из всех оптических сред глаза изучены свойства его роговой оболочки. Первоначально для объяснения высокой прозрачности роговицы было предложено, что рассеивающие свет коллагеновые волокна стромального слоя роговицы, окруженные базовым веществом, размещаются в узлах «идеальной решетки» [28]. Однако исследования строения роговой оболочки, проведенные с помощью электронного микроскопа, показали наличие неупорядоченности в расположении волокон. Согласно модели Харта — Фарреля (ХФ), в расположении коллагеновых волокон роговицы существует упорядоченность ближнего порядка, описываемая функцией радиального распределения g(R), представляющей собой отношение локальной плотности к средней плотности центров волокон в зависимости от расстояния R между волокнами [29]. Такая упорядоченность в расположении центров волокон обусловлена макромолекулами базового вещества, образующими мостики между волокнами [30].
Модель ХФ позволила объяснить гидрофильные свойства роговичной стромы [31], потерю прозрачности при появлении в роговице участков, лишенных коллагеновых волокон [32], и некоторые другие свойства роговицы. На основании модели ХФ было объяснено также появление картин рассеяния света под малыми углами на объектах in vivo, получены выражения для поляризационных и угловых зависимостей оптических свойств роговицы [33—35].

Мягкость рассеивающих частиц роговицы позволяет при расчетах рассеяния пренебречь явлениями многократного рассеяния. Далее, считая, что прямо прошедшее излучение   совпадает с ослабленной когерентной составляющей [21], можно определить коэффициент ослабления, проинтегрировав интенсивность рассеянного по всем направлениям света
Рис. 2.4. Спектры пропускания роговой оболочки глаза при нормальном падении света: 1 — вертикальная поляризация, 2 — горизонтальная поляризация, 3 — неполяризованный свет, 4 —экспериментальные данные для неполяризованного света из[36]
с учетом интерференции волн от отдельных волокон. Последнее описывается статистически с помощью упоминавшейся выше функции радиального распределения g(R). Характеристики светорассеяния отдельного волокна рассчитываются с использованием хорошо разработанных методов расчета, развитых для длинных цилиндров, причем наиболее точного соответствия результатов расчета с экспериментом удается достичь с помощью теории Ми [17].
На рис. 2.4 представлены результаты расчета спектров пропускания роговицы в диапазоне длин волн от 200 до 800 нм при нормальном падении световых пучков, поляризованных параллельно (/) и перпендикулярно (2) направлению осей коллагеновых волокон, а также приведены спектр пропускания неполяризованного света (3) и экспериментальный спектр (4) из [36]. Следует сразу заметить, что резкое уменьшение пропускания, наблюдаемое экспериментально при 400 нм, вызывается рассеянием света, а не поглощением. Увеличение или уменьшение упорядоченности в расположении волокон роговицы должно привести к смещению нижней границы спектра пропускания влево или вправо соответственно. В пользу этого утверждения говорит тот факт, что у людей с нарушенной упорядоченностью волокон (например, после операции кератомии) ухудшается сумеречное зрение [37], которое в соответствии с эффектом Пуркинье осуществляется в коротковолновой области спектра.
Из рис. 2.4 видно, что при А,=632,8 нм разница в пропускании света двух ортогональных поляризаций Д/= = (/±—/,,)//, (где 7ц, /х — интенсивности прошедшего роговицу света, поляризованного параллельно и перпендикулярно направлению волокон соответственно, h — интенсивность падающего на роговицу света) составляет приблизительно 15 %, что подтверждено экспериментально 138].
В видимой области спектра величина А/ линейно убывает с ростом длины волны от 25 % при А,=400 нм до 11 % при ?.=700 нм, т. е. в коротковолновой области спектра поляризационная чувствительность роговицы в 2,5 раза выше, чем в длинноволновой. Возможно, этим объясняется тот факт, что энтоптическое явление «щеток» Гайдингера наблюдается именно в сине-зеленой области спектра.
Исследование свойств роговой оболочки глаза представляет интерес как в связи с необходимостью определения структуры самой роговицы, так и потому, что ее характеристики оказывают существенное влияние на результаты измерения параметров внутренних структур глаза в условиях in vivo, особенно поляризационные характеристики локальных участков роговицы. Очевидно, особый интерес представляют измерения МРС роговой оболочки в прямом направлении, так как именно эти характеристики необходимы для введения соответствующих поправок при измерениях параметров рассеяния внутренних структур глаза.
Эксперименты проводились на роговицах энуклеированных глаз кролика и роговицах трупных глаз человека, причем время до начала эксперимента обычно не превышало 30 минут и 8 часов соответственно. Выделенные роговицы закреплялись в специальной кювете, позволяющей имитировать нормальное внутриглазное давление. Тем самым исключались искажения за счет дополнительных напряжений при фиксации.
Диаметр облучающего пучка света, определяющий размер исследуемого локального участка роговицы, составлял не более 0,2 мм. Каждому участку роговой оболочки соответствует значение координат согласно схеме, при которой точке с координатой (12,3) соответствует точка роговицы, расположенная в вертикальной плоскости на расстоянии 3 мм выше центра, точка (3,1) расположена в горизонтальной плоскости на расстоянии 1 мм правее центра и т. п.
Роговица устанавливалась таким образом, чтобы ее передняя поверхность была перпендикулярна падающему лучу, и измерялись МРС роговой оболочки в направлении вперед.
Таблица 2.1
Значения элементов МРС роговой оболочки глаза человека

Результаты измерений для роговой оболочки глаза человека представлены в табл. 2.1. Аналогичные результаты представлены в табл. 2.2 для участков роговой оболочки глаза кролика, расположенных вдоль горизонтального меридиана.
Необходимость ориентации поверхности роговицы нормально к падающему лучу приводит к тому, что измеряемый участок располагается на горизонтальной линии, проходящей через центр роговицы. Поэтому при использовании данных табл. 2.1 необходимо учитывать, что матрицы всех участков, кроме расположенных вдоль меридиана 3—9 часов, повернуты на угол, пропорциональный угловой координате данного участка.
Таблица 2.2
Значения элементов МРС роговой оболочки глаза кролика

В табл. 2.1 приведены значения, усредненные для 10 объектов. Индивидуальные различия роговиц и разное время хранения приводят к разбросу измеренных значений, в 2—3 раза превышающему погрешность эксперимента. Тем не менее для каждой отдельной роговицы в пределах погрешности эксперимента выполняются соотношения симметрии, справедливые для неидеальной фазовой пластинки, т. е. М1г=Мг1, M13—M3U М23= =М32, Мц=—М4г, M3t=—Mt3, M14=M41»0.
Общей закономерностью для всех роговиц является также наличие более выраженных анизотропных свойств на периферических участках вдоль вертикального и горизонтального меридианов для человека и по линии от уха к носу для кролика. Центр роговицы представляет собой практически изотропную пластинку. Локальные оптические оси, Рассчитанные для эквивалентных фазовых пластинок с учетом поправок на угол поворота, имеют тенденцию к радиальной симметрии. Дихроизм роговой оболочки максимален на периферических участках 3 и 9 часов.
Методы диагностики катаракты. Для решения задач диагностики в офтальмологии необходимо построение адекватных моделей прозрачных сред глаза. Поэтому скажем несколько слов о поляризационных свойствах таких сред, как водянистая влага и стекловидное тело. Водянистая: влага — прозрачная бесцветная жидкость с показателем преломления около 1,33 содержит сопи, следы белка, аскорбиновую кислоту [39]. Стекловидное тело представляет собой гелеобразную среду, по химическому составу сходную с водянистой влагой. На долю воды приходится 99 % всего состава стекловидного тела, гелеобразную структуру ему придают содержащиеся в нем белки [39].
Общая структура МРС водянистой влаги соответствует матрице изотропной среды, она является практически прозрачной средой, незначительное рассеяние света происходит на растворенных в ней компонентах органического происхождения. Полная интенсивность рассеянного света не превышает 1,5—2,0 %, и водянистая влага не меняет поляризационные характеристики прошедшего через нее излучения. МРС же стекловидного тела по своим характеристикам близка к матрице прозрачного хрусталика, однако рассеивающие частицы стекловидного тела несколько крупнее и их показатель преломления меньше. И кроме того, наличие ненулевых членов в левом верхнем и правом верхнем углах матрицы указывает на аморфное строение объекта.
Таким образом, водянистая влага и стекловидное тело практически не изменяют поляризационных характеристик прямо прошедшего излучения, и, следовательно, их влиянием на результаты измерений объектов in vivo можно пренебречь.
Как уже отмечалось выше, измерения угловых зависимостей элементов МРС оптических сред глаза проводились при нормировании всех элементов МРС на значение элемента Мп. Однако при этом может быть потеряна информация о структуре среды, обусловленная высокой концентрацией рассеивающих частиц исследуемых тканей [40L Ниже представлены результаты измерений индикатрис рассеяния оптических сред глаза, проведенные при постоянном значении интенсивности падающего света.
Измерения проведены при горизонтальной и вертикальной ориентации поляризации падающего света. Соответствующие результаты для прозрачного и мутного хрусталиков, а также для стекловидного тела представлены на рис. 2.5. Видно, что индикатрисы различных сред мало отличаются друг от друга, однако следует учитывать, что каждая из них нормирована к единице при угле рассеяния, равном 90°. Таким образом, представленные индикатрисы не позволяют сравнить значения интенсивности рассеянного в данном направлении света каждой из сред и эти кривые характеризуют только относительное угловое распределение интенсивности рассеянного излучения.

Рис. 2.5. Индикатрисы рассеяния нормального хрусталика (я),
В качестве катарактального хрусталика (б), стекловидного тела (в): 1 — вертикальная поляризация, 2 — горизонтальная поляризация
примера абсолютных различий можно отметить, что значения интенсивности света, рассеянного прозрачным и мутным хрусталиками под углом 90°, относятся как 1:5.
Как показывают расчеты [21], эффекты несферичности формы реальных рассеивателей проявляются незначительно. Следует также заметить, что для прозрачного хрусталика в области углов рассеяния, меньших 30°, наблюдаются отличия экспериментальных значений от расчетных. Эти различия вызваны, по-видимому, интерференционными явлениями, возникающими вследствие высокой концентрации рассеивающих частиц, поскольку, как показано в [40], высокая концентрация частиц приводит к возникновению упорядоченности в их расположении и к появлению интерференции волн, рассеянных отдельными частицами. Согласно результатам расчетов [41] и экспериментов с модельными средами [42], интерференция света, рассеянного в среде с высокой концентрацией рассеивающих частиц, приводит к уменьшению полной энергии рассеянного излучения и увеличению коэффициента направленного пропускания света. Именно это имеет место в случае нормального хрусталика и обусловливает его высокую прозрачность.
Развитие помутнений хрусталика обусловлено образованием рассеивающих частиц, размеры которых изменяются в широких пределах. Поэтому, даже при относительно плотной упаковке, упорядоченное расположение рассеивающих частиц мутного хрусталика невозможно. Это подтверждается отсутствием осцилляций на индикатрисе рассеяния мутного хрусталика в отличие от прозрачного. Неупорядоченное расположение частиц мутного хрусталика приводит к увеличению энергии рассеянного излучения. Кроме того, рассеивающие частицы мутного хрусталика имеют более крупные размеры, что увеличивает асимметрию индикатрисы рассеяния, т. е. возрастает доля интенсивности излучения, рассеянного под углом, меньшим 90°.
Сглаженный характер индикатрисы стекловидного тела, показанной на рис. 2.5, свидетельствует об отсутствии интерференционных эффектов в данной среде. Это связано, вероятно, с тем, что плотность основных рассеивателей стекловидного тела значительно ниже плотности рассеивающих частиц прозрачного хрусталика; расстояние между рассеивающими центрами в этом случае значительно превосходит их диаметр, поэтому упорядоченность в их расположении не наблюдается. Общий вид угловой зависимости индикатрисы аналогичен индикатрисе прозрачного хрусталика, однако теоретически он моделируется более мягкими частицами (что подтверждается данными биохимических исследований 139]).
Рассмотрим модель хрусталика из сферических частиц и проанализируем, какую информацию о строении объекта можно получить на ее основе. Будем считать, чго элемент объема хрусталика освещается параллельным световым пучком, многократное рассеяние отсутствует. Очевидно, сложность строения хрусталика, как и любой биологической ткани, обусловливает наличие совокупности рассеивающих частиц, различающихся как размерами, так и оптическими константами. Значения элементов МРС систем полидисперсных частиц определяются соответствующими суммами, причем каждое слагаемое входит с определенным весовым мно
жителем, зависящим от концентрации частиц в каждом диапазоне размеров и оптических констант. Ткани хрусталика не обнаруживают пиков поглощения в видимой области [П. 23], поэтому оптические характеристики рассеивающих частиц хрусталика определяются в основном действительной частью относительного показателя преломления т.
Численный расчет значений соответствующих элементов МРС может быть проведен согласно [43]; в результате получим
(2.9)
Уравнение (2.9) является линейным интегральным уравнением Фредгольма первого рода. Функция f(a, т) — функция концентрации частиц в единице объема при единичном приращении радиуса а и показателя преломления т, ат1Л и атах — граничные радиусы рассеивающих частиц, ттЫ и ттач — граничные значения относительного показателя преломления. Ядро этого уравнения Мц(В, а, т) представляет собой элемент МРС для отдельной частицы радиуса а.
Размер частиц исследуемых тканей глаза сравним с длиной волны в видимой области, поэтому использование различных упрощающих предположений при расчете рассеяния на отдельной частице приводит к большим погрешностям и строгое решение должно проводиться в рамках теории Ми. Задача диагностики параметров исследуемой ткани состоит в определении вида функции f \a, т). В такой полной постановке обращение уравнения (2.9) вызывает большие трудности. Использование дополнительных условий и ограничений, полученных на основе других методов исследований, позволяет упростить решение обратной задачи.
В качестве таких дополнительных условий можно использовать оценки размеров частиц, полученные с помощью электронной микроскопии и других методов [44]. Результаты биохимических исследований свидетельствуют, что диапазон изменения относительного показателя преломления белков достаточно узок. В целях упрощения задачи ограничим вид функции / (о, т) гамма-распределением по размерам при каждом фиксированном значении т:

(2.10)

где а0 — наиболее вероятный радиус частицы, параметр ц определяется из соотношения Дя/а0=2,35/К ц, А а — полу, ширина f(a, т) [1.4]. Такой вид распределения получил широкое распространение при описании свойств рассеивающих частиц органического происхождения [45]. Существенной особенностью гамма-распределения является его несимметричный вид, что позволяет учесть вклад не только от отдельных частиц, но и от более крупных конгломератов этих частиц, образующихся в биологических средах.  Частицы прозрачного хрусталика имеют очень узкое распределение по размерам, которое целесообразно моделировать нормальным распределением [21].
Ограничения, накладываемые на вид функции f(a, т), позволяют определить значения параметров гамма-распределения ft, а0 и значение относительного показателя преломления т. основной фракции рассеивающих частиц. Для этого рассчитывается набор индикатрис элементов МРС модельных систем и определяются значения параметров |л, а0 и т, при которых расчетные кривые наилучшим образом совпадают с экспериментально полученными индикатрисами элементов МРС реального объекта. Моделируя рассеивающие центры хрусталика системой сферических частиц, можно использовать для анализа только индикатрисы элементов М12(М21), М33(Мм) и М34(М43). Значения остальных элементов МРС обусловлены несферичностью рассеивающих частиц.
Численные расчеты проводились в рамках теории Ми, по алгоритму, предложенному в [17]. Как показывают результаты расчетов [21], экспериментальные индикатрисы элементов МРС прозрачного хрусталика достаточно хорошо соответствуют кривым, полученным в предположении нормального распределения рассеивающих частиц, вида [1, 17]:

(2.11)
при /тг= 1,03, ао=250 нм и о„=20 нм. Эти значения следует считать приближенной оценкой наиболее вероятного радиуса рассеивающих частиц хрусталика, и, кроме того, они подтверждают, что распределение по размерам имеет небольшую ширину, так что в первом приближении рассеивающие частицы прозрачного хрусталика можно считать однородными по размеру. Для мутного хрусталика наилучшего соответствия расчетных и экспериментальных кривых удается достичь при условии, что f(a, т) описывается выражением (2.10) со следующими параметрами: ц.=20, а0= = 1700 нм. Относительный показатель преломления в данном случае равен 1,07.
Следует заметить, что при наличии значительных помутнений кривую f (a, т) можно считать одновершинной, так как относительное значение вклада крупных частиц в интенсивность рассеянного излучения значительно превышает вклад фракции с размерами около 600 нм. Использование при расчетах двухвершинной кривой требуется только в тех случаях, когда общая потеря прозрачности не превышает 20 %.
Указанные выше параметры рассеивающих частиц соответствуют двум предельным случаям: прозрачного и мутного хрусталика. Проследить детали помутнения в рамках указанной модели не представляется возможным, так как эти детали затушевываются эффектами несферичности. Тем не менее проведенные оценки позволяют сделать определенные выводы.
На ранних стадиях помутнения экспериментальные характеристики удовлетворительно моделируются системами сферических частиц с постоянным относительным показателем преломления. Функция распределения по размерам в данном случае представляет собой двухвершинную

Рис. 2.6. Кривые распределения по размерам сферических частиц, моделирующих поляризационные характеристики хрусталиков глаза кролика с различной степенью помутнения (номер кривой соответствует сроку нафталиновой затравки в сутках)
кривую, причем положение первой вершины остается неизменным и соответствует 250 нм, а положение второй вершины смещается в пределах от 700 до 1300 нм по мере уменьшения прозрачности. Одновременно с этим наблюдается увеличение относительной доли крупнодисперсной фракции.
При интерпретации экспериментальных результатов, полученных для поздних стадий помутнения, необходимо учитывать постепенное увеличение относительного показателя преломления от 1,03 до 1,07. Вклад в характеристики рассеяния мелкодисперсной фракции становится пренебрежимо малым и при расчетах его можно не учитывать. Наиболее вероятный радиус частиц крупнодисперсной фракции увеличивается до 1700 им.
На рис. 2.6 показаны кривые распределения по размерам частиц крупнодисперсной фракции, найденные подбором параметров системы сферических рассеивателей таким образом, чтобы рассчитанные поляризационные характеристики наиболее полно соответствовали экспериментальным результатам, полученным для хрусталиков глаз кроликов с различными сроками нафталиновой затравки. Из рисунка видно, что на ранних (1, 2) и средних (3) стадиях процесса помутнений изменения претерпевают как положение максимума кривой распределения, так и ширина распределения частиц по размерам. Изменение поляризационных характеристик на поздних стадиях развития процесса помутнения становится менее выраженным. На основании этого можно заключить, что в данном случае рост интенсивности рассеяния обусловлен увеличением числа рассеивающих частиц крупной фракции при слабо меняющихся характеристиках распределения.
Исследования форменных элементов крови. Методы поляризационной нефелометрии используются и для исследования форменных элементов крови (ФЭК)—эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов. Нормальный эритроцит в плазме имеет форму двояковогнутого диска диаметром 7,1 мкм, толщиной в центре 0,9—1,2 мкм и по краю — 1,7— 2,4 мкм. Действительная часть показателя преломления относительно плазмы т—1,041—1,067 (Л.=600 нм) [2], мнимая часть показателя преломления изменяется в пределах 10-2—10-5 (А=350—1000 нм) 11]. Лейкоциты имеют форму сфер диаметрами 8—22 мкм [40], а тромбоциты — тонких дисков диаметрами 2—4 мкм. Оптические параметры тромбоцитов и лейкоцитов мало изучены, однако их относят к слабопоглощающим мягким частицам (для областей длин волн, больших 600 нм).
Из представленных в [46] результатов измерений индикатрис МРС нормальных и сферулированных эритроцитов видно, что максимальные различия между рассеивающими характеристиками двух форм для компонента Mi2 достигают 0,12, для M2i — 0,17, М33— 0,20. Таким образом, изучение МРС позволяет проследить влияние деформации рассеивающих частиц (особенно это справедливо в области углов рассеяния, больших 90°).
В работе [47] на основании исследования угловой структуры ненулевых компонентов МРС описана методика определения действительной части показателя преломления ФЭК. Отмечается, что описанная методика пригодна как для гамма-, так и нормального распределений частиц полидисперсных сред, причем не требуются данные о концентрации частиц, а необходимым является лишь соблюдение условия однократного рассеяния. Методика определения действительной части показателя преломления т сводится к определению угла рассеяния, при котором элемент МРС в диапазоне 80—120° равен нулю, п далее по номограммам, приведенным в [47], определяется показатель преломления т (если т лежит в диапазоне 1,02—1,07). Если же элемент не равен нулю в диапазоне углов 80—120°, то, значит, •л>1,07, и необходимо определить угол рассеяния, при котором компонент М3, также равен нулю.
Следует заметить, что проведенная апробация разработанной методики на тканях глаза, показала ее перспективность и высокую чувствительность для экспрессного определения действительной части относительного показателя преломления рассеивающих частиц катарактального и нормального хрусталиков глаза.



 
« Кровохарканье и легочное кровотечение   Лапароскопическая аппендэктомия у детей »