Начало >> Статьи >> Архивы >> Основы гистологии

Задачи и правила фиксации - Основы гистологии

Оглавление
Основы гистологии
Краткий очерк истории гистологии
Цитология
Клетка
Цитоплазма
Ядро
Жизнедеятельность клетки
Деление клеток
Эпителиальная ткань
Соединительная ткань
Кровь
Рыхлая неоформленная соединительная ткань
Ретикулярная ткань
Плотная волокнистая соединительная ткань
Хрящевая ткань
Костная ткань
Мышечная ткань
Нервная ткань
Нервные волокна и окончания
Сердечно-сосудистая система
Органы кроветворения
Пищеварительная система
Железы
Кожа
Выделительная система
Органы дыхания
Нервная система, органы чувств
Половая система
Организация рабочего места лаборанта-гистолога
Техника изготовления гистологических препаратов
Взятие и этикетирование материала
Задачи и правила фиксации
Фиксирующие средства
Промывание, обезвоживание гистологического материала
Пропитывание и заливка гистологического материала
Подготовка тканей для электронно-микроскопического исследования
Микротомы и работа с ними
Микротом замораживающий, охлаждающий столик
Уход за микротомом, микротом-криостат
Микротомные ножи
Ультратом
Приготовление срезов из парафиновых блоков
Приготовление целлоидиновых срезов
Окрашивание и заключение срезов
Просветление и заключение срезов, заключение в смолы
Заключение в водные среды
Методы окрашивания препаратов
Приготовление и окрашивание мазка крови для подсчета лейкоцитарной формулы
Окрашивание ткани по методу ван-Гизона, Маллори
Окрашивание соединительной ткани азур эозином
Окрашивание эластических волокон методом Унны—Тенцера, резорцин-фуксином
Выявление аргирофильных волокон, элементов нервной системы
Импрегнация по методу Бильшовского-Грос
Выявление нервных элементов методом прижизненного окрашивания метиленовым синим
Импрегнация элементов макроглии
Безынъекционный метод изучения сосудов по В. В. Куприянову
Обработка и окрашивание костной ткани, декальцинация, окрашивание
Гистохимические методы
Выявление (суммарное) белков
Выявление полисахаридов
Выявление и идентификация кислых мукополисахаридов
Комбинированные гистохимические методы (для полисахаридов и протеидов)
Окрашивание жиров и липидов, выявление железа
Гистохимия нервной системы
Гистохимия ферментов
Применение изотопов в гистологии
Приготовление пленчатых препаратов
Обработка биопсийного материала

Значение и общие правила фиксации

Ввиду того что лишенные питания ткани организма очень быстро начинают претерпевать необратимые изменения (будь то смерть целого организма или искусственное удаление отдельных его частей), первыми и обязательными условиями микроскопической техники являются предупреждение и задержка посмертных изменений в тканях. Это достигается путем фиксации взятого для исследования материала.
Фиксация, как указывает сам термин, представляет собой закрепление, сохранение в обрабатываемом кусочке органа того строения, которое он имел при жизни. В основе действия фиксаторов лежат физико-химические процессы ц в первую очередь процесс коагуляции белков.
Фиксирующая жидкость должна отвечать двум основным требованиям: 1) достаточно быстро проникать в ткани и 2) действовать «мягко», не вызывая грубых нарушений тканевых структур (сморщивание, чрезмерное уплотнение и т. п.). Необходимо также учитывать то обстоятельство, что ткани и органы химически и морфологически неоднородны, а их структурные элементы в свою очередь существенно отличаются друг от друга, в силу чего фиксирующая жидкость оказывает неодинаковое воздействие на различные компоненты, входящие в состав фиксируемого материала.
Из сказанного следует, что не существует универсального фиксатора, который бы сохранял одинаково хорошо все составные части клеток и тканей. Одна и та же фиксирующая жидкость может дать совершенно противоположный результат (так, спирт хорошо фиксирует гликоген, но зато полностью растворяет жиры).
Большинство фиксаторов оказывает уплотняющее действие на обрабатываемый материал. Все это следует помнить и подбирать фиксатор в зависимости от целей и задач исследования, а также от особенностей фиксируемого материала. Например, для многих гистологических методов хороша формалиновая фиксация. Однако при тонких цитологических и гистохимических исследованиях фиксация в формалине непригодна. Так, при цитологических исследованиях употребляются сложные фиксаторы, в состав которых наряду с формалином входят осмиевая кислота или соли тяжелых металлов (кобальт, уран, кадмий, хром, ртуть и т. д.) Для гистохимических же исследований предпочтительней брать смеси на спиртовой основе. При некоторых исследованиях необходимо пользоваться несколькими фиксирующими жидкостями.
Для того чтобы успешно осуществить процесс фиксации, необходимо придерживаться определенных правил.

  1. Размер исследуемых кусочков должен быть таким, чтобы произошло полное его пропитывание в оптимальные для данного фиксатора сроки. Решающее значение при этом имеет диффузионная способность фиксирующих жидкостей, которая у разных фиксаторов далеко не одинакова. Например, низкой диффузионной способностью обладают осмий, пикриновая кислота, платина, высокой   —  формалин, трихлоруксусная и уксусная кислоты, метиловый спирт и др. При фиксации ткани печени 1 % осмиевой кислотой в течение
  2. ч последняя проникает на глубину лишь 0,5  — 1 мм, в то время как концентрированный формалин за это же время успевает проникнуть на 4  — 5 мм. Следовательно, для фиксации осмием надо брать более тонкие кусочки (3  — 5 мм), чем для обработки формалином (10  — 15 мм). В среднем же для большинства фиксаторов берут кусочки толщиной 5  — 10 мм.
  3. Количество фиксирующей жидкости должно не менее чем в 20 раз превышать объем исследуемого материала, иначе ее будет недостаточно для осуществления процесса фиксации, а вода, входящая в состав тканей, может изменить свойства фиксатора.
  4. Фиксируемый объект нужно помещать так, чтобы обеспечить одновременно его пропитывание со всех сторон. Для этого кусочки кладут на стеклянную или обычную вату, помещенную на дно сосуда, или подвешивают, прошив ниткой (или завернув в марлю). Очень мелкие объекты, которые трудно брать пинцетом и можно повредить при переносе из одного сосуда в другой (тканевые культуры и др.), следует поместить в тонкую стеклянную трубку и, завязав ее нижний конец марлей, пропустить через пробку, закрывающую сосуд с фиксатором. В такой «упаковке» объект переносят через все необходимые среды.
  5. Необходимо строго соблюдать время фиксации, которое определяется свойствами жидкости, исследуемого материала и толщиной взятого кусочка.
  6. Фиксацию можно считать законченной после того, как жидкость полностью пропитала фиксируемый объект. Равномерная окраска и одинаковая консистенция тканей на поверхности разреза свидетельствуют о том, что процесс фиксации завершен.

Следует помнить, что излишнее пребывание объекта в фиксирующих жидкостях отрицательно сказывается на качестве получаемых препаратов, ибо ткани становятся хрупкими, ухудшается их окрашиваемость наступает сжатие или набухание и т. д. Лишь некоторые фиксаторы пригодны для длительного хранения материала (10% формалин, жидкость Буэна).
В большинстве случаев фиксацию производят при комнатной температуре. Однако для некоторых специальных исследований (особенно гистохимических и электронно-микроскопических) применяют фиксацию охлажденными жидкостями при температуре +4°С и ниже.
Помимо фиксации кусочков органов и тканей в фиксирующих жидкостях, существует метод прижизненной фиксации органов или целого организма пропусканием (перфузией) фиксатора через кровеносные сосуды. Этот способ особенно ценен для исследований, при которых требуется максимально сократить время между прекращением жизнедеятельности исследуемого объекта и началом фиксации (некоторые гистохимические и гистологические методы), а также зафиксировать целиком крупный орган или весь организм.
Для этих целей необходимо взять две бутыли, имеющие выпускные приспособления внизу (вместимость сосудов подбирается в зависимости от размеров объекта). На отводные стеклянные трубочки, выступающие из нижних пробок, надевают резиновые трубки, которые натягивают на ответвления тройника. Желательно, чтобы ветви тройника имели краны; если же их нет, то нужно приспособить зажимы к трубкам. На оставшуюся свободной (отводящую) ветвь тройника также надевают резиновую трубку, соединенную со стеклянной канюлей (размер канюли подбирают в зависимости от диаметра сосуда). Одну из бутылей наполняют изотоническим раствором хлорида натрия, другую   —  фиксирующей жидкостью. Обе бутыли закрепляют в штативе на высоте, достаточной для обеспечения нужного давления жидкости (рис. 59). В случае надобности бутыли можно снабдить манометром и грушей для нагнетания воздуха. Когда система подготовлена, ее заполняют, обращая особое внимание на то, чтобы нигде не было пузырьков воздуха, так как они могут закупорить сосуд и нарушить прохождение фиксатора. Лишь по окончании всей подготовительной работы животному дают наркоз, привязывают к станку и обнажают оперативным путем артерию и вену подлежащего фиксации органа. Артерию берут на две шелковые нити, приподнимают, надрезают стенку маленькими остроконечными кривыми ножницами и вводят канюлю по ходу кровотока.

Рис. 59.

Приспособление для прижизненной фиксации с помощью перфузии фиксирующих жидкостей через кровеносные сосуды.
Закрепив ее с помощью одной из нитей, вскрывают вену и, открыв кран, начинают пропускать изотонический раствор хлорида натрия (периферический конец артерии перевязывают оставшейся второй ниткой). Как только из вены вместо крови появится светло- розовая жидкость, введение изотонического раствора хлорида натрия прекращают и начинают вводить фиксирующую жидкость до тех пор, пока она не начнет вытекать из вены. После этого перевязывают вену и, когда ток жидкости из бутылки прекратится, перевязывают артерию. Затем извлекают орган и кладут в фиксирующую жидкость. Если нужно фиксировать животное целиком, то наливку производят через аорту или левый желудочек сердца.
Важным моментом является переключение системы с изотоническим раствором хлорида натрия на фиксирующую жидкость. Раннее переключение приводит к фиксации сосудов, заполненных кровью, что служит препятствием к дальнейшему прохождению фиксатора, позднее вызовет нарушение проницаемости сосудистых стенок и отек тканей.



 
« Осложнения аппендэктомии   Основы практической урологии детского возраста »