Начало >> Статьи >> Архивы >> Основы гистологии

Фиксирующие средства - Основы гистологии

Оглавление
Основы гистологии
Краткий очерк истории гистологии
Цитология
Клетка
Цитоплазма
Ядро
Жизнедеятельность клетки
Деление клеток
Эпителиальная ткань
Соединительная ткань
Кровь
Рыхлая неоформленная соединительная ткань
Ретикулярная ткань
Плотная волокнистая соединительная ткань
Хрящевая ткань
Костная ткань
Мышечная ткань
Нервная ткань
Нервные волокна и окончания
Сердечно-сосудистая система
Органы кроветворения
Пищеварительная система
Железы
Кожа
Выделительная система
Органы дыхания
Нервная система, органы чувств
Половая система
Организация рабочего места лаборанта-гистолога
Техника изготовления гистологических препаратов
Взятие и этикетирование материала
Задачи и правила фиксации
Фиксирующие средства
Промывание, обезвоживание гистологического материала
Пропитывание и заливка гистологического материала
Подготовка тканей для электронно-микроскопического исследования
Микротомы и работа с ними
Микротом замораживающий, охлаждающий столик
Уход за микротомом, микротом-криостат
Микротомные ножи
Ультратом
Приготовление срезов из парафиновых блоков
Приготовление целлоидиновых срезов
Окрашивание и заключение срезов
Просветление и заключение срезов, заключение в смолы
Заключение в водные среды
Методы окрашивания препаратов
Приготовление и окрашивание мазка крови для подсчета лейкоцитарной формулы
Окрашивание ткани по методу ван-Гизона, Маллори
Окрашивание соединительной ткани азур эозином
Окрашивание эластических волокон методом Унны—Тенцера, резорцин-фуксином
Выявление аргирофильных волокон, элементов нервной системы
Импрегнация по методу Бильшовского-Грос
Выявление нервных элементов методом прижизненного окрашивания метиленовым синим
Импрегнация элементов макроглии
Безынъекционный метод изучения сосудов по В. В. Куприянову
Обработка и окрашивание костной ткани, декальцинация, окрашивание
Гистохимические методы
Выявление (суммарное) белков
Выявление полисахаридов
Выявление и идентификация кислых мукополисахаридов
Комбинированные гистохимические методы (для полисахаридов и протеидов)
Окрашивание жиров и липидов, выявление железа
Гистохимия нервной системы
Гистохимия ферментов
Применение изотопов в гистологии
Приготовление пленчатых препаратов
Обработка биопсийного материала

Фиксирующие средства и их применение

Применяемые фиксаторы разделяют на две основные группы: 1) фиксирующие вещества (простые фиксаторы);
2) фиксирующие смеси (сложные фиксаторы). Существует большое количество тех и других. В настоящем руководстве приводятся наиболее распространенные фиксаторы.

Простые фиксаторы

Формалин (формол). Формалин является самым дешевым и распространенным фиксатором. В чистом виде представляет светлую, сильно пахнущую жидкость, состоящую из 40% водного раствора формальдегида. Применяют преимущественно в виде 10% водного раствора, для чего 1 часть формалина (т. е. 40% раствора формальдегида) разводят 9 частями воды. Приготавливают раствор обязательно на водопроводной воде, так как дистиллированная вызывает набухание тканей. Широкое применение формалин получил благодаря ряду свойств: а) высокой степени диффузии; б) способности хорошо сохранять форму, окраску и структуру исследуемого объекта; в) оказывать длительное фиксирующее действие (до нескольких лет), существенно не ухудшая при этом качество материала; г) хорошо сохранять жиры и липоиды. Высокая диффузионная способность и незначительное осаждающее действие позволяют формалину довольно быстро и глубоко проникать в ткани, что позволяет фиксировать кусочки органа размером от 1 см и более, а при необходимости и довольно крупные органы целиком.
Срок фиксации тканей в формалине 24—48 ч. Обычный формалин, как правило, содержит примесь метилового спирта и муравьиной кислоты, количество которой увеличивается под влиянием света.
При охлаждении формалина в растворе появляется муть, оседающая в виде белого осадка (параформальдегид). Такой же осадок наблюдается на стенках сосуда и при испарении формалина. Поэтому формалин следует хранить в темной плотно закрывающейся стеклянной посуде при температуре не ниже 9°С.
Нейтрализация формалина. Примесь в формалине муравьиной кислоты придает раствору слабокислый характер, что нежелательно при применении ряда методов исследования (некоторые гистохимические реакции, серебрение раствором нитрата серебра). Способ нейтрализации формалина довольно прост: в сосуд засыпают карбонат кальция (или карбонат магния) в таком количестве, чтобы на дне образовался слой толщиной 1,5—2 см. Затем наливают формалин, несколько раз энергично встряхивают и оставляют стоять 24—48 ч. В течение этого времени происходит нейтрализация раствора.
Побочные действия формалина. Длительное хранение препаратов в концентрированном растворе формалина придает тканям чрезмерную плотность, затрудняющую дальнейшую обработку и ухудшающую качество препарата. Устранить этот недостаток можно путем помещения материала на 2 нед в 1% раствор нитрата серебра или 10% раствор лимонной кислоты. Длительное хранение в 10% растворе формалина приводит также к набуханию объекта, что необходимо помнить при его измерении после фиксации.
При фиксации формалином в препаратах нередко появляется темно-коричневый кристаллический осадок — результат взаимодействия формалина с находящимся в тканях гемоглобином. Его удаляют путем помещения неокрашенных срезов в 1—5% раствор аммиака или 70% этиловый алкоголь на различные сроки (от 5 мин до 4 ч). Затем препарат тщательно промывают и ведут дальнейшую обработку.
Следует постоянно помнить, что длительное действие паров формалина сильно раздражает слизистые оболочки. Смачивание кожи формалином оказывает дубящий эффект, а при повторных частых контактах вызывает сухую экзему. Поэтому перед препарированием формалиновые препараты помещают в слабоаммиачную воду (для устранения запаха) и работают в резиновых перчатках (при возможности под вытяжным устройством).
Этиловый спирт. Фиксирующее действие осуществляется за счет отнятия у тканей воды и коагуляции белков. Несмотря на ряд отрицательных свойств спирта (сморщивание клеток в результате быстрого отнятия воды, растворение и экстракция жиров и гемоглобина), он как фиксатор находит широкое применение в микроскопической технике. Это объясняется тем, что этиловый спирт осуществляет быструю фиксацию, не требующую обезвоживания тканей перед заливкой в парафин и целлоидин. Будучи химически неактивным веществом, спирт особенно пригоден при гистохимических исследованиях. В нем хорошо сохраняются такие вещества, как муцины, гликоген, мочевая кислота, железо, кальций, которые легко растворимы в других фиксирующих жидкостях.
Чаще применяют 96% и абсолютный этиловый спирт. Некоторые авторы рекомендуют также концентрации 80 и 90%. Время фиксации зависит от материала: для тонких пленок — 15—30 мин, для кусочков толщиной 3—4 мм — 2—4 ч. В связи с тем что спирт легче воды, она, экстрагируясь из тканей, опускается на дно. Поэтому под кусочки исследуемого материала нужно обязательно подкладывать толстый слой ваты. Излишнее пребывание препарата в спирте вызывает чрезмерное уплотнение ткани, что плохо отражается на последующей ее обработке.
Метиловый спирт (метанол). Бесцветная жидкость, в чистом виде напоминает по запаху этиловый спирт, технический же (неочищенный) метанол обладает неприятным запахом, обусловленным примесью других веществ. В микроскопической технике применяют в виде абсолютного, лишенного примесей спирта для фиксации мазков крови. Лучше всего пользоваться метанолом, предназначенным для анализа.
Следует помнить, что метанол является сильным ядом, поэтому требуется соблюдение правил употребления и хранения, предусмотренных для ядовитых веществ группы А.
Ацетон. В последнее время все большее применение в гистологических лабораториях для гистохимических целей находит фиксация ацетоном благодаря простоте, возможности быстрой фиксации и сохранению после нее многих химических соединений, в том числе активности многих ферментов. Недостаток метода —нарушение тонкой цитологической структуры. Применять следует бесцветный (безводный) раствор. Фиксировать можно как кусочки тканей (см. с. 157), так и срезы. Приготовленные в криостате срезы расправляют кисточкой на предметном стекле, переносят в плотно закрытый стаканчик с холодным (5--10%) ацетоном и помещают в баню с сухим льдом или же в камеру криостата. Срок фиксации зависит от толщины срезов (в среднем 5—10 мин можно хранить и несколько дней).
Из других фиксирующих средств следует упомянуть дихлорид ртути (сулема), соли тяжелых металлов (кобальт, платина, уран и т. д.) и кислоты (уксусная, трихлоруксусная, пикриновая, осмиевая, хромовая и др.). В чистом виде эти вещества применяют редко, но зато они являются составной частью многих фиксирующих смесей.

Фиксирующие смеси (сложные фиксаторы) и их применение

Жидкость Мюллера. В настоящее время применение ее в чистом виде ограничено. Однако она служит исходным раствором для приготовления таких распространенных фиксаторов, как жидкости Ценкера, Орта, Максимова и др. Состав:
Бихромат калия                                 2,5 г
Сульфат натрия                                 1 г
Вода дистиллированная                     100 мл
Для лучшего растворения бихромата калия рекомендуется подогревать воду.
Жидкость Ценкера (сулемовая смесь). Один из лучших фиксаторов для приготовления обзорных препаратов и препаратов для ряда тонких гистологических исследований. Обеспечивает хорошую окрашиваемость тканей. Состав и способ употребления:
Жидкость Мюллера 100 мл Дихлорид ртути (HgCl2) 5 г Уксусная кислота ледяная              5 мл
(прибавляется непосредственно перед употреблением; может быть заменена равным количеством формалина по Гелли).
Толщина фиксируемых кусочков не должна превышать 5 мм. Время фиксации 1—24 ч в зависимости от толщины и свойств объекта.
Последующая обработка. После тщательного промывания в проточной воде в течение 20—24 ч (вода должна стать бесцветной) кусочки помещают в 70% йодированный спирт для удаления из тканей осадков дихлорида ртути. С этой целью к 70% спирту прибавляют несколько капель 90% спирта, содержащего в 100 мл 2 г йода и 3 г йодида калия, до получения раствора цвета крепкого чая. Отмывание дихлорида ртути ведут в нескольких порциях йодированного спирта, меняя его через 18—24 ч до прекращения просветления (растворение осадка дихлорида ртути обесцвечивает спирт).
После фиксации жидкостью Ценкера рекомендуется заливка в целлоидин или целлоидин-парафин, так как заливка в парафин приводит к значительному сжатию и сморщиванию тканевых структур.
Жидкость Максимова (ценкер-формол). Фактически представляет собой видоизмененную жидкость Ценкера, в которой ледяная уксусная кислота заменена формалином. Фиксатор широко применяют для гематологических исследований. Дает хорошее окрашивание клеток крови и позволяет выявлять их специфичную зернистость.

Состав и способ употребления:
Жидкость Мюллера
Бихромат калия                                                        2,5 г
Сульфат натрия                                                      1 г
Вода дистиллированная                                                                100 мл
Дихлорид ртути                                                                             5 г
Формалин                                                                                  10 мл

Время фиксации 6 ч. Толщина кусочков не больше 5 мм. Дальнейшая обработка и заливка те же, что и после фиксации в жидкости Ценкера.
Если к жидкости Максимова добавить 10 мл 2% раствора осмиевой кислоты и увеличить время фиксации до 24 ч, можно одновременно получить осмирование жира.
Примечание. Дихлорид ртути является сильнодействующим ядом, поэтому употребление и хранение реактива требуют соблюдения правил, предусмотренных для веществ группы А.
Фиксация по Навашину—Крылову. Фиксация этим методом дает хорошие результаты при окраске ядер и протоплазматических структур железным гематоксилином. Состав фиксатора Навашина:
Хромовой кислоты 1 % раствор           10 мл
Формалин 10%                                    10 »
Вода дистиллированная 90 »
Уксусная кислота ледяная (добавляют непосредственно перед фиксацией)             2 »
Кусочки толщиной 5 мм следует фиксировать 4—6 ч; затем тщательно промыть в проточной воде (24—36 ч) для удаления хромовой кислоты, остатки которой ухудшают окраску препаратов.
Г. И. Крылов предложил перед промывкой проводить кусочки через несколько порций 5—10% формалина до прекращения желтого окрашивания раствора (формалин извлекает хромовую кислоту из тканей). Эта процедура сокращает сроки промывания в воде.
Жидкость Буэна. Является одним из лучших фиксаторов. Относительно быстро проникает в ткани, вызывая незначительное (на 2,5%) их сжатие. Очень хорошо окрашивает тканевые структуры. Применяют как для обзорных препаратов, так и для тонких исследований, а также для фиксации эмбрионов.
Состав:
Раствор пикриновой кислоты насыщенный 75      мл
Формалин 25                                             »
Уксусная кислота ледяная 5                       »
Сливание перечисленных жидкостей производят непосредственно перед фиксацией. Так как пикриновая кислота плохо растворяется в воде, ее насыщенный раствор необходимо готовить заранее. В сосуд насыпают 25—30 г кристаллической кислоты и заливают 1 л горячей дистиллированной воды. Избыток кислоты при охлаждении выпадает в осадок и может быть использован при приготовлении новой порции раствора. Раствор можно хранить неограниченно долго.
Продолжительность фиксации материала 2—24 ч в зависимости от величины объекта. Однако и более длительное (до нескольких суток) пребывание кусочков в фиксаторе не ухудшает качество фиксации и последующей обработки.
После фиксации материал переносят в 70—80% спирт (для удаления пикриновой кислоты), который меняют 1-3 раза. Производят заливку в парафин.
Примечание. Объект, фиксированный в жидкости Буэна, не пропитывается полностью целлоидином.
Жидкость Карнуа. Служит хорошим фиксатором как для гистологических исследований (ядра), так и для многих гистохимических методик (нуклеиновые кислоты, белки, полисахариды). Недостатком является легкое сморщивание цитоплазмы и соединительной ткани.
Состав:
Этиловый спирт абсолютный 60 мл (при отсутствии можно заменить
96% спиртом)
Хлороформ                                        30 »
Уксусная кислота ледяная                  10 »
Жидкость Карнуа приготавливают перед фиксацией. Кусочки толщиной до 5 мм фиксируют в течение 1—5 ч (в зависимости от толщины объекта). После фиксации кусочки сразу переносят в абсолютный спирт (если фиксатор был приготовлен на 96% спирте, то кусочки следует ополоснуть 2—3 раза в 96% спирте, где в случае необходимости можно оставить их на 2—3 ч).
Примечание. Надо следить, чтобы материал находился в фиксаторе не дольше, чем это нужно для полного его пропитывания, так как удлинение фиксации усиливает сжатие и уплотнение объекта.
Фиксатор ФСУ (формалин, спирт, уксусная кислота) Бродского.
Рекомендуется для изучения структуры тканей и количественного цитохимического анализа нуклеиновых кислот. Преимущество ФСУ перед фиксатором Карнуа в том, что формалин подавляет активность ферментов, разрушающих нуклеиновые кислоты (нуклеазы) в фиксируемых клетках, благодаря чему количественно лучше сохраняются ДНК и РНК.
Состав и способ употребления:
Формалин нейтральный неразведенный                3 части
Спирт этиловый 96%                                    1 часть
Уксусная кислота ледяная 0,3 части
Кусочки тканей 2x2 или 2x3 мм; время обработки 1-4 ч в зависимости от свойств объекта.
После фиксации кусочки промыть водой в течение 12 ч или (для цитохимических целей) в течение того же времени тремя сменами 70% спирта. Быстро обезводить и залить в парафин.
Фиксатор Шабадаша. Рекомендуется как лучший фиксатор для гистохимического выявления гликогена (особенно, где его мало, —центральная нервная система).
Состав:

Кусочки органа (не более 3x3 мм) фиксировать 3 ч в первом растворе, затем перенести во второй раствор на 3 ч. Промыть в трех-четырех сменах 70% спирта по 2 ч. Залить в парафин или целлоидин.



 
« Осложнения аппендэктомии   Основы иммунологии »