Начало >> Статьи >> Архивы >> Основы гистологии

Приготовление целлоидиновых срезов - Основы гистологии

Оглавление
Основы гистологии
Краткий очерк истории гистологии
Цитология
Клетка
Цитоплазма
Ядро
Жизнедеятельность клетки
Деление клеток
Эпителиальная ткань
Соединительная ткань
Кровь
Рыхлая неоформленная соединительная ткань
Ретикулярная ткань
Плотная волокнистая соединительная ткань
Хрящевая ткань
Костная ткань
Мышечная ткань
Нервная ткань
Нервные волокна и окончания
Сердечно-сосудистая система
Органы кроветворения
Пищеварительная система
Железы
Кожа
Выделительная система
Органы дыхания
Нервная система, органы чувств
Половая система
Организация рабочего места лаборанта-гистолога
Техника изготовления гистологических препаратов
Взятие и этикетирование материала
Задачи и правила фиксации
Фиксирующие средства
Промывание, обезвоживание гистологического материала
Пропитывание и заливка гистологического материала
Подготовка тканей для электронно-микроскопического исследования
Микротомы и работа с ними
Микротом замораживающий, охлаждающий столик
Уход за микротомом, микротом-криостат
Микротомные ножи
Ультратом
Приготовление срезов из парафиновых блоков
Приготовление целлоидиновых срезов
Окрашивание и заключение срезов
Просветление и заключение срезов, заключение в смолы
Заключение в водные среды
Методы окрашивания препаратов
Приготовление и окрашивание мазка крови для подсчета лейкоцитарной формулы
Окрашивание ткани по методу ван-Гизона, Маллори
Окрашивание соединительной ткани азур эозином
Окрашивание эластических волокон методом Унны—Тенцера, резорцин-фуксином
Выявление аргирофильных волокон, элементов нервной системы
Импрегнация по методу Бильшовского-Грос
Выявление нервных элементов методом прижизненного окрашивания метиленовым синим
Импрегнация элементов макроглии
Безынъекционный метод изучения сосудов по В. В. Куприянову
Обработка и окрашивание костной ткани, декальцинация, окрашивание
Гистохимические методы
Выявление (суммарное) белков
Выявление полисахаридов
Выявление и идентификация кислых мукополисахаридов
Комбинированные гистохимические методы (для полисахаридов и протеидов)
Окрашивание жиров и липидов, выявление железа
Гистохимия нервной системы
Гистохимия ферментов
Применение изотопов в гистологии
Приготовление пленчатых препаратов
Обработка биопсийного материала

Для резки целлоидиновых блоков применяют ножи типа А и В с углом наклона несколько меньшим, чем при резке парафинового блока. Угол резания должен быть острым и зависит от плотности блока (чем мягче блок, тем острее угол). Закрепление и предварительную подготовку блока производят так же, как при получении парафиновых срезов. Во время резания нож и блок постоянно смачивают 70—80% спиртом. Целлоидиновые срезы имеют меньшую, чем парафиновые, склонность к свертыванию и не прилипают к ножу. Поэтому в случаях скручивания их можно расправлять кисточкой непосредственно на поверхности ножа.
Готовые целлоидиновые срезы собирают в 70% спирт, где их и хранят до последующей обработки, которую можно производить как со свободноплавающими срезами, так и после предварительного наклеивания их на предметные стекла. В последнем случае в отличие от парафиновых срезов наклеивание осуществляют непосредственно перед окрашиванием. Одним из распространенных методов является метод Рубашкина. Расправленный целлоидиновый срез переносят при помощи шпателя на смазанное белком с глицерином предметное стекло (при этом необходимо перенести как можно меньше спирта) и прижимают сложенной гладкой фильтровальной бумагой. Затем на срезы наливают чистое гвоздичное масло. После того как они полностью просветлятся (5—20 мин), масло сливают, предметное стекло со срезом помещают в 96% или абсолютный спирт, который сменяют 2—3 раза через 5—10 мин (для набухания целлоидина). После этого для полного растворения целлоидина наклеенные срезы переносят в спирт-эфир или метиловый спирт и затем проводят через спирты нисходящей концентрации (до воды).
Приготовление целлоидин-парафиновых срезов ничем не отличается от получения срезов при резании парафиновых блоков, наклеивание — также.

РЕЗАНИЕ НА ЗАМОРАЖИВАЮЩЕМ МИКРОТОМЕ

Обычно на замораживающем микротоме режут материал, фиксированный в формалине или спирте, а также залитый в желатину. Фиксация в жидкостях, содержащих дихлорид ртути, не рекомендуется, так как наличие ртути ухудшает качество резки (повреждается лезвие ножа).
Прежде чем приступить к подготовке материала для резки на замораживающем микротоме, необходимо проверить, есть ли в баллоне углекислота и поступает ли она в замораживающий столик. Для этого нужно открыть вентиль баллона с углекислотой и повернуть рукоятку, регулирующую подачу газа.
Подлежащий резке фиксированный материал помещают в сосуд с проточной водой и промывают несколько часов (обычно ставят на ночь). Затем вырезают кусочек толщиной 4—6 мм и кладут в чашку с дистиллированной водой.
Закрепив малый микротомный нож типа С винтами в пазах ножедержателя, устанавливают угол наклона около 45° и отводят в заднее крайнее положение. Затем извлекают подготовленный кусочек материала из воды, кладут на увлажненную поверхность замораживающей камеры или на подкладку из смоченной фильтровальной бумаги и ориентируют в нужном положении. После этого кратковременным открыванием и закрыванием крана подачи углекислоты производят замораживание исследуемого материала. Для ускорения замораживания камеру с препаратом накрывают специальным толстостенным стаканом, входящим в комплект микротома. Если таковой отсутствует, можно приспособить лабораторный стеклянный стакан соответствующих размеров. Одновременно с замораживанием объекта следует производить охлаждение ножа, подавая углекислоту через предназначенную для этого трубку.
По окончании замораживания (о чем узнают по затвердению и побелению препарата) устанавливают микрометрическую шкалу на нужную толщину среза и, поместив нож над объектом, вращением ручки подающего механизма поднимают столик с кусочком ткани до уровня лезвия ножа. Затем движением ножа за рукоятку на себя начинают резку материала. При каждом отведении рукоятки в крайнее заднее положение столик с препаратом автоматически поднимается на заданную высоту. Срез снимают с ножа пальцем или кисточкой и помещают в чашку с дистиллированной водой, где он сразу же расправляется. Если срезы нужно некоторое время сохранить, то после расправления в воде их следует перенести в 10—12% раствор формалина.
Желатиновые блоки режут таким же образом, только охлаждение их более длительное, а примораживание происходит лучше, если накапывать на столик не воду, а раствор желатины, предназначенный для пропитывания объекта. Качество резки также улучшается, если после первого замораживания блоку дать оттаять и затем заморозить его вторично. Собирать срезы следует в холодную воду или 30° спирт, где они легко расправляются. При необходимости хранения срезы переносят в 10% раствор формалина.
Полученные с помощью замораживающего микротома срезы обрабатывают преимущественно свободноплавающими. Однако при необходимости их можно предварительно наклеить на предметное стекло. Для этого их помещают в 30% спирт, затем переносят на предметное стекло, смазанное белком с глицерином, расправляют и прижимают гладкой фильтровальной бумагой, смоченной 30% спиртом. После этого срезы переносят в смесь из 50 мл 50% спирта и 7,5 мл формалина (на 1 мин), тщательно промывают дистиллированной водой и окрашивают.
Получение хороших срезов из свежего, нефиксированного материала на обычном замораживающем микротоме затруднено, особенно если дальнейшая обработка не допускает фиксации (например, гистохимическое выявление ферментов).
Последние модели отечественных и зарубежных замораживающих микротомов имеют специальные приспособления для охлаждения ножа. Если микротом старой конструкции, то охладить нож можно, приспособив к нему лоточек с сухим льдом.
При резке нефиксированных замороженных блоков охлажденным ножом срезы не сворачиваются и могут быть перенесены холодной кисточкой прямо на предметное стекло, к которому они прилипают и присыхают без клеющих средств.
Как и при заливке в специальные среды, при резке на замораживающем микротоме возможно одновременное приготовление срезов из двух кусочков. Для этого из сравниваемых объектов вырезают кусочки различной формы, располагают рядом на столике, замораживают и режут, Неодинаковая форма срезов позволяет легко различать их. Последующую обработку ведут также одновременно, а после окраски сравниваемые срезы укладывают на одно предметное стекло и приготавливают комбинированный препарат.
Однако наилучшие срезы из свежезамороженной ткани получают в специальном холодильном аппарате — криостате.
Основные приемы работы с криостатом. Прежде чем брать материал для приготовления свежезамороженных срезов в криостате, следует положить в камеру микротомный нож, кисточку, скальпель, препаровальную иглу и подставку для стекол, включить криостат в холодильный агрегат и подождать, пока температура в камере не достигнет рабочего режима (—12 —15°). Затем материал помещают на снятый с микротома блокодержатель, смочив предварительно поверхность водой, ориентируют в нужном положении и примораживают (можно использовать сухой лед, углекислоту, петролейный эфир, хлорэтил).
Если материал нужно брать срочно и нет времени ждать, пока криостат войдет в рабочий режим, блокодержатель с примороженным объектом следует обернуть холодной фольгой или положить в охлажденный бюкс для предупреждения вымерзания влаги и поместить в морозильную камеру холодильника (при условии, что температура там не выше —8—10°С). Основное требование — не дать блоку оттаять. Так же можно хранить замороженные блоки в течение нескольких дней. Перенеся блокодержатель с объектом в холодильную камеру, насаживают его на микротом. После этого с помощью уже находящегося в камере охлажденного скальпеля придают кусочку необходимую форму, закрепляют в микротоме нож и приступают к резке.
Если степень охлаждения объекта подобрана правильно (для материала различной плотности требуется неодинаковый температурный режим) и противосвертывающее приспособление хорошо отрегулировано, то срезы хорошо ложатся на нож. При скручивании срезов их необходимо расправлять на ноже, для чего, как только нож врежется в блок, следует слегка прижать кисточкой к ножу начало среза и вести нож книзу по мере срезания с блока. Чистое обезжиренное сухое стекло комнатной температуры вносят в камеру и осторожно приближают к срезу. Благодаря разности температур срез отрывается от ножа и прилипает к предметному стеклу. Стекла со срезами подсушивают при комнатной температуре или же фиксируют в различных жидкостях в зависимости от дальнейшего метода обработки. При резке в криостате нефиксированных объектов возможно приготовление препаратов, совмещенных из шести и даже восьми кусочков. При этом склеивание и смерзание их настолько тесное, что границу трудно различить даже в микроскоп.
Следует помнить, что для получения хороших срезов кусочек должен быть охлажден до определенного состояния. Если срез крошится, то объект переморожен и нужно немного подождать, пока он, оттаивая, не приобретет надлежащей твердости. Если же срез мнется, то объект недостаточно охлажден и его нужно слегка подморозить.



 
« Осложнения аппендэктомии   Основы практической урологии детского возраста »