Начало >> Статьи >> Архивы >> Основы гистологии

Обработка и окрашивание костной ткани, декальцинация, окрашивание - Основы гистологии

Оглавление
Основы гистологии
Краткий очерк истории гистологии
Цитология
Клетка
Цитоплазма
Ядро
Жизнедеятельность клетки
Деление клеток
Эпителиальная ткань
Соединительная ткань
Кровь
Рыхлая неоформленная соединительная ткань
Ретикулярная ткань
Плотная волокнистая соединительная ткань
Хрящевая ткань
Костная ткань
Мышечная ткань
Нервная ткань
Нервные волокна и окончания
Сердечно-сосудистая система
Органы кроветворения
Пищеварительная система
Железы
Кожа
Выделительная система
Органы дыхания
Нервная система, органы чувств
Половая система
Организация рабочего места лаборанта-гистолога
Техника изготовления гистологических препаратов
Взятие и этикетирование материала
Задачи и правила фиксации
Фиксирующие средства
Промывание, обезвоживание гистологического материала
Пропитывание и заливка гистологического материала
Подготовка тканей для электронно-микроскопического исследования
Микротомы и работа с ними
Микротом замораживающий, охлаждающий столик
Уход за микротомом, микротом-криостат
Микротомные ножи
Ультратом
Приготовление срезов из парафиновых блоков
Приготовление целлоидиновых срезов
Окрашивание и заключение срезов
Просветление и заключение срезов, заключение в смолы
Заключение в водные среды
Методы окрашивания препаратов
Приготовление и окрашивание мазка крови для подсчета лейкоцитарной формулы
Окрашивание ткани по методу ван-Гизона, Маллори
Окрашивание соединительной ткани азур эозином
Окрашивание эластических волокон методом Унны—Тенцера, резорцин-фуксином
Выявление аргирофильных волокон, элементов нервной системы
Импрегнация по методу Бильшовского-Грос
Выявление нервных элементов методом прижизненного окрашивания метиленовым синим
Импрегнация элементов макроглии
Безынъекционный метод изучения сосудов по В. В. Куприянову
Обработка и окрашивание костной ткани, декальцинация, окрашивание
Гистохимические методы
Выявление (суммарное) белков
Выявление полисахаридов
Выявление и идентификация кислых мукополисахаридов
Комбинированные гистохимические методы (для полисахаридов и протеидов)
Окрашивание жиров и липидов, выявление железа
Гистохимия нервной системы
Гистохимия ферментов
Применение изотопов в гистологии
Приготовление пленчатых препаратов
Обработка биопсийного материала

Обработка и окрашивание костной ткани

Костная ткань по физическим свойствам занимает особое место среди тканей организма. Наличие в ее межклеточном веществе солей кальция придает ткани твердость, значительно затрудняющую приготовление гистологических препаратов, поэтому обработка костной ткани имеет свои особенности. Существуют два основных способа получения гистологических препаратов: 1) приготовление срезов после специальной предварительной подготовки объекта, суть которой сводится к растворению и удалению из костной ткани неорганических солей (декальцинация); 2) приготовление тонких костных пластинок (шлифов) из кусочков нефиксированной компактной кости путем стачивания последних.

Декальцинация

Прежде чем приступить к декальцинации, кость, как и любую ткань, необходимо подвергнуть фиксации. Выбор фиксатора зависит от целей и характера исследования. Так, для обзорных препаратов и выявления фибриллярных компонентов костной ткани применяют чистый формалин (15—20% раствор), в то время как для цитологических исследований предпочтительней сложные фиксаторы, также содержащие формалин, ибо он уменьшает степень набухания волокнистых структур при последующей обработке ткани (например, фиксатор Штиве: насыщенный водный раствор дихлорида ртути — 76 мл, формалин — 20 мл, ледяная уксусная кислота — 4 мл).
Для фиксации следует выпиливать лобзиком небольшие кусочки кости (толщиной 0,5—1 см), так как из-за высокой плотности ткани фиксатор проникает медленно. Срок фиксации зависит от толщины кусочка (не менее 48 ч).
По окончании фиксации объект тщательно промывают в проточной водопроводной воде или спирте (например, после сложных фиксаторов, содержащих дихлорид ртути), так как при последующей обработке кислотами могут образоваться труднорастворимые осадки. После этого в целях обезжиривания препарат проводят через ряд спиртов повышающейся концентрации (50, 70 и 96%), а затем доводят до воды через спирты нисходящей концентрации.
Декальцинация достигается обработкой костной ткани с помощью декальцинирующих жидкостей, обладающих свойствами растворять неорганические соли, не повреждая структурные элементы кости.
При декальцинации следует придерживаться следующих основных правил:

  1. применять большое количество декальцинирующей жидкости и сменять ее ежедневно (объем жидкости должен превышать объем объекта не менее чем в 50—70 раз);
  2. декальцинируемый объект помещать в верхнем слое жидкости, чтобы обеспечить опускание на дно растворяющихся солей (подвешивание кусочков на нитке или в стеклянном сите);
  3. проводить декальцинацию до полного удаления минеральных солей (но не передерживать материал в жидкостях, так как это приводит к набуханию фибрилл и ухудшению окрашиваемости структур).

Декальцинация считается полной тогда, когда объект становится мягким и режется ножом легко и без хруста. Ход процесса можно проверять по степени погружения в объект препаровальной иглы. Сгибать препарат и надавливать на него не рекомендуется, так как это приводит к повреждению тонких структур кости.
Декальцинация в водном растворе азотной кислоты (5—7,5%) является наиболее распространенным способом. Для приготовления рабочего раствора в мерную посуду наливают 5—7,5 мл химически чистой концентрированной азотной кислоты (плотность 1,40) и доливают до 100 мл дистиллированной водой (раствор можно готовить впрок в больших количествах, рассчитав общую потребность). Применять более низкие и более высокие концентрации раствора для декальцинации кости не рекомендуется, так как первые вызывают набухание, а вторые — повреждение клеточных структур. Более высокие концентрации (до 10%) используют лишь для декальцинации зубов.
Налив нужное количество жидкости в подходящий стеклянный сосуд, в нее подвешивают подготовленный к декальцинации кусочек кости. Раствор сменяют ежедневно до наступления полной декальцинации. Срок декальцинации зависит от свойств объекта (плотность, величина) и концентрации азотной кислоты. Средняя продолжительность декальцинации небольших кусочков компактной костной ткани 10—12 сут.
По окончании декальцинации для устранения набухания волокнистых структур препарат подвешивают на 24 ч в 5% раствор сульфата натрия или лития (в случае отсутствия таких солей кость следует поместить в 96% спирт) и лишь после этого тщательно промывают в течение 1—2сут в проточной водопроводной воде.
Можно сократить срок получения декальцинированной кости, поместив выпиленный кусочек непосредственно в 5% раствор трихлоруксусной кислоты, содержащий 10—20% формалина. Эта смесь одновременно фиксирует и декальцинирует. Маленький кусочек средней плотности можно декальцинировать за 3—5 дней. После декальцинации промывают в спирте (ни в коем случае не в воде!).
Существует ряд других способов декальцинации, но все они основаны на одном и том же принципе и требуют соблюдения изложенных выше общих правил.
После декальцинации костную ткань можно резать на замораживающем микротоме, а также заливать в целлоидин или целлоидин-парафин обычным путем. Заливка в парафин не рекомендуется, так как он плохо пропитывает декальцинированную кость.
В настоящее время отечественная промышленность начала выпускать специальный микротом санного типа, позволяющий резать кость без предварительной декальцинации, получая срезы толщиной 20—50 мкм.

Окрашивание

Наиболее распространенный метод окрашивания срезов декальцинированной костной ткани — по Шморлю (тионинпикриновая кислота). Рабочие растворы: А — насыщенный раствор тионина в 50%спирте, Б— 1% водный раствор фенола, В — насыщенный раствор пикриновой кислоты.
Перед употреблением сливают 1 часть раствора А с 10 частями раствора Б. Находящиеся в воде срезы переносят на 10 мин в полученную смесь, после чего споласкивают в дистиллированной воде и помещают на 30—60 с в насыщенный раствор пикриновой кислоты. Затем срезы вновь споласкивают в дистиллированной воде и дифференцируют в 70° спирте до получения темно-красной окраски. После этого их переносят в 96° спирт, в котором продолжают дифференцировку (под контролем в микроскоп) до тех пор, пока общий фон среза не приобретет коричневый4 (или болотный) цвет, а костные клетки и их отростки — красный. Окрашенные срезы затем проводят через 96% и абсолютный спирт, карбол-толуол, толуол и заключают в бальзам.
Если срез плохо окрашивается из-за длительной декальцинации в азотной кислоте, его нужно предварительно поместить на 2—3 ч в 0,5% аммиачную воду, после чего хорошо промыть в дистиллированной воде и затем окрасить.



 
« Осложнения аппендэктомии   Основы педиатрии »