Начало >> Статьи >> Архивы >> Основы гистологии

Выявление полисахаридов - Основы гистологии

Оглавление
Основы гистологии
Краткий очерк истории гистологии
Цитология
Клетка
Цитоплазма
Ядро
Жизнедеятельность клетки
Деление клеток
Эпителиальная ткань
Соединительная ткань
Кровь
Рыхлая неоформленная соединительная ткань
Ретикулярная ткань
Плотная волокнистая соединительная ткань
Хрящевая ткань
Костная ткань
Мышечная ткань
Нервная ткань
Нервные волокна и окончания
Сердечно-сосудистая система
Органы кроветворения
Пищеварительная система
Железы
Кожа
Выделительная система
Органы дыхания
Нервная система, органы чувств
Половая система
Организация рабочего места лаборанта-гистолога
Техника изготовления гистологических препаратов
Взятие и этикетирование материала
Задачи и правила фиксации
Фиксирующие средства
Промывание, обезвоживание гистологического материала
Пропитывание и заливка гистологического материала
Подготовка тканей для электронно-микроскопического исследования
Микротомы и работа с ними
Микротом замораживающий, охлаждающий столик
Уход за микротомом, микротом-криостат
Микротомные ножи
Ультратом
Приготовление срезов из парафиновых блоков
Приготовление целлоидиновых срезов
Окрашивание и заключение срезов
Просветление и заключение срезов, заключение в смолы
Заключение в водные среды
Методы окрашивания препаратов
Приготовление и окрашивание мазка крови для подсчета лейкоцитарной формулы
Окрашивание ткани по методу ван-Гизона, Маллори
Окрашивание соединительной ткани азур эозином
Окрашивание эластических волокон методом Унны—Тенцера, резорцин-фуксином
Выявление аргирофильных волокон, элементов нервной системы
Импрегнация по методу Бильшовского-Грос
Выявление нервных элементов методом прижизненного окрашивания метиленовым синим
Импрегнация элементов макроглии
Безынъекционный метод изучения сосудов по В. В. Куприянову
Обработка и окрашивание костной ткани, декальцинация, окрашивание
Гистохимические методы
Выявление (суммарное) белков
Выявление полисахаридов
Выявление и идентификация кислых мукополисахаридов
Комбинированные гистохимические методы (для полисахаридов и протеидов)
Окрашивание жиров и липидов, выявление железа
Гистохимия нервной системы
Гистохимия ферментов
Применение изотопов в гистологии
Приготовление пленчатых препаратов
Обработка биопсийного материала

Выявление полисахаридов (кислых и нейтральных)*
Полисахариды — высокомолекулярные сахара, встречаются в тканях организма как в чистом виде (гликоген), так и в соединении с другими веществами (мукополисахариды, мукопротеиды, гликопротеиды). Гликоген является резервом сахара в организме и содержится главным образом в печени и мышцах. Мукополисахариды — это полисахариды, содержащие в качестве одного из компонентов гексозамин. Они являются существенным компонентом слизеподобных веществ в организме, почему и получили свое название (лат. mucus — слизь).

*Кислые мукополисахариды теперь называют гликозаминогликанами, а нейтральные — гликопротеидами. Однако мы оставляем в тексте старые термины, так как они фигурируют в большинстве существующих методических руководств по гистохимии.

Мукополисахариды подразделяют на нейтральные и кислые. Последние распространены в животном организме очень широко (слизь эпителиев пищеварительного тракта и протоков большинства желез, основное вещество соединительной ткани и т. д.), их в свою очередь делят на простые (гиалуроновая кислота) и сложные (мукоитинсерная и хондроитинсерная кислоты; гепарин). Мукополисахариды, прочно связанные с белком, называют мукопротеидами и гликопротеидами. Они входят в состав слизеподобных веществ и секрета ряда желез.
Полисахариды и их комплексы — весьма лабильные соединения, чутко реагирующие на разнообразные сдвиги обменных процессов в организме.
Вещества полисахаридной природы играют важную роль в обеспечении нормальных физиологических процессов и занимают ведущее место в развитии ряда патологических процессов, особенно связанных с заболеванием соединительной ткани. Поэтому изучение динамики изменения содержания и распределения различных полисахаридных компонентов в организме имеет большое значение в исследовательской практике, а выявление и дифференцировка полисахаридов — одни из существенных разделов гистохимии.

Реакция — шифф-йодная кислота (ШИК-реакция)

В основе гистохимии веществ, содержащих полисахаридный компонент, лежит реакция шифф-йодная кислота (ШИК-реакция).
С помощью этой реакции можно выявить гликогены, мукопротеиды, гликопротеиды и гликолипиды.
Рабочие растворы
Реактив Шиффа (способ приготовления см. выше — с. 270).
Сернистая вода. К 200 мл дистиллированной воды добавить 4 мл концентрированной НС1. В 25 мл дистиллированной воды растворить 4 г безводного сульфита натрия. Оба раствора соединить.
Раствор перйодата. Растворить 1 г перйодата калия или 2,5 г перйодата натрия в 100 мл дистиллированной воды.
Метод
(фиксаторы Шабадаша, спирт, формалин, жидкость Карнуа, жидкость Ценкера; заливка в парафин, замороженные срезы).

  1. Срезы толщиной 5—7 мкм депарафинировать и довести до воды.
  2. Погрузить в раствор йодной кислоты на 5—10 мин или перйодата натрия либо калия на 20—30 мин.
  3. Тщательно промыть в двух—трех порциях дистиллированной воды (по 3—5 мин), чтобы удалить остаток йодной кислоты.
  4. Поместить в реактив Шиффа на 10—20 мин.
  5. Обработать в трех порциях свежеприготовленной сернистой воды (по 1—2 мин).
  6. Промыть в водопроводной воде в течение 10 мин, ополоснуть в дистиллированной.
  7. Обезводить, просветлить и заключить в бальзам (если нужно окрасить ядра, то после шестого этапа производят докрашивание срезов гематоксилином).

Результат. Вещество полисахаридной природы окрашено в пурпурно- или лилово-красный цвет. Нейтральные мукополисахариды бывают обычно пурпурно-красными, гликоген — более темный.
Примечание. Обработку реактивом Шиффа следует проводить в хорошо закрывающихся биологических стаканчиках, обернутых в черную бумагу. Одну порцию реактива можно применять многократно (до появления красноватой окраски).
Если на срезах появляются грязно-коричневые пятна, это свидетельствует о том, что окисляющий раствор не был полностью промыт перед обработкой срезов реактивом Шиффа.

Дифференцировка веществ, дающих ШИК-положительную реакцию

ШИК-положительную реакцию, помимо гликогена, дает группа веществ полисахаридной природы —гликолипиды, гликопротеиды, мукопротеиды, а также некоторые вещества, не содержащие углеводов: фосфолипиды, липопротеиды и некоторые липиды. Поэтому, для того чтобы определить, какое из веществ присутствует в исследуемых тканях в каждом конкретном случае, необходимо провести дополнительные реакции для уточнения ШИК-положительных веществ.
Расщепление гликогена. Применяют готовый препарат диастазу или фермент, содержащийся в слюне.
В первом случае к 0,1% 0,02М раствору диастазы в фосфатном буфере с pH 6,0 добавляют хлорид натрия (поваренная соль) до концентрации 0,8%, во втором собирают несколько кубиков слюны и отфильтровывают в стаканчик.
Метод. 1. После депарафинирования и доведения до воды один—два среза помещают в раствор диастазы (или слюны) и ставят в термостат при 37°С на 30—60 мин, остальные оставляют в воде.

  1. Промывают срезы в дистиллированной воде вместе с остальными срезами (необработанными ферментами) и подвергают ШИК-реакции по описанному методу.

Результат. 1. Отсутствие окраски в срезах, инкубированных в растворе, содержащем фермент (контрольные), свидетельствует о том, что ШИК-положительная реакция в остальных срезах обусловлена наличием в тканях гликогена; 2) если все срезы окрашены одинаково, это значит, что гликоген отсутствует и окраска обусловлена другими веществами, дающими ШИК-положительную реакцию; 3) если контрольные срезы окрашены менее интенсивно, чем остальные, следует считать, что часть ШИК-положительного материала составляет гликоген.
Реакция ацетилирования. Контрольные срезы обрабатывают в течение 1—24 ч при 21° С в смеси мл уксусного ангидрида и 24 мл сухого пиридина, промывают водой, обрабатывают в течение 1 ч в растворе гидроксида натрия (0,4 мл NaOH на 100 мл дистиллированной воды), промывают в воде и проводят ШИК-реакцию. Отрицательные результаты указывают на то, что первоначальная реакция была обусловлена присутствием углеводных веществ (1—2 гликолевые группы).

Экстракция липидов. Срезы выдерживают в тление 29 ч в смеси из разных частей хлороформа и метанола при 58°С. Если при ШИК-реакции окраска исчезает или уменьшается, то она была обусловлена липидными веществами.
Реакция — шифф-надуксусная кислота. Срезы, предварительно обработанные 1—2 ч в растворе надмуравьиной или надуксусной кислоты, затем окрашивают реактивом Шиффа. Наличие в них структур, окрашенных в красный цвет, указывает на содержание липидов с ненасыщенными связями (фосфолипиды или цереброзиды).
Обработка срезов трипсином. Если в предварительно обработанных трипсином срезах исчезает или уменьшается ШИК-положительная реакция, то она была обусловлена белковыми веществами.

Выявление гликогена кармином по методу Беста

 (фиксаторы — Буэна, Карнуа, спирт, формалин и пр.)
Рабочие растворы
Основной раствор кармина. Растворить в 60 мл дистиллированной воды 2 г кармина, 1 г карбоната калия и 5 г хлорида калия. Полученный раствор кипятить в течение 5 мин (не допуская бурного кипения), охладить и отфильтровать. Затем добавить к фильтрату 20 мл 28% раствора аммиака. Хранящийся в холодильнике при 0—4°С раствор годен в течение 3 мес.
Раствор кармина для окрашивания. Слить 8 мл основного раствора, 12,5 мл аммиака (плотность 0,880) и 24 мл метанола (раствор годен 1—2нед).
Раствор Беста для дифференцировки. К 8 мл абсолютного спирта добавить 4 мл метанола и 10 мл дистиллированной воды.
Метод окрашивания (парафиновые срезы)

  1. Довести срезы до абсолютного спирта.
  2. Поместить в 1% раствор целлоидина на 2—5 мин.
  3. Высушить на воздухе.
  4. Довести через спирты до воды.
  5. Окрасить гемалауном Эрлиха 5 мин.
  6. Ополоснуть в воде и отдифференцировать окраску ядер в 1% подкисленном спирте.
  7. Ополоснуть в дистиллированной воде.
  8. Поместить в карминовый раствор для окрашивания на 15—30 мин.
  9. Дифференцировать в растворе Беста (не ополаскивая предварительно в воде) от 5—10 с до нескольких минут, пока не перестанут отходить облачка красителя (если раствор быстро загрязнился, то сменить).
  10. Промыть в 80% спирте.
  11. Обезводить, осветлить и заключить в бальзам.

При окрашивании целлоидиновых срезов первые три этапа опускаются, так как они предназначены для обеспечения целлоидиновой защиты срезов.
Результат. Ядра темно-синие, гликоген ярко-красный.
Примечание. В связи с тем что в состав красителя входит аммиак, окраску следует производить в плотно закрывающихся сосудах. Контрольные срезы обрабатывают диастазой так же, как при ШИК-реакции.



 
« Осложнения аппендэктомии   Основы иммунологии »