Начало >> Статьи >> Архивы >> Основы гистологии

Гистохимия нервной системы - Основы гистологии

Оглавление
Основы гистологии
Краткий очерк истории гистологии
Цитология
Клетка
Цитоплазма
Ядро
Жизнедеятельность клетки
Деление клеток
Эпителиальная ткань
Соединительная ткань
Кровь
Рыхлая неоформленная соединительная ткань
Ретикулярная ткань
Плотная волокнистая соединительная ткань
Хрящевая ткань
Костная ткань
Мышечная ткань
Нервная ткань
Нервные волокна и окончания
Сердечно-сосудистая система
Органы кроветворения
Пищеварительная система
Железы
Кожа
Выделительная система
Органы дыхания
Нервная система, органы чувств
Половая система
Организация рабочего места лаборанта-гистолога
Техника изготовления гистологических препаратов
Взятие и этикетирование материала
Задачи и правила фиксации
Фиксирующие средства
Промывание, обезвоживание гистологического материала
Пропитывание и заливка гистологического материала
Подготовка тканей для электронно-микроскопического исследования
Микротомы и работа с ними
Микротом замораживающий, охлаждающий столик
Уход за микротомом, микротом-криостат
Микротомные ножи
Ультратом
Приготовление срезов из парафиновых блоков
Приготовление целлоидиновых срезов
Окрашивание и заключение срезов
Просветление и заключение срезов, заключение в смолы
Заключение в водные среды
Методы окрашивания препаратов
Приготовление и окрашивание мазка крови для подсчета лейкоцитарной формулы
Окрашивание ткани по методу ван-Гизона, Маллори
Окрашивание соединительной ткани азур эозином
Окрашивание эластических волокон методом Унны—Тенцера, резорцин-фуксином
Выявление аргирофильных волокон, элементов нервной системы
Импрегнация по методу Бильшовского-Грос
Выявление нервных элементов методом прижизненного окрашивания метиленовым синим
Импрегнация элементов макроглии
Безынъекционный метод изучения сосудов по В. В. Куприянову
Обработка и окрашивание костной ткани, декальцинация, окрашивание
Гистохимические методы
Выявление (суммарное) белков
Выявление полисахаридов
Выявление и идентификация кислых мукополисахаридов
Комбинированные гистохимические методы (для полисахаридов и протеидов)
Окрашивание жиров и липидов, выявление железа
Гистохимия нервной системы
Гистохимия ферментов
Применение изотопов в гистологии
Приготовление пленчатых препаратов
Обработка биопсийного материала

За последние годы в гистологических лабораториях широко применяются нейрогистохимические методы, которые в отличие от классических нейрогистологических методов дают возможность выявить функциональную характеристику элементов различных отделов нервной системы. Наиболее распространенные и доступные из них — это методы определения холинергических и адренергических компонентов.

Метод выявления адренергических компонентов нервной системы

 (метод Фалька — Хилларпа без лиофилизации)*
Метод основан на способности катехоламинов флюоресцировать после обработки парами параформальдегида в проходящем ультрафиолетовом луче. В результате структуры, содержащие катехоламины, светятся желто-зеленым светом. Следует отметить, что данный метод является специфичным не только для нервной системы, но и для других тканей организма, содержащих катехоламины (мозговое вещество надпочечников и др.).

* Данный метод пригоден для выявления адренергических нервных волокон во всех органах, за исключением головного мозга и печени; для работы с этими тканями необходимо после замораживания применение лиофильной сушки кусочков и пропитывание парафином в вакууме.

Приготовление параформальдегида определенной влажности. В зависимости от требуемой влажности параформальдегида на дно эксикатора наливают серную кислоту определенной концентрации. Параформальдегид, находящийся в чашке, выдерживают в эксикаторе на подставке в течение 7—10 дней.
Схема получения параформальдегида определенной влажности


H2SO4, %

Параформальдегид, %

30

40

60

50

50

60

40

70

30

Для большинства органов рекомендуется параформальдегид 60% влажности.
Метод. 1. Кусочки исследуемого органа замораживают сухим льдом.

2. В криостате приготавливают срезы толщиной 15—30 мкм (в зависимости от органа), которые переносят на стекла и высушивают в потоке теплого воздуха в течение 5—7 мин.

3.        Устанавливают стекла в штатив и помещают в стеклянный сосуд объемом 1 л, на дно которого насыпают 5—6 г параформальдегида, имеющего соответствующую влажность, после чего сосуд плотно закрывают и ставят в термостат с температурой +80°С на 60 мин. Срезы извлекают и заключают в жидкий парафин (вазелиновое масло) и исследуют в люминесцентном микроскопе с использованием светофильтров СЗС-14-4, ФС-14, ФС-1-2 и запирающего светофильтра ЖС-18 (до и после просмотра стекла обязательно должны храниться в темноте во избежание угасания флюоресценции).
Для проведения контроля реакции на специфичность часть стекол со срезами нагревают в термостате в стеклянном цилиндре без параформальдегида в тех же условиях.

Метод выявления холинергических компонентов нервной системы (метод Карновского)

В отличие от предыдущего метода, основанного на прямом выявлении катехоламинов в тканях, данный метод базируется на выявлении активности фермента ацетилхолинэстеразы, который катализирует процесс расщепления нейромедиатора ацетилхолина в месте его локализации (нейроцит и его отростки). Выявление структур происходит в результате выпадения окрашенного продукта реакции фермент- субстрат.
Приготовление инкубационной среды
Для приготовления инкубационной среды применяют следующие растворы.

  1. а) 0,2М NaOH : 0,8 г NaOH + 100 мл Н2 О. б) 0,2М NaH-малеиновая соль (раствор):

2,32 г малеиновой кислоты + 60,0 мл Н2 О + 0,8 г NaOH и доведение до 100 мл.
Из двух растворов приготавливают первый рабочий раствор: 26,9 мл 0,2М ОН+50,0мл 0,2М NaH-малеиновая соль + Н2О до 200 мл.

  1. Цитрат натрия 0,1М : 2,59 г Na3C6H5О7 + 100 мл Н2О.
  2. C11SO4 . 6Н2 О : 0,375 г C11SO4 + 50,0 мл Н2О.
  3. Красная кровяная соль: 0,083 г K3Fe(CN)6 + 50,0 мл Н2О.

Инкубационную среду готовят перед употреблением, смешивают в указанной ниже последовательности и хорошо встряхивают.
Ацетилтиохолинйодида                                                       10 мг
Кислого малеиновокислого Na                     0,2 М (pH 6,05) 13 мл
Цитрата натрия 0,1 М                                                          1 мл
CuSО4 30 М                                                                       2 мл
Дистиллированной воды                                                      2 мл
K3Fe(CN)6 5 М                                                                    2 мл
В контроле вместо ацетилтиохолинйодида применяют бутирилтиохолинйодид и той же концентрации.
Метод. 1. Кусочки исследуемого органа (размер 3x3 мм) фиксировать в течение 2,5—3,5 ч при температуре + 2— + 4°С в 4% растворе формалина, забуференного до pH 7,6 при помощи 0,075М фосфатного буфера, содержащего 0,044 М сахарозу.

  1. Промокнуть и поместить в 0,044 М сахарозу при температуре + 2— + 4°С на 15—16 ч, после чего вновь промокнуть и быстро заморозить сухим льдом.
  2. Нарезать срезы в криостате (толщиной 1—30мкм), перенести на стекла, подсушить на воздухе и поместить в инкубационную среду на 60 мин (при температуре +37°С).
  3. Перенести стекла со срезами в стаканчик с 10% формалином, приготовленным на изотоническом растворе хлорида натрия, на 10 мин.
  4. Ополоснуть в двух порциях дистиллированной воды, подкрасить кармином и заключить, как обычно, в канадский бальзам.

Результат. Холинергические компоненты, цитоплазма нейроцитов и нервные волокна окрашиваются в коричневый цвет, интенсивность которого прямо пропорциональна активности фермента.



 
« Осложнения аппендэктомии   Основы иммунологии »