Начало >> Статьи >> Архивы >> Основы гистологии

Применение изотопов в гистологии - Основы гистологии

Оглавление
Основы гистологии
Краткий очерк истории гистологии
Цитология
Клетка
Цитоплазма
Ядро
Жизнедеятельность клетки
Деление клеток
Эпителиальная ткань
Соединительная ткань
Кровь
Рыхлая неоформленная соединительная ткань
Ретикулярная ткань
Плотная волокнистая соединительная ткань
Хрящевая ткань
Костная ткань
Мышечная ткань
Нервная ткань
Нервные волокна и окончания
Сердечно-сосудистая система
Органы кроветворения
Пищеварительная система
Железы
Кожа
Выделительная система
Органы дыхания
Нервная система, органы чувств
Половая система
Организация рабочего места лаборанта-гистолога
Техника изготовления гистологических препаратов
Взятие и этикетирование материала
Задачи и правила фиксации
Фиксирующие средства
Промывание, обезвоживание гистологического материала
Пропитывание и заливка гистологического материала
Подготовка тканей для электронно-микроскопического исследования
Микротомы и работа с ними
Микротом замораживающий, охлаждающий столик
Уход за микротомом, микротом-криостат
Микротомные ножи
Ультратом
Приготовление срезов из парафиновых блоков
Приготовление целлоидиновых срезов
Окрашивание и заключение срезов
Просветление и заключение срезов, заключение в смолы
Заключение в водные среды
Методы окрашивания препаратов
Приготовление и окрашивание мазка крови для подсчета лейкоцитарной формулы
Окрашивание ткани по методу ван-Гизона, Маллори
Окрашивание соединительной ткани азур эозином
Окрашивание эластических волокон методом Унны—Тенцера, резорцин-фуксином
Выявление аргирофильных волокон, элементов нервной системы
Импрегнация по методу Бильшовского-Грос
Выявление нервных элементов методом прижизненного окрашивания метиленовым синим
Импрегнация элементов макроглии
Безынъекционный метод изучения сосудов по В. В. Куприянову
Обработка и окрашивание костной ткани, декальцинация, окрашивание
Гистохимические методы
Выявление (суммарное) белков
Выявление полисахаридов
Выявление и идентификация кислых мукополисахаридов
Комбинированные гистохимические методы (для полисахаридов и протеидов)
Окрашивание жиров и липидов, выявление железа
Гистохимия нервной системы
Гистохимия ферментов
Применение изотопов в гистологии
Приготовление пленчатых препаратов
Обработка биопсийного материала

Метод авторадиографии

В отличие от гистохимии, которая позволяет определять лишь локализацию и концентрацию химических веществ в структуре, авторадиография, кроме того, позволяет изучать распределение различных веществ в клетках, тканях и органах всего организма, пути и механизмы их поступления и выделения из него и др. В основе авторадиографии (как светооптической, так и электронно-микроскопической) лежит процесс, аналогичный фотографическому, с тем лишь отличием, что «засвечивающим» фактором при авторадиографии является не свет, а ионизирующее излучение, испускаемое при распаде ядер радиоактивных атомов, введенных в организм в форме тех или иных соединений. Вместо же фотографической пластинки (пленки) используется специальная эмульсия, которой покрывают гистологические среды (а также мазки, отпечатки органов и т. д.) с целью обеспечения наиболее тесного контакта ее с исследуемыми структурами. После экспозиции, достаточной для того, чтобы кристаллы бромида серебра (входящие в состав эмульсии), находящиеся в непосредственной близости от места локализации радиоактивного изотопа, превратились в зерна металлического серебра, срезы проявляют, окрашивают, обезвоживают и заключают в бальзам. При микроскопировании автографов места локализации радиоактивных атомов выявляются в виде черных зерен. По количеству зерен можно судить (до некоторой степени) о количестве сконцентрированной в данной области радиометки.
Приводим использование метода авторадиографии для исследования процесса биосинтеза ДНК при митотическом делении клеток эпителия тонкой кишки у крысы.

  1. Крысе внутрибрюшинно вводят Н-тимидин (один из компонентов молекулы ДНК) из расчета 1 мк Ки на 1 г массы тела и забивают через 1—12 ч.
  2. Фрагмент тонкой кишки фиксируют (чаще всего в 10% формалине или жидкости Карнуа), обезвоживают и заливают в парафин.
  3. Приготавливают гистолические срезы толщиной
  4. 7 мкм.
  5. Депарафинируют в двух-трех сменах ксилола (толуола) по 1—2 мин.
  6. Высушенные срезы покрывают эмульсией при температуре 42°С (в фотокомнате при темно-красном фонаре).
  7. Укладывают в светонепроницаемую коробку и выдерживают в холодильнике 14—30 сут.
  8. Проявляет в амидоловом проявителе.
  9. Ополаскивают дистиллированной водой.
  10. Погружают в «стоп-раствор» (1% раствор уксусной кислоты) на 0,5—1 мин.
  11. Фиксируют в 30—40% растворе тиосульфата натрия 1 мин.
  12. Промывают проточной водой 20—30 мин.
  13. Высушивают на воздухе.
  14. Окрашивают гематоксилин-эозином (как обычно).
  15. Обезвоживают в спиртах восходящей концентрации.
  16. Просветляют и заключают в бальзам.

Метод иммунофлюоресценции

Иммунофлюоресцентный метод — единственный в своем роде морфологический метод, позволяющий исследовать топографию в клетках и тканях сложных биологических веществ (эндогенного или экзогенного происхождения), наделенных индивидуально специфической структурой (белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты и др.). Сущность данного метода сводится к следующему. Веществом, идентичным тому, локализацию которого в исследуемом объекте (ткани, клетки) хотят изучить, иммунизируют другое животное и через определенное время (достаточное для выработки антител) из его крови получают антисыворотку. Антитела, содержащиеся в у-глобулиновой фракции антисыворотки, химическим путем соединяют с флюорохромом (особым соединением, способным давать яркое свечение — флюоресценцию — под действием ультрафиолетовых лучей). На гистологические срезы свежезамороженных или фиксированных органов (тканей) наносят каплю конъюгата — антисыворотки, соединенной с флюорохромом, и после 20—30-минутной экспозиции отмывают изотоническим раствором хлорида натрия несвязавшиеся флюоресцирующие антитела. Препарат заключают в забуференный глицерин или полистирол. Наблюдение проводят с помощью люминесцентного микроскопа в ультрафиолетовой части спектра. Вещества, с которыми специфически прореагировали антитела, выявляют по флюоресценции связанного с последними флюорохрома.
Наряду с описанным выше вариантом данного метода, получившим название прямой иммунофлюоресценции, была разработана другая его разновидность — непрямая иммунофлюоресценция, характеризующаяся, как правило, более высокой специфичностью по отношению к выявляемому субстрату. Метод непрямой иммунофлюоресценции отличается от прямого метода тем, что часть полученных после первой иммунизации антител (А-1) используют для иммунизации второго животного, в результате чего получают антисыворотку, содержащую антитела (А-2) к А-1. А-2 комплексируют с флюорохромом. На срезы наносят антисыворотку, содержащую А-1, и после отмывки антител, несвязавшихся с искомым веществом, антисыворотку, содержащую А-2 (флюоресцирующие). А-2 реагируют с А-1 и таким образом «фиксируются» в местах локализации исследуемого вещества.
Электронно-микроскопические варианты иммунофлюоресцентного метода имеют некоторые особенности. В одних случаях к антителам иммунной антисыворотки присоединяют какой-либо электронно-микроскопический агент (например, атом тяжелого металла), в других — соединение (группу), включающее в себя радиоактивный атом. В последнем случае для выявления локализации комплекса антиген—антитело необходимо проведение дополнительной авторадиографии.
Метод иммунофлюоресценции характеризуется большой чувствительностью. и позволяет обнаруживать вещества, присутствующие в клетках и тканях органа в очень низких концентрациях.



 
« Осложнения аппендэктомии   Основы иммунологии »