Начало >> Статьи >> Архивы >> Полимеры медицинского назначения

Применение спектроскопических методов анализа - биоматериаловедение - Полимеры медицинского назначения

Оглавление
Полимеры медицинского назначения
Исследование в области полимерных материалов
Перспективный план разработки искусственных органов
О проблематике в области полимеров медицинского назначения
Искусственная кожа
Контактные линзы
Мембраны для искусственных легких
Искусственная почка
Мембраны для диализа крови
Возможности новых мембран для диализа крови
Искусственные почки других разновидностей и модификаций
Разделение и диффузия веществ, заключение
Полимеры, совместимые с живым организмом
Вредное действие полимеров на организм
Многозначность и многообразие понятия биосовместимости
Способы оценки биосовместимости
Естественный механизм свертывания крови и тромбообразования
Растворение фибрина и предотвращение свертывания крови
Способы оценки тромборезистентности
Получение антитромбогенных полимерных материалов
Гидрогели
Введение гепарина в полимерный материал
Фиксация системы растворения фибрина
Феномен поверхностей и гемосовместимость
Взаимодействие полимера с составляющими крови
Адгезия, когезия и элиминирование тромбоцитов
Заключение по полимерам, совместимым с живым организмом
Полимеры фармакологического назначения
Полимеризация лекарственных веществ
Полимеры вспомогательного фармакологического назначения
Полимерные покрытия
Использование полимеров в виде жидких субстанций, вводимых в организм
Система пролонгированного введения лекарств
Микрокапсулирование
Практические примеры микроинкапсулирования
Ликвация лекарственного вещества из микрокапсулы
Разработка медицинских полимеров и биоматериаловедение
Подход к биосовместимости полимера
Электрические явления на поверхности полимера - биосовместимость
Применение спектроскопических методов анализа - биоматериаловедение
Способ кругового дихроизма - биоматериаловедение
Микрокалориметрия - биоматериаловедение
Электрофорез - биоматериаловедение
Гистологическая и гистохимическая микроскопия
Использованиее ферментативных реакций и радиоактивных изотопов - биоматериаловедение
Заключение - биоматериаловедение

Среди способов инструментального анализа, использующих физико-химические методы [26], спектроскопии принадлежит особо важная роль. В сфере биохимии, включая клинический анализ, широко применяются ИК и УФ спектроскопия, исследование видимого спектра, флюорографический анализ, лазерная Раман-спектроскопия, дисперсионно-вращательная спектроскопия, круговой дихроизм, ЯМР-спектроскопия, электронно-спиновый резонанс и другие методы спектроскопического анализа. Все они успешно практикуются в области микроколичественного, качественного и структурного определения различных высокомолекулярных веществ типа белков и нуклеиновых кислот в растворах и в других агрегатных состояниях.

ИК спектроскопия отражения

Общие принципы, методы и назначения ИК спектроскопии достаточно хорошо известны, и автор отсылает читателя к специальной литературе по этому вопросу [26, 27, 28].

схема ИК спектроскопии
Рис 71. Принципиальная схема ИК спектроскопии методом отражения (ATR). А — среда с высоким коэффициентом преломления (призма ATR); Б — образец (полимерная пленка).
Рис. 72. Схема держателя призмы ИК спектрографа, действующего по способу ATR.
1 — поддерживающая пластина; 2 — уплотнительная прокладка; 3 — образец в виде пленки; 4 — регулировочный винт; 5 — фиксирующий винт.
Здесь же  целесообразно коснуться лишь некоторых частных аспектов способа отражательной спектроскопии (ATR). Принцип его реализации характеризуется схемой на рис. 71; рабочая часть спектрографа, действующего по принципу ATR, показана на рис. 72.
Призму для создания отражения обычно выполняют из материала, который в области измеряемых длин волн прозрачен и обладает более высоким коэффициентом преломления (п), чем исследуемый полимер. Такой материал (KRS) состоит из смеси кристаллов T1I—Т1Вг (в области 4 мкм, п = 2,38), AgCl (лг = 2,00), Ge (лг = 4,10) и некоторых других компонентов. Отражательную призму плотно зажимают между поверхностями исследуемых образцов в виде полимерных пленок; если угол падения луча превышает критическое значение, т. е. 0С = = sin_1, создается полное отражение. Определение поглощения отраженного луча позволяет получить ИК спектр поверхностной части образца (на глубину того же порядка, что и длина волны падающего луча). Таким образом, используя специфическую особенность отражательной спектроскопии, можно определить вещества, нанесенные на поверхность исследуемого полимера, в частности адсорбированные на ней белки.
Lyman и сотр. [29] применяли отражательную ИК спектроскопию для количественного определения адсорбции белка плазмы на пленках различных полимеров. Методика диктовалась необходимостью предотвратить соприкосновение пленки образца с поверхностью раздела газовой и жидкостной фаз. Сначала образец пленки вымачивали в дистиллированной воде, затем прибавляли туда раствор белка и выдерживали 2 ч при 37 °С, после чего промывали дистиллированной водой и  оставляли стоять на ночь при температуре 50 °С, либо сушили при замораживании. Только после такой обработки образцы подвергали ИК спектроскопии методом ATR. Концентрацию белка (мкг/см2), адсорбированного на поверхности образца, количественно определяли по экстинкции характеристической полосы поглощения (при 1640 см-1) амид I, т. е. полосы, характерной для белков. В качестве стандарта при измерениях использовали экстинкции характеристических полос различных образцов (например, полидиметилсилоксана и полиэтилена, находящиеся соответственно при 1410 и 1460 см-1). Спектральные контуры, полученные по такой методике, представлены на рис. 73.
Таким образом была найдена корреляция между концентрацией раствора белка и адсорбцией последнего на поверхности полимерного материала. Она описывается адсорбционной изотермой, приведенной на рис. 74. Из кривой можно определить равновесную концентрацию белка, адсорбированного на поверхности высокомолекулярного вещества. Беря за основу полученный параметр, можно вычислить толщину слоя адсорбированного белка, среднюю площадь адсорбции, приходящуюся на каждую молекулу белка, и другие характеристики. Результаты таких расчетов при 37 °С представлены в табл. 43.
Lyman и сотр. [29] рассматривали табличные данные в сочетании с параметрами, описывающими размеры и конфигурацию молекул белков плазмы. Эти параметры были определены еще в 40-х годах Oncley [30]; они показаны в табл. 44.
Наблюдения Lyman можно свести к следующим основным положениям:

  1. адсорбция белков к гидрофобному полимеру завершается прежде всего в мономолекулярном слое;

  1. адсорбция протекает не по боковым (side-on), а по концевым (end-on) группам;

Рис. 73. Спектр ИК поглощения альбумина (плазмы крови человека), адсорбированного на поверхности полиэтиленовой пленки [29] (методом ATR).

  1. — полиэтилен до контакта;
  2. — после контакта с раствором белка.


Рис. 74. Адсорбция у-глобулина на поверхности полистирольной пленки (при 37 °С).

  1. по всем признакам, конформация адсорбированного белка не претерпевает значительных денатурационных изменений. Все сказанное можно резюмировать в том смысле, что в процессе тромбообразования роль денатурационных изменений белка весьма невелика.

Таблица 43. Адсорбция белка плазмы крови на поверхности некоторых полимерных материалов (при 37 °С)

Таблица 44. Размеры и конфигурация молекул белков плазмы крови [30]


Белок (молекулярная масса)

Короткая ось, нм

Площадь сечения по концевым группам, нм2

Длинная ось, нм

Площадь сечения по боковым группам, нм2

Альбумин (69 000)

4,0

17,00

11,5

46,00

Y-Глобулин (156 000)

4,4

20,00

23,5

103,00

Фибриноген (400 000)

6,5

42,00

47,5

130,00 — 300,00

Значительный интерес представляет работа Lee и Kim, которые использовали ИК спектроскопию по способу ATR для исследования корреляции между адсорбцией белка полимером и скоростью потока крови [31]. Построенные ими кривые адсорбции альбумина на поверхности сегментированного полиуретана (сополимер эфира с уретаном и мочевиной) в разных кинетических условиях показаны на рис. 75. Из этих кривых следует, что чем выше скорость потока крови, тем труднее достигается состояние равновесной сорбции, иными словами, чем быстрее протекает кровь, тем медленнее идет адсорбция белка на поверхности полимера. Таким образом, по отношению к адсорбции белка и тромбообразованию роль скорости потока крови исключительно велика.
Все сказанное позволяет утверждать, что для общих качественных исследований в области адсорбции белка медицинскими полимерами ИК спектроскопия по способу ATR вполне приемлема. Это подтверждается спектрами, продемонстрированными в 1976 г. на VI симпозиуме по использованию полимеров в медицине [32]; они приведены на рис. 76. Вместе с тем существует ряд проблем и трудностей в этом направлении, которые еще требуют своего разрешения. К ним относятся следующие вопросы.

  1. По характеристическим полосам полипептидов можно идентифицировать их строение (табл. 45). Вместе с тем результаты ИК спектроскопии ATR, строго говоря, не совпадают или, во всяком случае, не полностью согласуются с положением и конфигурацией полос поглощения в спектре пропускания. Кроме того, практически невозможно четко отнести и детально разделить полосу амид I, поэтому крайне затруднительно, используя способ ATR, дифференцировать различные составляющие белков с удовлетворительной степенью разрешения. Наконец, в низкочастотной области спектра (например, в области амида V) длина ИК волн возрастает, и применение способа ATR становится невозможным.

1 — ненаполненный силиконовый каучук; 2 — полифторвинилиден; 3 — полиэтилен; 4 — блоксополимер полиметилметакрилата с поливинил ацетатом; 5 — купрофан; 6 — полиэтилентерефталат.

Рис. 76. ИК спектры некоторых полимеров, характеризующие адсобрцию белка
при контакте их с кровью (снято методом ATR).

Рис. 75. Зависимость адсорбции альбумина на поверхности сегментированного полиуретана от скорости потока крови [31].
1 — 0 мл/с; 2 — 3 мл/с; 3 — 6 мл/с; 4 — 9 мл/с; 5—12 мл/с.
Прерывистые кривые — до контакта с кровью, сплошные — после контакта.
Рис. 77. ИК спектры образцов нейлона 6, снятые методом ATR.

А — образец; Б, В — после контакта с кровью; Б — через 1 ч, В — через 24 ч.
Таким образом, для тонких структурных исследований и идентификации этот способ при самостоятельном использовании непригоден.

  1. В зависимости от плотности соприкосновения и степени сжатия образца и призмы возникают микроотклонения в уровне экстинкции, поэтому количественные определения белков способом ATR крайне затруднительны.
  2. Полосы поглощения 3600—2500 см-1, 1700—1400 см-1 и 900—500 см-1, относимые к воде, накладываются на полосы амидов, ввиду чего при измерениях необходимо элиминировать воду. В этой связи сообщалось, что разработанная недавно установка для преобразований Фурье позволяет решить данную проблему.
  3. Операции по удалению воды (обычной сушкой или сушкой с замораживанием) чреваты опасностью денатурации адсорбированного белка.
  4. Когда в качестве образца используется полимер, содержащий, подобно нейлону, амидные группы, ИК спектроскопия способом ATR невозможна из-за интерференции характеристических полос поглощения (см. спектры на рис. 77).

УФ спектроскопия

Для количественного анализа белков способом УФ спектроскопии используются следующие ключевые полосы: а) поглощение в области 250—313 нм с пиком поглощения при 280 нм; оно обусловлено остатками ароматических аминокислот, например, триптофана, тирозина или фенилаланина;
б)   полоса поглощения в области 225—215 нм, относимая к
пептидной связи (—CONH—);
в)   полоса в области 194—191 нм, которую относят, как и пре
дыдущую, к пептидной связи.
Nyilas с сотр. [33] вводили в раствор гамма-булина стеклянный микропорошок, представляющий собой смесь сферолитов диаметром 12,5—40,5 мкм с зернами крупности порядка мкм и ниже. Далее определяли на мониторе (по экстинкции 278 нм) концентрацию белка в верхней, прозрачной части жидкости и по уменьшению концентрации интерполировали адсорбцию белка. Получили адсорбционную изотерму, по которой было вычислено, что количество у-глобулина, адсорбируемого на поверхности стекла в виде мономолекулярного слоя, измеряется величиной порядка 0,12 мкг/см2, а усредненная площадь адсорбционной поверхности, приходящаяся на каждую макромолекулу белка, достигает 2180 нм. Очевидно (и это подтверждается табл. 44), что данная площадь больше той, которая была бы занята при адсорбции по концевым (схема end-on) или по боковым (схема side-on) группам. По всем предпосылкам, далеко не исключена возможность того, что в результате адсорбции конформация глобулина претерпевает изменения. Следует отметить, что такой вывод не полностью совпадает с заключениями, сделанными Lyman на основании результатов ИК спектроскопии ATR. Требуются дальнейшие углубленные исследования в этом направлении, чтобы однозначно ответить на подобный вопрос.



 
« Пограничная интеллектуальная недостаточность   Полиурия и полидипсия »