Начало >> Статьи >> Архивы >> Ротавирусный гастроэнтерит

Обнаружение и исследование частиц ротавируса под электронным микроскопом - Ротавирусный гастроэнтерит

Оглавление
Ротавирусный гастроэнтерит
Этиология
Физико-химические свойства ротавирусов
Культивирование ротавирусов человека
Таксономия ротавирусов
Антигенные взаимоотношения в группе ротавирусов
Эпидемиология
Патологическая анатомия
Патогенез
Иммунитет
Клиника
Клиника - боли в животе, температура, интоксикация
Исследование слизистых оболочек, лимфатических узлов
Исследование пищеварительной функции
Функциональное состояние других органов кровообращения, дыхания
Клиническое течение при эпидемической вспышке
Клиническое течение спорадических случаев
Лабораторные исследования
Обнаружение и исследование частиц ротавируса под электронным микроскопом
Иммуноэлектронно-микроскопическое исследование частиц ротавируса
Выделение и изучение ротавируса в культурах ткани
Реакция связывания комплемента
Метод иммунофлюоресценции
Реакция иммунопреципитации с окрашиванием преципитатов
Иммунодиффузия
Иммуноэлектроосмофорез
Методы радиоиммунологического исследования
Методы иммуноферментативного исследования
Сравнительная оценка различных методов обнаружения ротавируса
Методы обнаружения и изучения иммунологических сдвигов
Реакция связывания комплемента
Реакция нейтрализации вируса
Реакция подавления гемагглютинации
Иммунофлюоресценция
Методы серологического исследования
Диагноз
Лечение
Профилактика
Список литературы

Обнаружение и исследование частиц ротавируса под электронным микроскопом в суспензии фекалий без дополнительной концентрации

В пробах фекалий, взятых в первые дни заболевания, содержание вируса нередко достигает очень высоких уровней и составляет десятки и сотни миллионов, а иногда даже десятки и сотни миллиардов частиц в 1 г. При таких концентрациях ротавирус может быть обнаружен под электронным микроскопом в 10—20% суспензии фекалий без ее дополнительной обработки. Несколько капель надосадочной жидкости после обычного центрифугирования суспензии контрастируют 2% раствором фосфорновольфрамовой кислоты при pH 6,5 и наносят на предметные электронно-микроскопические сетки. Исследование препаратов проводят в электронном микроскопе при инструментальном увеличении 50 000. При обнаружении частиц их принадлежность к ротавирусам устанавливают по размерам, морфологии и агрегации под влиянием специфической иммунной сыворотки. Основы дифференцирования ротавируса от других вирусов, которые могут быть обнаружены в суспензии фекалий, и описание иммуно-электронно-микроскопических исследований приведены в последующих разделах данной главы.
Обследование необработанной надосадочной жидкости суспензии фекалий под электронным микроскопом для обнаружения ротавируса используют редко, так как результаты такого обследования имеют сугубо ориентировочный характер и требуют подтверждения другими методами. Более обоснованные результаты получают при изучении под электронным микроскопом материалов надосадочной жидкости фекальной суспензии после дополнительной обработки, в результате которой достигается определенная степень очистки и концентрации вирусных частиц. Некоторым преимуществом исследования ротавируса в надосадочной жидкости фекальной суспензии без ее дополнительной обработки является возможность изучения частиц, не подвергавшихся механическим воздействиям многократного скоростного центрифугирования, необходимого для очистки и концентрации вирусных препаратов.

Обнаружение и исследование частиц ротавируса под электронным микроскопом в суспензии фекалий после дополнительной концентрации

Очистка и концентрация ротавируса в препаратах фекальных суспензий позволяет выявлять вирусные частицы даже при сравнительно невысоком их содержании в фекалиях, а дополнительная обработка препаратов иммунной сывороткой предоставляет возможности для идентификации вируса. R. Bishop, G. Davidson и соавт. (1974) использовали следующий метол очистки и концентрации ротавируса в фекальном материале. Фекалии (1—5 г) тщательно смешивали с 10 мл дистиллированной воды. К полученной суспензии добавляли 10 мл трифтортрихлорэтана и гомогенизировали в течение 10 мин. Гомогенат центрифугировали 30 мин при 10 000 g и при 4°С.
К полученной жидкости добавляли 8% полиэтиленгликоля, выдерживали в течение ночи при 4°С и центрифугировали 30 мин при 4000 g. Полученный осадок ресуспендировали в 2 мл дистиллированной воды, наслаивали в центрифужной пробирке на 3 мл 45% сахарозы в 0,002 М растворе трис(гидроксиметил) аминометана (pH 7,0) и центрифугировали 150 мин при 100000 g. Этот режим центрифугирования рассчитан на осаждение ротавирусных частиц и задержку в надосадочной жидкости более мелких энтеровирусов или сходных с ними по размерам других вирусных агентов. Полученный осадок суспендировали в 2—5 каплях дистиллированной, воды, подвергали негативному окрашиванию фосфорновольфрамовокислым калием при pH 7,0 и исследовали под электронным микроскопом при инструментальном увеличении 30000.
Более простой метод обработки фекалий был использован Т. Flewett, A. Bryden и Н. Davies (1973): 20% суспензию фекалий в фосфатно-буферном солевом растворе центрифугировали 30 мин при 7000 об/мин для осаждения бактерий и грубых частиц суспензии. Надосадочную жидкость дополнительно центрифугировали 1 ч при 50 000 об/мин и полученный осадок ресуспендировали в 0,2 мл дистиллированной воды. Суспензию наносили на предметные сетки и окрашивали 2% фосфорновольфрамовокислым калием. Исследуя такие препараты, Т. Flewett, A. Bryden и Н. Davies обнаружили частицы ротавируса в 14 из 32 проб фекалий детей до 5-летнего возраста, больных гастроэнтеритом, провели изучение структуры частиц и показали наличие у них двух капсидов.
В Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР М. Б. Королевым и А. Г. Анджапаридзе разработана еще более простая методика обработки суспензии фекалий для очистки и концентрации ротавируса, позволяющая эффективно выявлять вирусные частицы при электронной микроскопии. Суспензию фекалий (10%) после центрифугирования в течение 1 ч при 3000 об/мин и удаления осадка дополнительно центрифугируют 90 мин при 15 000 об/мин. Полученный осадок ресуспендируют в нескольких каплях дистиллированной воды, подвергают негативному окрашиванию 2% раствором фосфорновольфрамовой кислоты при pH 6,5, помещают на предметные сетки и исследуют под электронным микроскопом.

Частицы ротавируса, обнаруживаемые при электронно-микроскопическом исследовании фекальных препаратов, имеют правильную сферическую форму. Диаметр частиц зависит от наличия одной или двух капсидных оболочек. В препаратах фекалий больных гастроэнтеритом обнаруживаются как двухкапсидные частицы диаметром 70—75 нм, так и однокапсидные частицы диаметром около 60 нм. Соотношение обеих форм в различных исследуемых образцах может варьировать. Поверхностная оболочка однокапсидных частиц построена из полых морфологических единиц. Двухкапсидные частицы окружены тонкой мембраной, связанной с внутренним капсидом короткими капсомерами, что придает этим частицам подобие колеса. В препаратах фекалий, кроме типичных «полных» частиц,, встречаются также «пустые» частицы, лишенные сердцевины и состоящие лишь из капсидного слоя (см. рис. 1 и 2).
По размерам и морфологическим особенностям частиц ротавирус достаточно хорошо дифференцируется от ряда вирусов, и вирусоподобных образований, которые могут встречаться в фекальном материале. В образцах фекалий часто обнаруживаются разнообразные сферические частицы диаметром 24— 32 нм. Большинство из них относится к тем пли иным энтеровирусам. Более мелкие сферические частицы диаметром 20— 22 нм представляют собой парвовирусы.
Среди изометрических частиц, обладающих характерной морфологией, наиболее часто встречаются астровирусы, которые нередко образуют рыхлые скопления. Приблизительно у 10—20% частиц астровирусов выявляется четко выраженная пяти- или шестилучевая звездчатообразная структура. Диаметр астровирусов около 28 нм.
Калицивирусы достаточно легко дифференцируются от астровирусов по большим размерам (30—35 нм) и характерной шестилучевой структуре с плотным пятном в центре и шестью такими же пятнами по периферии. Типичные по морфологии частицы астровирусов и калицивирусов в препаратах фекальной суспензии под электронным микроскопом показаны на рис. 14.
Аденовирусы выявляются по характерной икосаэдрической структуре капсида и относительно крупным размерам вирионов, имеющих диаметр около 70—90 нм.
В фекалиях отдельных больных гастроэнтеритом обнаруживаются характерные частицы диаметром около 100—120 нм с регулярно расположенными отростками длиной 20—28 нм, относящиеся к коронавирусам.
В препаратах фекального материала постоянно присутствуют разнообразные по форме и размерам мембранные частицы, часть из которых характеризуется наличием бахромчатой поверхности. Многие из подобных частиц представляют собой фрагменты щеточной каемки (микроворсинчатого слоя) кишечного эпителия.

Морфология вирионов астровирусов и калицивирусов человека
Рис. 14. Морфология вирионов астровирусов и калицивирусов человека. Негативно контрастированные препараты фекальной суспензии. Электронная микроскопия. У в. 50 000.
А — астровирусы. В препарате выявляется характерная пяти- или шестилучевая звездообразная структура частиц; Г- — калицивирусы. Четко выявлена типичная шестилучевая структура частиц с плотным пятном в центре, которое придает нм чашеобразный вид.

Очень часто в фекалиях обнаруживаются также частицы бактериофагов, их головки или отростки, а также бактериальные жгутики.



 
« Роль опорно-двигательного аппарата в сохранении работоспособности   Руководство к практическим занятиям по общей гигиене »