Начало >> Статьи >> Архивы >> Ротавирусный гастроэнтерит

Метод иммунофлюоресценции - Ротавирусный гастроэнтерит

Оглавление
Ротавирусный гастроэнтерит
Этиология
Физико-химические свойства ротавирусов
Культивирование ротавирусов человека
Таксономия ротавирусов
Антигенные взаимоотношения в группе ротавирусов
Эпидемиология
Патологическая анатомия
Патогенез
Иммунитет
Клиника
Клиника - боли в животе, температура, интоксикация
Исследование слизистых оболочек, лимфатических узлов
Исследование пищеварительной функции
Функциональное состояние других органов кровообращения, дыхания
Клиническое течение при эпидемической вспышке
Клиническое течение спорадических случаев
Лабораторные исследования
Обнаружение и исследование частиц ротавируса под электронным микроскопом
Иммуноэлектронно-микроскопическое исследование частиц ротавируса
Выделение и изучение ротавируса в культурах ткани
Реакция связывания комплемента
Метод иммунофлюоресценции
Реакция иммунопреципитации с окрашиванием преципитатов
Иммунодиффузия
Иммуноэлектроосмофорез
Методы радиоиммунологического исследования
Методы иммуноферментативного исследования
Сравнительная оценка различных методов обнаружения ротавируса
Методы обнаружения и изучения иммунологических сдвигов
Реакция связывания комплемента
Реакция нейтрализации вируса
Реакция подавления гемагглютинации
Иммунофлюоресценция
Методы серологического исследования
Диагноз
Лечение
Профилактика
Список литературы

G. Davidson, I. Goller и соавт. (1975) использовали метод иммунофлюоресценции для обнаружения ротавирусного антигена в инфицированных клетках эпителия слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки, кусочки которой брали у больных путем биопсии. Исследование проводили с парными сыворотками больных, у которых в кишечнике или клетках дуоденального эпителия методом электронной микроскопии был обнаружен ротавирус. Кусочки слизистой оболочки фиксировали в 95% этиловом спирте при 4°С в течение 2—8 ч и подвергали обезвоживанию в трех сменах абсолютного этилового спирта и двух сменах ксилола. После этого их заливали в парафин и приготавливали тканевые срезы толщиной 4—6 мкм. Освобождение срезов от парафина проводили в ксилоле и этиловом спирте, после чего срезы промывали в фосфатно-буферном солевом растворе. Исследуемую сыворотку наносили на серию срезов и препараты выдерживали 30 мин при 37°С, а затем промывали дважды по 10 мин в фосфатно-буферном солевом растворе. Затем на препараты наносили меченные флуоресцеином сыворотки, иммунные к человеческому глобулину классов G, А и М, и выдерживали 30 мин при комнатной температуре. Промытые фосфатно-буферным раствором срезы заключали в смесь из равных объемов глицерина и фосфатного буфера и исследовали в люминесцентном микроскопе. Специфическая флюоресценция обнаруживалась в препаратах, обработанных сывороткой, иммунной к глобулинам класса М.

Этим способом вирусный антиген был выявлен в цитоплазме клеток эпителия двенадцатиперстной кишки и многих плазматических клеток. Титры антител в сыворотках больных в остром периоде не превышали 1 :4, а в сыворотках периода реконвалесценции достигали 1 : 32. Исследование ротавирусных частиц в клетках эпителия кишечника распространения не получило из-за сложности взятия биопсийного материала. Постоянное присутствие и высокие концентрации ротавируса в фекалиях больных обусловили преимущественное использование фекального материала для диагностики заболевания и изучения его возбудителя. Феномен иммунофлюоресценции для обнаружения вируса в фекалиях был использован L. Foster, М. Peterson, R. Spendlove (1975) и М. Peterson, R. Spendlove, R. Smart (1976) в разработанной ими реакции иммунопреципитации, описание которой приводится ниже в специальном разделе.
Ряд исследователей использовали иммунофлюоресценцию для выявления антигена ротавируса в клетках культур ткани. Выше уже упоминалось о том, что ротавирус плохо адаптируется к культурам ткани и не накапливается в них в больших количествах, поэтому обнаружение вирусных частиц или вирусного антигена в клетках инфицированных культур встречает значительные трудности. Применение флюоресцирующих антител позволяет выявлять ротавирусный антиген в клетках культур ткани с достаточной чувствительностью и специфичностью.
R. Wyatt, A. Kapikian и соавт. (1974) использовали непрямой метод иммунофлюоресцентного окрашивания антигена для изучения характера размножения ротавируса в культурах фрагментов кишечника человеческого плода. Им удалось обнаружить специфический ротавирусный антиген в клетках эпителия ворсинок на протяжении 3—4 пассажей. Непрямой метод иммунофлюоресцентного выявления ротавирусного антигена в клетках культур тканей после заражения их фекальным материалом был применен J. Banatvala, В. Totterdell и соавт. (1975), D. Purdham, Р. Purdham и соавт. (1975), М. Albrey, A. Murphy (1976а), L. De Silva и J. Marshall (1977) и A. Bryden, Н. Davies и соавт. (1977). Эти исследователи использовали культуры клеток человеческого и животного происхождения для обнаружения ротавируса в образцах фекалий больных гастроэнтеритом. Согласно опубликованным данным, заражение культур ткани инфекционным фекальным материалом и последующее выявление в них ротавирусного антигена при помощи иммунофлюоресценции позволяют обнаружить присутствие ротавируса в фекалиях с одинаковой или большей частотой по сравнению с электронномикроскопическими методами. Накопление ротавирусного антигена после заражения культур фекальным материалом отмечено в перевиваемых клетках свиных почек IB-RS-2 [Banatvala J., Totterdell В. et al., 1975; De Silva L., Marshall J., 1977], клетках первичных однослойных культур кишечника эмбриона человека [Purdham D. et al., 1975], кишечника коровьего плода (Albrey М., Murphy A., 1976a), почек эмбриона человека [Wyatt R., Gill V. el al., 1976], а также в перевиваемых клетках почек обезьян [Bryden A., Davies Н. et al., 1977].
Метод прямого иммунофлюоресцентного окрашивания частиц ротавируса диареи телят Небраски (NCDV) в клетках однослойной культуры почек крупного рогатого скота (MDBK), инфицированных культуральным или фекальным вирусным материалом, разработан В. Barnett, R. Spendlove и соавт. (1975). Так как вирус диареи телят антигенно близок ротавирусу человека, разработанный метод имеет перспективу использования для выявления вирус нейтрализующих антител в сыворотках крови больных и переболевших ротавирусным гастроэнтеритом.



 
« Роль опорно-двигательного аппарата в сохранении работоспособности   Руководство к практическим занятиям по общей гигиене »