Начало >> Статьи >> Архивы >> Ротавирусный гастроэнтерит

Реакция иммунопреципитации с окрашиванием преципитатов - Ротавирусный гастроэнтерит

Оглавление
Ротавирусный гастроэнтерит
Этиология
Физико-химические свойства ротавирусов
Культивирование ротавирусов человека
Таксономия ротавирусов
Антигенные взаимоотношения в группе ротавирусов
Эпидемиология
Патологическая анатомия
Патогенез
Иммунитет
Клиника
Клиника - боли в животе, температура, интоксикация
Исследование слизистых оболочек, лимфатических узлов
Исследование пищеварительной функции
Функциональное состояние других органов кровообращения, дыхания
Клиническое течение при эпидемической вспышке
Клиническое течение спорадических случаев
Лабораторные исследования
Обнаружение и исследование частиц ротавируса под электронным микроскопом
Иммуноэлектронно-микроскопическое исследование частиц ротавируса
Выделение и изучение ротавируса в культурах ткани
Реакция связывания комплемента
Метод иммунофлюоресценции
Реакция иммунопреципитации с окрашиванием преципитатов
Иммунодиффузия
Иммуноэлектроосмофорез
Методы радиоиммунологического исследования
Методы иммуноферментативного исследования
Сравнительная оценка различных методов обнаружения ротавируса
Методы обнаружения и изучения иммунологических сдвигов
Реакция связывания комплемента
Реакция нейтрализации вируса
Реакция подавления гемагглютинации
Иммунофлюоресценция
Методы серологического исследования
Диагноз
Лечение
Профилактика
Список литературы

Реакция иммунопреципитации с окрашиванием преципитатов флюоресцирующими антителами
Реакция была разработана L. Foster, М. Peterson и R. Spendlove (1975). В ее основу положено иммунофлюоресцентное окрашивание вирусных агрегатов, образующихся под воздействием иммунной сыворотки, и обнаружение окрашенных агрегатов при помощи световой микроскопии. М. Peterson, R. Spendlove и R. Smart (1976) показали принципиальную возможность применения реакции для обнаружения в фекалиях ротавируса человека и ротавируса диареи телят, a R. Yolken, R. Wyatt, А. Каса и соавт. (1977) определили чувствительность метода и разработали его ускоренную модификацию.
Для проведения исследования готовят 2% суспензию фекалий на телячьем бульоне с 0,5% альбумина сыворотки крупного рогатого скота. Суспензию центрифугируют 2 ч при 3000 об/мин, надосадочную жидкость фильтруют через фильтр «Миллипор» с диаметром пор 1,2 мкм. В качестве иммунной сыворотки используют сыворотку поросят-гнотобионтов, инфицируемых перорально большими дозами ротавируса человека. Флюоресцирующим препаратом служит меченный флуоресцеином глобулин кроликов, иммунных к свиному глобулину. Обработанную суспензию фекалий (0,2 мл) смешивают с 0,2 мл разведенной сыворотки, иммунной к ротавирусу (при титре антител 1 :320 сыворотку разводят в 80 раз), и выдерживают смесь 1 ч при 37°С, после чего центрифугируют 1 ч при 12000 об/мин (17 3000 g) и температуре 4°С. Осадок ресуспендируют в 0,2 мл фосфатно-буферного солевого раствора и добавляют 0,2 мл подобранного по оптимальной активности разведения флюоресцирующего глобулина. После 10 мин выдержки при комнатной температуре смесь центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин. Осадок  ресуспендируют в 1 капле фосфатно-буферного солевого раствора, наносят на предметное стекло и накрывают покровным стеклом, края которого герметизируют коллодием. Препарат исследуют под иммерсионным объективом при увеличении 1200 в микроскопе, снабженном флюоресцентной приставкой и соответствующими светофильтрами. О положительном результате свидетельствует яркая флюоресценция окрашенных агрегатов, хорошо видимых в поле зрения микроскопа. Специфичность результата проверяют по включаемым в каждую серию наблюдений положительному и отрицательному контролям.
Для проведения исследования описанным методом требуется 5—6 ч. Для ускоренной диагностики с применением этого метода R. Yolken, R. Wyatt, A. Kalica и соавт. (1977) разработали его упрощенную модификацию, при которой исследование пробы или серии проб занимает примерно 2 ч. Готовят 10% суспензию фекалий на физиологическом растворе и фильтруют ее через фильтр «Миллипор» с диаметром пор 450 нм. Фильтрат (0,2 мл) смешивают с 0,2 мл оптимального разведения сыворотки поросят, иммунной к ротавирусу, и выдерживают 10 мин при 37°С. Остальные этапы обработки аналогичны описанным. Готовые препараты просматривают в микроскопе с темным полем при освещении лампой накаливания мощностью 60 Вт и с применением светофильтров, позволяющих использовать фиолетовую и ультрафиолетовую части спектра.
Результаты выявления специфических иммунных агрегатов при исследовании 52 проб фекалий инфицированных телят и 67 проб фекалий больных детей авторы сравнили с результатами исследования тех же проб фекалий под электронным микроскопом и отметили практически полное их совпадение. Для проверки специфичности реакции к фекалиям, не содержащим ротавирус, добавляли различные вирусные агенты (вирус краснухи, реовирусы типов 1—3, аденовирусы типов 1, 2, 5, 9, 14, 21, 26, 31, вирусы ECHO типов 1—4, 9, 11, 15, 21, 31, вирусы Коксаки А9, А13, А17, А21, В4, В5, полиовирусы типов I, II III и три штамма орбивируса). Суспензии обрабатывали антиротавирусной сывороткой и окрашивали флюоресцирующим глобулином, однако ни одного положительного результата не было получено. Упрощенный метод постановки реакции оказался в равной степени чувствительным и специфичным.
По данным R. Yolken, R. Wyatt. A. Kalica и соавт. (1977), метод иммунопреципитации ротавируса с выявлением преципитатов иммунофлюоресценцией является не менее чувствительным для обнаружения ротавируса в фекалиях, чем электронно- микроскопический метод, и высокоспецифическим. Эти достоинства метода, а также достаточная простота оборудования, необходимого для его использования, и быстрота получения результатов делают его перспективным для ускоренной лабораторной диагностики ротавирусного гастроэнтерита. Определенные сложности для ряда лабораторий может представить получение стандартных иммунных сывороток и конъюгированного иммунного глобулина.



 
« Роль опорно-двигательного аппарата в сохранении работоспособности   Руководство к практическим занятиям по общей гигиене »