Начало >> Статьи >> Архивы >> Ротавирусный гастроэнтерит

Иммуноэлектроосмофорез - Ротавирусный гастроэнтерит

Оглавление
Ротавирусный гастроэнтерит
Этиология
Физико-химические свойства ротавирусов
Культивирование ротавирусов человека
Таксономия ротавирусов
Антигенные взаимоотношения в группе ротавирусов
Эпидемиология
Патологическая анатомия
Патогенез
Иммунитет
Клиника
Клиника - боли в животе, температура, интоксикация
Исследование слизистых оболочек, лимфатических узлов
Исследование пищеварительной функции
Функциональное состояние других органов кровообращения, дыхания
Клиническое течение при эпидемической вспышке
Клиническое течение спорадических случаев
Лабораторные исследования
Обнаружение и исследование частиц ротавируса под электронным микроскопом
Иммуноэлектронно-микроскопическое исследование частиц ротавируса
Выделение и изучение ротавируса в культурах ткани
Реакция связывания комплемента
Метод иммунофлюоресценции
Реакция иммунопреципитации с окрашиванием преципитатов
Иммунодиффузия
Иммуноэлектроосмофорез
Методы радиоиммунологического исследования
Методы иммуноферментативного исследования
Сравнительная оценка различных методов обнаружения ротавируса
Методы обнаружения и изучения иммунологических сдвигов
Реакция связывания комплемента
Реакция нейтрализации вируса
Реакция подавления гемагглютинации
Иммунофлюоресценция
Методы серологического исследования
Диагноз
Лечение
Профилактика
Список литературы

К методу иммуноэлектроосмофореза исследователи обратились, имея в виду прежде всего лабораторную диагностику ротавирусного гастроэнтерита и обнаружение ротавируса в фекалиях, так как электронная и иммунноэлектронная микроскопия, несмотря па многие достоинства, является трудоемким исследованием и доступна для сравнительно немногих лабораторий. После подтверждения специфичности результатов, получаемых при использовании иммуноэлектроосмофореза для обнаружения антигенов ротавируса, и введения ряда модификаций, повышающих чувствительность метода, он нашел применение и в изучении антигенной структуры различных представителей ротавирусной группы.
В основе метода лежит взаимодействие антигена и антител, диффундирующих в геле и образующих при соединении видимые преципитаты. Под воздействием постоянного тока в аппарате для электрофореза иммунологический процесс усиливается электрофоретическим — движение антигена и антител становится направленным (отрицательно заряженные частицы антигена движутся к аноду, а положительно заряженные антитела движутся к катоду) и ускоренным. Поэтому метод иммуноэлектроосмофореза отличается от метода диффузионной иммунопреципитации в геле большей чувствительностью и быстротой получения результатов. Следует заметить, однако, что при некоторых модификациях метода, повышающих чувствительность и требующих уменьшения разности электрических потенциалов в геле, увеличивается время проведения исследований.
Для обнаружения в фекалиях ротавируса или его антигенов Р. Middleton, М. Petrie и соавт. (1976) использовали иммуноэлектроосмофорез в 1% геле агарозы в барбиталовом буферном растворе (pH 8,8) на предметных микроскопических стеклах. Суспензии фекалий (1:2 в барбиталовом буферном растворе) вносили в катодные лунки, а сыворотки морских свинок, иммунизированных ротавирусом человека (вируссодержащая суспензия фекалий, подвергнутая частичной очистке ультрацентрифугированием и фреоном или более полной очистке центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия и сахарозы),— в анодные лунки. Иммуноэлектроосмофорез проводили при 150 В в течение 90—120 мин. Линии преципитации в геле окрашивали таннином. По заключению авторов, при помощи иммуноэлектроосмофореза удается обнаружить специфический антиген ротавируса в 92% проб фекалий, в которых частицы ротавируса выявляются при помощи электронной микроскопии. Однако сравнительное исследование чувствительности того гг другого метода при обнаружении ротавируса в разведенных препаратах фекалий показало большую чувствительность иммуноэлектронной микроскопии. При ее помощи ротавирус обнаруживается в более разведенном материале (в 4—8 раз), чем при помощи иммуноэлектроосмофореза. R. Tufvesson и Т. Johnsson (1976b) провели аналогичное сравнение методов электронной микроскопии и иммуноэлектроосмофореза при обнаружении ротавируса (или его антигена) в фекалиях больных гастроэнтеритом и получили совпадение результатов в 94—100%. L. Spence, М. Fauvel и соавт. (1977), применившие окраску линий преципитации таннином, выявили методом иммуноэлектроосмофореза ротавирусный антиген в 96% проб, в которых ротавирус был обнаружен при помощи электронной микроскопии. В более ранней работе эти же авторы [Spence L., Fauvel М. et al., 1975) отметили лишь 50% совпадений результатов, полученных каждым из методов, что в дальнейшем нашло объяснение в трудности обнаружения неокрашенных линий преципитации в геле. Р. Grauballe, J. Genner и соавт. (1977), использовавшие сыворотку кроликов, иммунизированных антигеном ротавируса человека, фракционированным и очищенным при помощи иммуно- электроосмофореза, указывают на большую чувствительность иммуно-электроосмофоретического метода для обнаружения антигена ротавируса в фекалиях по сравнению с иммуноэлектронной микроскопией. Они считают, что чувствительность метода повышается при применении специально изготовленной высокоспецифической иммунной сыворотки. Все исследователи, применявшие иммуноэлектрофорез для обнаружения ротавирусного антигена в фекалиях больных, отмечают высокую специфичность метода. Достаточно быстрое получение результатов, простота подготовительных процедур и проведения исследований, а также чувствительность и специфичность метода иммуно- электроосмофореза способствовали его внедрению в практику ряда лабораторий как метода ранней и быстрой диагностики ротавирусного гастроэнтерита.
При помощи иммуно-электроосморетических исследований были получены также новые данные об антигенной структуре ротавируса. Р. Middleton, М. Petrie и соавт. (1976) обнаружили при взаимодействии различных антигенных препаратов и иммунных сывороток от 2 до 4 линий преципитации. При исследовании частично очищенных антигенных препаратов (дифференциальное ультрацентрифугирование и обработка фреоном) и некоторых проб неочищенных фекалий (до 25% всех исследованных проб) были получены 4 линии (1, 2, 3-я и 4-я, считая от катодной лунки с антигеном). Исследование многих проб неочищенных фекалий и всех высокоочищенных проб выявляло 2 линии (1-я и 2-я). При электронно-микроскопическом исследовании кусочков агарозного геля, содержащих преципитаты каждой из линий, в преципитате 2-й линии систематически обнаруживалось большое количество агрегированных частиц ротавируса. Линия 1-я, 3-я и 4-я цельновирионных структур не содержали. Исследование антигенных фракций, полученных разделением в градиенте плотности хлорида цезия, показало, что фракция с плотностью 1,36—1,38 г/мл образует линии 1-ю и 2-ю, а фракция с плотностью 1,25—1,28 г/мл образует линии 3-ю и 4-ю. При электронно-микроскопическом исследовании в более плотной фракции авторы обнаруживали полные вирусные частицы, в то время как во фракции с плотностью 1,25—1,28 г/мл частицы вируса обнаруживать не удавалось. Р. Middleton, М. Petrie и соавт. считают, что менее плотные антигенные фракции, выявляющиеся в линиях 3-й и 4-й, содержат растворимый антиген.


Рис. 16. Схема образования и выявления иммунного комплекса на твердой основе.
А — глобулин 1, иммунный к исследуемому антигену, адсорбируется на внутренней поверхности полистиреновой или поливиниловой пробирки или лунки; Б — антиген 2 связывается с иммунным глобулином, В — глобулин 3, также иммунный к антигену 2, связывается с ним. Если глобулин 3 соединен с радиоактивным йодом или с ферментом, специфический иммунный комплекс выявляется на этой стадии реакции, Г — при некоторых модификациях реакции радиоактивный йод или фермент соединяются с глобулином 4, иммунным к глобулину 3. Данная фаза реакции предусматривает связывание этих, глобулинов; Д — выявление специфического иммунного комплекса; включающего радиоактивный или ферментный компонент, проводится измерением интенсивности гамма-излучения или окраски индикаторного субстрата, меняющего цвет под действием фермента.
Четыре линии преципитации при иммуноэлектроосмофоретическом изучении антигенной структуры ротавируса обнаружили также Р. Grauballe, J. Genner и соавт. (1977). Они отметили наибольшую антигенную активность фракционированных препаратов ротавируса, соответствующих плотности 1,28 г/мл.



 
« Роль опорно-двигательного аппарата в сохранении работоспособности   Руководство к практическим занятиям по общей гигиене »