Начало >> Статьи >> Архивы >> Ротавирусный гастроэнтерит

Методы радиоиммунологического исследования - Ротавирусный гастроэнтерит

Оглавление
Ротавирусный гастроэнтерит
Этиология
Физико-химические свойства ротавирусов
Культивирование ротавирусов человека
Таксономия ротавирусов
Антигенные взаимоотношения в группе ротавирусов
Эпидемиология
Патологическая анатомия
Патогенез
Иммунитет
Клиника
Клиника - боли в животе, температура, интоксикация
Исследование слизистых оболочек, лимфатических узлов
Исследование пищеварительной функции
Функциональное состояние других органов кровообращения, дыхания
Клиническое течение при эпидемической вспышке
Клиническое течение спорадических случаев
Лабораторные исследования
Обнаружение и исследование частиц ротавируса под электронным микроскопом
Иммуноэлектронно-микроскопическое исследование частиц ротавируса
Выделение и изучение ротавируса в культурах ткани
Реакция связывания комплемента
Метод иммунофлюоресценции
Реакция иммунопреципитации с окрашиванием преципитатов
Иммунодиффузия
Иммуноэлектроосмофорез
Методы радиоиммунологического исследования
Методы иммуноферментативного исследования
Сравнительная оценка различных методов обнаружения ротавируса
Методы обнаружения и изучения иммунологических сдвигов
Реакция связывания комплемента
Реакция нейтрализации вируса
Реакция подавления гемагглютинации
Иммунофлюоресценция
Методы серологического исследования
Диагноз
Лечение
Профилактика
Список литературы

Разработка методов введения радиоактивного йода в белковые молекулы и выявление способности полистиреновых и поливиниловых поверхностей (в частности, внутренних поверхностей пробирок, изготовленных из этих материалов) адсорбировать гамма-глобулин послужили методической основой многоплановых радиоиммунологических исследований антигенов и антител.
Закрепление иммунного глобулина на твердой поверхности и возможность образования на нем фиксированных иммунных комплексов были использованы в качестве общего принципа для разработки и введения в исследовательскую практику ряда методов, позволяющих обнаруживать различные антигены и антитела и измерять их содержание в исследуемых материалах (радиоиммунологические, иммуноферментативные и другие методы и их многочисленные модификации).
Общая схема образования иммунного комплекса на основе фиксированного иммунного глобулина представлена на рис. 16.
Р. Middleton, М. Holdaway и соавт. (1977) разработали методику радиоиммунологического обнаружения ротавируса (ротавирусного антигена), описание которой приводится ниже.
Для исследования фекалий на наличие ротавируса их суспендируют в пятикратном объеме фосфатно-буферного солевого раствора с 0,02% фенолового красного — индикатора pH, 0,01% NaN3 и 0,1% альбумина плазмы крупного рогатого скота, центрифугируют 15 мин при 2000g и надосадочную жидкость используют в качестве антигена. Если жидкость имеет кислую реакцию, ее доводят до pH 7,0 несколькими каплями раствора NaHCО3. Для иммунизации животных применяют ротавирусный антиген, очищенный центрифугированием в градиенте плотности хлорида цезия.
Антиротавирусные иммунные сыворотки готовят на кроликах и морских свинках внутримышечным введением очищенного антигена с равным количеством адъюванта Фрейнда. Сыворотки обрабатывают 40% сульфатом аммония, преципитат ресуспендируют в фосфатно-буферном солевом растворе, освобождают от электролитов в колонке, заполненной сефадексом G-25, и получают препарат антиротавирусного иммунного глобулина.
Кроличий глобулин, иммунный к глобулину морской свинки, используют в виде коммерческого препарата, который подвергают дополнительной очистке методом аффинной хроматографии. Очищенный глобулин соединяют с Na 1251 при помощи лактопероксидазного метода, избыточный йод и пероксидазу удаляют на колонках с сефадексом (G-25 и G-150). Специфическая радиоактивность препарата в исследованиях Р. Middleton, М. Но1daway и соавт. составляла 3-106 имп/мин на 1 мкг.
Для проведения реакции внутреннюю поверхность полистиреновых пробирок (12X75 мм) на расстоянии 15 мм от дна покрывают кроличьим антиротавирусным глобулином. В пробирки вносят по 0,5 мл глобулина и вращают их в роллерном аппарате при комнатной температуре в течение 6 ч. После этого избыток глобулина удаляют и в пробирки добавляют по 0,6 мл раствора альбумина плазмы крупного рогатого скота в концентрации 15 мг/мл. Пробирки вращают при комнатной температуре в течение 20 ч, удаляют альбумин, споласкивают 2 мл фосфатно-буферного солевого раствора, высушивают под небольшим вакуумом при комнатной температуре и хранят при 4°С до проведения исследований. Альбумин фиксируется на участках поверхности, оставшихся непокрытыми иммунным глобулином, что предотвращает возможность образования на этих участках неспецифических иммунных комплексов при последующем внесении ингредиентов реакции.
В подготовленные таким образом пробирки вносят по 0,5 мл обработанной суспензии, исследуемой на наличие ротавирусного антигена, выдерживают 2 ч в роллерном аппарате, удаляют жидкость и трижды промывают 2 мл фосфатно-буферного солевого раствора. После промывания в пробирки добавляют по 0,5 мл антиротавирусного иммунного глобулина морской свинки в концентрации 10 мкг/мл, выдерживают 1 ч в роллерном аппарате и пятикратно промывают 2 мл фосфатно-буферного солевого раствора. Завершающим этапом образования радиоактивного иммунного комплекса является добавление в пробирки по 0,4 мл кроличьего глобулина, иммунного к глобулину морской свинки и соединенного с 1251. Пробирки выдерживают в роллерном аппарате в течение 1 ч, пятикратно промывают 2 мл фосфатно-буферного солевого раствора и помещают в счетчик импульсов гамма-излучения. Результаты исследований учитываются сравнением интенсивности излучения в опыте и фонового. Нижним пределом интенсивности излучения, от которого велся отсчет, авторы считали четырехкратное число импульсов, зарегистрированных для фосфатно-буферного солевого раствора.
При исследовании 97 проб фекалий методами электронной микроскопии и радиоиммунологического анализа ротавирус был обнаружен первым методом в 32 пробах. Эти же пробы оказались положительными при исследовании вторым методом. Расхождение было только в результатах исследования одной пробы, положительной при радиоиммунологическом методе и отрицательной при электронной микроскопии. Такое совпадение результатов свидетельствует о высокой специфичности радиоиммунологического анализа и о возможности его использования вместо электронной микроскопии для обнаружения ротавирусного антигена в фекалиях больных гастроэнтеритом с целью ранней и быстрой диагностики.
Сравнение чувствительности радиоиммунологического анализа, реакции связывания комплемента и электронной микроскопии при обнаружении ротавируса или ротавирусного антигена в фекалиях показывает, что реакция связывания комплемента сохраняет чувствительность при разведении испытуемой суспензии 1-10-1, электронно-микроскопическое исследование — до 2,5-10—3, а радиоиммунологический анализ — до 3,1-10-4.
A. Kalica, R. Purcell и соавт. (1977) разработали для обнаружения ротавируса в фекалиях микрообъемную модификацию метода радиоиммунологического анализа, при которой общий объем реагентов для исследования одной пробы составляет 150 мкл. Реакцию проводят в лунках поливиниловых пластин, предназначенных для одноразового использования. В лунки вносят по 75 мкл глобулина сыворотки морской свинки, иммунного к ротавирусу человека, и после проведения адсорбции (4 ч при 4°С) обрабатывают лунки сывороточным альбумином крупного рогатого скота (12 ч при 4°С), вносят исследуемый материал (25 мкл) в виде 2% суспензии фекалий в телячьем питательном бульоне и выдерживают его в лунках 40—48 ч при 4°С. Для выявления специфического антигена в лунки добавляют по 50 мкл глобулина сыворотки морской свинки, иммунного к ротавирусу человека и соединенного с 1251. После 4-часовой инкубации при 37°С и промывки лунок их вырезают из пластинок, помещают в пробирки счетчика и производят подсчет импульсов. Реакция позволяет четко выявлять наличие ротавирусного антигена в тех пробах фекалий больных гастроэнтеритом, в которых ротавирус обнаруживается при электронной микроскопии. Однако при контрольном исследовании фекалий от больных другими заболеваниями без явлений гастроэнтерита реакция дает 5—8% ложных положительных реакций. Для контроля специфичности положительных результатов авторы разработали тест иммунного блокирования антигена в исследуемом материале. Для этого по 75 мкл фильтрата исследуемой суспензии фекалий смешивают с 75 мкл сыворотки теленка, иммунного к ротавирусу диареи телят, и с 75 мкл сыворотки того же теленка, взятой до инфицирования. После инкубации смесей при комнатной температуре в течение 2 ч обе пробы исследуют на выявление ротавирусного антигена. Блокирование антигена иммунной сывороткой подтверждает специфичность положительного результата, полученного при исследовании необработанной пробы. Авторы считают, что разработанный ими метод, дополненный тестом иммунного блокирования, столь же специфичен и чувствителен, как электронная микроскопия, и может быть рекомендован для массовых вирусологических обследований с эпидемиологическими целями. Следует, однако, заметить, что техника радиоиммунологических исследований остается сложной, требует точных манипуляций и специального дорогостоящего оборудования как для подготовки реагентов, так и для учета результатов реакции.
Радиоактивные материалы являются источником опасных излучений, что требует обеспечения специальных условий для работающих. Поэтому радиоиммунологический анализ не может рассматриваться как метод повседневной лабораторной диагностики ротавирусного гастроэнтерита. В то же время интенсивные исследования, направленные на разработку упрощенных модификаций этого метода, а также введение в практику работы готовых стандартизированных реагентов способствуют более широкому использованию радиоиммунологического метода не только для исследовательских, но и для практических целей.



 
« Роль опорно-двигательного аппарата в сохранении работоспособности   Руководство к практическим занятиям по общей гигиене »