Начало >> Статьи >> Архивы >> Ротавирусный гастроэнтерит

Методы иммуноферментативного исследования - Ротавирусный гастроэнтерит

Оглавление
Ротавирусный гастроэнтерит
Этиология
Физико-химические свойства ротавирусов
Культивирование ротавирусов человека
Таксономия ротавирусов
Антигенные взаимоотношения в группе ротавирусов
Эпидемиология
Патологическая анатомия
Патогенез
Иммунитет
Клиника
Клиника - боли в животе, температура, интоксикация
Исследование слизистых оболочек, лимфатических узлов
Исследование пищеварительной функции
Функциональное состояние других органов кровообращения, дыхания
Клиническое течение при эпидемической вспышке
Клиническое течение спорадических случаев
Лабораторные исследования
Обнаружение и исследование частиц ротавируса под электронным микроскопом
Иммуноэлектронно-микроскопическое исследование частиц ротавируса
Выделение и изучение ротавируса в культурах ткани
Реакция связывания комплемента
Метод иммунофлюоресценции
Реакция иммунопреципитации с окрашиванием преципитатов
Иммунодиффузия
Иммуноэлектроосмофорез
Методы радиоиммунологического исследования
Методы иммуноферментативного исследования
Сравнительная оценка различных методов обнаружения ротавируса
Методы обнаружения и изучения иммунологических сдвигов
Реакция связывания комплемента
Реакция нейтрализации вируса
Реакция подавления гемагглютинации
Иммунофлюоресценция
Методы серологического исследования
Диагноз
Лечение
Профилактика
Список литературы

Установление возможности адсорбции иммунных глобулинов на поверхности некоторых пластмасс способствовало разработке не только методов радиологических исследований иммунных комплексов, фиксированных на плотной основе, но и других принципиально сходных методов, в которых радиоактивный компонент- индикатор заменяется другим, проще выявляемым индикатором, в частности ферментом, присутствие которого в иммунном комплексе обнаруживается по изменению цвета ферментируемого индикаторного субстрата. На применении фермента-индикатора основаны различные модификации иммуноферментативной реакции, названной разработавшими ее Е. Engvall и Р. Perlmann (1971) ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).
Реакция находит все более широкое применение в вирусологии, в частности при изучении и диагностике вирусных гепатитов. R. Yolken, Н. Kirn и соавт. (1977), одновременно с D. Ellens и Р. De Leeuw (1977а) использовали ее для обнаружения ротавируса (ротавирусного антигена) в фекалиях больных гастроэнтеритом.
По описанию R. Yolken, Н. Kim и соавт., реакцию проводят следующим образом. Для получения иммунного глобулина сыворотки морских свинок их иммунизируют ротавирусом человека, полученным из фекалий инфицированных телят-гнотобионтов. Вирусный препарат подвергают очистке трихлортрифторэтаном и последовательным центрифугированием в градиенте плотности сахарозы и хлорида цезия. Подготовленный для иммунизации антиген вводят животным внутримышечно в смеси с равным объемом адъюванта Фрейнда. Уровень содержания иммунного глобулина в сыворотке иммунизированных животных считают достаточным, если титр антител, определяемых в реакции связывания комплемента с концентрированным ротавирусом диареи телят, достигает 1 : 512.
Иммунный глобулин осаждают в 18% растворе сульфата натрия. Соединение его с индикаторным ферментом — щелочной фосфатазой — проводят по методу Е. Engvall и Р. Perlmann (1971). Для получения 2 мг соединенного с ферментом иммуноглобулина расходуется 5 мг препарата кишечной щелочной фосфатазы телят, содержащего фермент в концентрации 1000 ЕД/мг. Фекалии используют в реакции в виде фильтратов 2% суспензии исходного материала в телячьем бульоне с 0,5% альбумина сыворотки крупного рогатого скота или в виде нефильтрованных суспензий.
Реакцию проводят в лунках поливиниловых панелей для микрообъемных тестов. В лунки вносят по 100 мкл глобулина морской свинки, иммунного к ротавирусу человека. Используют очищенный препарат глобулина, разведенный карбонатным буферным раствором (pH 9,6) примерно 1 : 1000, так чтобы конечная концентрация глобулина составила 0,003 мг/мл. Пластины выдерживают 4 ч при 4°С, споласкивают трижды фосфатно-буферным солевым раствором с добавлением 0,5 мл/л твина-20 (pH раствора 7,4) и хранят во влажной камере при 4°С до использования.
Фекалии в виде фильтрованной или нефильтрованной 2% суспензии вносят в обработанные иммунным глобулином лунки по 50 мкл (материал каждой пробы вносят в 2 лунки), добавляют в каждую лунку по 25 мкл 2% плодной сыворотки крупного рогатого скота в фосфатно-буферном солевом растворе с твином-20 и выдерживают пластинки 1 ч при 37°С. После трехкратного ополаскивания лунок фосфатно-твиновым буфером добавляют в каждую лунку по 100 мкл глобулина морской свинки, иммунного к ротавирусу человека, соединенного со щелочной фосфатазой и разведенного 1 :200 таким же буферным раствором. Пластинки выдерживают 1 ч при 37°С, трижды промывают лунки фосфатно-твиновым буфером и добавляют в каждую лунку по 200 мкл паранитрофенилфосфатного субстрата, разведенного до концентрации 1 мг/мл в 10% диэтаноламиновом буферном растворе при pH 9,8. Пластинки выдерживают 30 мин при комнатной температуре и по истечении этого времени определяют интенсивность желтого окрашивания субстрата, которое появляется под действием щелочной фосфатазы, остающейся в тех лунках, где образовался специфический иммунный комплекс, т. е. присутствует ротавирусный антиген. Определение интенсивности окраски проводят при помощи колориметра в световом луче с длиной волны 400 нм. Цифровой результат исследования выражают отношением P/N (positive/negative), определяемым по формуле:

где Е — оптическая плотность жидкости в соответствующих лунках в световом луче с длиной волны 400 нм; Е отрицательного контроля — средний показатель оптической плотности в 6 пробах, заведомо не содержащих ротавирус, взятых от больных с симптомами респираторных заболеваний.

Авторы в серии опытов показали возможность визуального учета результатов реакции без помощи колориметра по интенсивности желтого цвета в лунках с пробами, сравниваемых с лунками стандартного отрицательного контроля.
Для выявления неспецифических положительных реакций R. Yolken, Н. Kim и соавт. предложили использовать тест блокирования. Для проведения этого теста по 50 мкл исследуемой суспензии фекалий смешивают с равными объемами предварительно разведенных 1:5 сыворотки теленка, перенесшего ротавирусную инфекцию, и сыворотки этого же теленка, взятой до инфицирования. Полученные смеси выдерживают 2 ч при 37°С и испытывают, как описано выше для фекальных суспензий. По результатам исследования рассчитывают процент блокирования по формуле:

где(преинф.) — показатель , полученный по результатам исследования пробы, обработанной сывороткой, взятой до инфицирования ротавирусом;(конв.) — показатель, вычисленный для пробы, обработанной сывороткой, взятой после перенесения ротавирусной инфекции. Положительный результат считали специфическим (т. е. указывающим на присутствие в пробе ротавируса), если процент блокирования превышал 50%.
По данным R. Yolken, Н. Kim и соавт., иммуноферментативное исследование является высоко специфическим и при обнаружении ротавируса в фекалиях больных гастроэнтеритом вполне сравнимо по чувствительности с электронно-микроскопическим исследованием. К преимуществам иммуноферментативного метода исследования относится и то, что он не требует сложной дорогостоящей аппаратуры, а используемые реагенты высоко стабильны (пластинки с адсорбированными антителами и соединенный с ферментом глобулин сохраняют полную активность при 4°С не менее 5 мес).
В 1977 г. R. Yolken, R. Wyatt и A. Kapikian сообщили о том, что применение в иммуноферментативной реакции двух типов антител, наслаиваемых на ротавирусный антиген, значительно повышает ее чувствительность и интенсивность цветового компонента. При этой модификации реакции лунки обрабатывают козьей антиротавирусной сывороткой в разведении 1:100000, добавляют исследуемую суспензию фекалий, антиротавирусные антитела морской свинки (иммунная сыворотка в разведении 1:6000) и козий глобулин, иммунный к глобулину морской свинки и соединенный со щелочной фосфатазой.
D. Ellens и P. De Leeuw (1977b) применили иммуноферментативную реакцию с пероксидазой хрена для обнаружения вируса гастроэнтерита телят в фекалиях. Для адсорбции на твердой основе (полистиреновыс пластины с лупками) был использован глобулин телят, иммунный к ротавирусу. В обработанные этим глобулином лупки вносили исследуемую суспензию фекалий и после инкубации добавляли иммунный антиротавирусный телячий глобулин G, соединенный с пероксидазой, а затем индикаторный субстрат. Полученные авторами данные о высокой чувствительности и специфичности иммуноферментативного исследования для обнаружения ротавирусного антигена телят позволили авторам применить этот метод для обнаружения ротавируса человека в фекалиях детей, больных гастроэнтеритом [Ellens D., De Leeuw Р., 1977а]. Источником иммунного глобулина для фиксирования на твердой основе и для соединения с пероксидазой служила сыворотка телят, иммунная к вирусу диареи телят Небраски (NCDV), обладающему общим групповым антигеном с ротавирусом человека.

Иммуноагрегация эритроцитов

Принцип адсорбции иммунного глобулина на поверхности некоторых пластмасс, положенный в основу ряда модификаций радиоиммунологических и иммуноферментативных методов, использован и в недавно разработанной реакции агрегации эритроцитов, покрытых иммунным глобулином (SPACE — solid phase aggregation of coated erythrocytes). Для выявления ротавирусного антигена при помощи этой реакции лунки полистиреновых панелей для одноразового использования обрабатывают антиротавирусным иммунным глобулином (иммунной сывороткой), после чего вносят исследуемую 10% суспензию фекалий. Адсорбированный антиген выявляется добавлением в лунки взвеси эритроцитов, покрытых специфическим антиротавирусным IgG [Bradburnc A., Almeida J. et al., 1979].



 
« Роль опорно-двигательного аппарата в сохранении работоспособности   Руководство к практическим занятиям по общей гигиене »