Начало >> Статьи >> Архивы >> Ротавирусный гастроэнтерит

Реакция связывания комплемента - Ротавирусный гастроэнтерит

Оглавление
Ротавирусный гастроэнтерит
Этиология
Физико-химические свойства ротавирусов
Культивирование ротавирусов человека
Таксономия ротавирусов
Антигенные взаимоотношения в группе ротавирусов
Эпидемиология
Патологическая анатомия
Патогенез
Иммунитет
Клиника
Клиника - боли в животе, температура, интоксикация
Исследование слизистых оболочек, лимфатических узлов
Исследование пищеварительной функции
Функциональное состояние других органов кровообращения, дыхания
Клиническое течение при эпидемической вспышке
Клиническое течение спорадических случаев
Лабораторные исследования
Обнаружение и исследование частиц ротавируса под электронным микроскопом
Иммуноэлектронно-микроскопическое исследование частиц ротавируса
Выделение и изучение ротавируса в культурах ткани
Реакция связывания комплемента
Метод иммунофлюоресценции
Реакция иммунопреципитации с окрашиванием преципитатов
Иммунодиффузия
Иммуноэлектроосмофорез
Методы радиоиммунологического исследования
Методы иммуноферментативного исследования
Сравнительная оценка различных методов обнаружения ротавируса
Методы обнаружения и изучения иммунологических сдвигов
Реакция связывания комплемента
Реакция нейтрализации вируса
Реакция подавления гемагглютинации
Иммунофлюоресценция
Методы серологического исследования
Диагноз
Лечение
Профилактика
Список литературы

Реакция связывания комплемента для серологических исследований при ротавирусном гастроэнтерите получила достаточно широкое распространение. Особую роль при этой реакции играют чистота и специфичность антигена, определяющие ее чувствительность и специфичность результатов.
В качестве антигена может быть использована суспензия фекалий больного ротавирусным гастроэнтеритом. Пригодные для этой цели по концентрации ротавируса фекальные пробы подбираются при помощи электронной микроскопии. Различными исследователями предложен ряд методов очистки фекалий для получения комплемент-связывающего ротавирусного антигена. Одним из наиболее простых методов, описанных в разделе «Методы обнаружения и изучения ротавируса», пользовались при многих серологических исследованиях [Kapikian A., Kim Н. et al., 1974; Kapikian A., Cline W. et al., 1975; Kapikian A., Cline W. et al., 1976]. Используя малоочищенный антиген, они показали появление и нарастание титра специфических комплемент-связывающих антител к ротавирусу в процессе заболевания острым небактериальным гастроэнтеритом и провели ряд исследований по разработке оптимальной модификации реакции. N. Blacklow, Р. Echeverria и D. Smith (1976) использовали аналогичный антиген при массовых серологических обследованиях детских контингентов (592 ребенка) для изучения возрастного распределения антител к ротавирусу. Сыворотки одновременно исследовали при помощи метода флюоресцирующих антител с вирусом диареи телят Небраски и получили совпадающие результаты.
Достаточно простой метод изготовления антигенов для исследования в реакции связывания комплемента предложен также G. Zissis, J. Lambert и D. De Kegel (1978). Суспензию фекалий в фосфатно-буферном солевом растворе (30% по объему) дважды последовательно освобождают от осадка центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин. Вторую надосадочную жидкость используют в качестве антигена. Анти- комплементарные свойства, выявляющиеся у части таких антигенов, обычно устраняются добавлением равного объема плодной сыворотки крупного рогатого скота. Авторы использовали изготовленные описанным методом фекальные препараты для обнаружения при помощи реакции связывания комплемента специфического ротавирусного антигена. Однако из серии фекальных препаратов можно выбрать наиболее активные и специфические и использовать их для обнаружения и количественного определения антиротавирусных антител.
I. Gust, R. Pringle и соавт. (1977) готовили комплементсвязывающий антиген из жидких фекалий, большие объемы которых собирали, пользуясь специальными кроватями с прочной сеткой-подстилкой. Фекалии осветляли центрифугированием 15 мин при 10 000 g и 4°С. Небольшие объемы надосадочной жидкости центрифугировали затем в течение 1,5 ч на слое 45% сахарозы в трис(гидроксиметил)аминометановом буферном растворе (0,002М, pH 7,0) при 100 000 g. Осадок ресуспендировали в вероналовом буферно-солевом растворе (1 : 10 по отношению к исходному объему жидкости) и pH полученного антигена доводили до 7,2. Отдельно изготовленные порции антигена смешивали и хранили при —20°С. Антиген обладал высокой специфичностью, содержал 16 антигенных единиц в титруемых микрообъемах и не проявлял антикомплементарных свойств.
М. Martin, G. Gary и Е. Palmer (1979) применили для получения комплемент-связывающего антигена метод очистки и концентрации, ранее разработанный ими для изучения тонкой структуры ротавирусных частиц. По этому методу 10% суспензию фекалий на дистиллированной воде центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин.

Надосадочную жидкость центрифугируют на слое 35% сахарозы при 35 000 об/мин в течение 1 ч. Осадок ресуспендируют в дистиллированной воде и центрифугируют 3 ч в 30—50% градиенте плотности виннокаменнокислого калия в глицерине при 40 000 об/мин. Вирус концентрируется в нижней части градиента, которую собирают и подвергают диализу против дистиллированной воды. После диализа вирусный препарат центрифугируют 18 ч в 30—61% градиенте плотности виннокаменнокислого калия в глицерине при 40 000 об/мин. Фракции, содержащие вирус, собирают, подвергают диализу против дистиллированной воды, и полученный препарат используют как антиген.
Сложность очистки фекального антигена и значительные колебания содержания ротавируса в фекалиях побудили многих исследователей пользоваться в реакции связывания комплемента антигеном, изготовленным из взвесей культивируемых ротавирусов животных — NCDV, SA11 и О, обладающих общим групповым антигеном с ротавирусом человека.
A. Kapikian, W. Cline и соавт. (1975), сделавшие первую попытку разработать стандартную методику реакции связывания комплемента для серологических исследований при ротавирусном гастроэнтерите, использовали в качестве антигена взвесь вируса диареи телят Небраски. Вирус выращивали в первичной культуре ткани почек коровьего эмбриона и после появления цитопатического эффекта примерно в 75% клеток культуральную жидкость собирали, подвергали однократному замораживанию и оттаиванию, концентрировали в 25 раз в ультрафильтрационном концентраторе и использовали в качестве антигена. Исследование с этим антигеном парных сывороток больных острым гастроэнтеритом в реакции связывания комплемента позволяет обнаруживать появление и нарастание титра антител. Комплемент-связывающие антитела, выявляемые при помощи группового антигена, обнаруживаются в сыворотке больных и переболевших, начиная с 8—12-го дня от начала заболевания.
N. Blacklow, Р. Echeverria и D. Smith (1976) при изучении иммунитета к ротавирусу у детей разных возрастных групп провели исследование сывороток одновременно с антигеном, изготовленным из фекалий острых больных, и с антигеном, изготовленным из культурального вируса диареи телят Небраски, и получили сходные результаты.
Антиген из вируса NCDV был использован в реакции связывания комплемента М. Elias (1977а) для изучения частоты реинфекции ротавирусом в различных возрастных группах населения. В. Tufvesson, Т. Johnsson и В. Persson (1974) при помощи культурального вируса NCDV, использованного в реакции связывания комплемента, провели исследование распространения ротавирусной инфекции в семьях, где наблюдались случаи ротавирусного гастроэнтерита. Реакцию связывания комплемента с антигеном из вируса диареи телят Небраски успешно использовали в диагностической практике ряда лабораторий.



 
« Роль опорно-двигательного аппарата в сохранении работоспособности   Руководство к практическим занятиям по общей гигиене »