Начало >> Статьи >> Архивы >> Ротавирусный гастроэнтерит

Реакция подавления гемагглютинации - Ротавирусный гастроэнтерит

Оглавление
Ротавирусный гастроэнтерит
Этиология
Физико-химические свойства ротавирусов
Культивирование ротавирусов человека
Таксономия ротавирусов
Антигенные взаимоотношения в группе ротавирусов
Эпидемиология
Патологическая анатомия
Патогенез
Иммунитет
Клиника
Клиника - боли в животе, температура, интоксикация
Исследование слизистых оболочек, лимфатических узлов
Исследование пищеварительной функции
Функциональное состояние других органов кровообращения, дыхания
Клиническое течение при эпидемической вспышке
Клиническое течение спорадических случаев
Лабораторные исследования
Обнаружение и исследование частиц ротавируса под электронным микроскопом
Иммуноэлектронно-микроскопическое исследование частиц ротавируса
Выделение и изучение ротавируса в культурах ткани
Реакция связывания комплемента
Метод иммунофлюоресценции
Реакция иммунопреципитации с окрашиванием преципитатов
Иммунодиффузия
Иммуноэлектроосмофорез
Методы радиоиммунологического исследования
Методы иммуноферментативного исследования
Сравнительная оценка различных методов обнаружения ротавируса
Методы обнаружения и изучения иммунологических сдвигов
Реакция связывания комплемента
Реакция нейтрализации вируса
Реакция подавления гемагглютинации
Иммунофлюоресценция
Методы серологического исследования
Диагноз
Лечение
Профилактика
Список литературы

L. Spence, М. Fauvell и соавт. (1976) обнаружили, что ротавирус диареи телят Небраски обладает способностью агглютинировать эритроциты человека с группой крови 0(1). Очищенная суспензия вируса проявляла гемагглютинационные свойства до разведения 1 : 256 в широком спектре pH (5,7—7,4). Сыворотки животных, иммунизированных вирусом NCDV, задерживали гемагглютинацию, и это свойство сохранялось при значительных разведениях (до 1 : 2560 при использовании гипериммунной сыворотки кролика).

Исследователи обратили внимание на то, что сыворотка морской свинки, иммунизированной ротавирусом человека, задерживала гемагглютинацию, вызываемую вирусом NCDV, в разведении 1 : 20, в то время как в реакции связывания комплемента с ротавирусом человека титр ее достигал 1:512. Авторы высказали предположение, что группоспецифический антиген ротавирусов лучше выявляется при помощи реакции связывания комплемента, а реакция подавления гемагглютинации является более видоспецифической. Для проверки этого предположения A. Kalica, James и A. Kapikian (1978) исследовали гемагглютинационные свойства ротавирусов различных видов животных. Выраженная способность агглютинировать эритроциты человека с группой крови 0(1) была обнаружена у ротавируса обезьян SA11. Для того чтобы определить, с каким антигеном ротавируса связана гемагглютинационная активность, очищенная центрифугированием (82 500 g; 1 ч) суспензия вируса была подвергнута ультрацентрифугированию в градиенте плотности хлорида цезия (152 000 g; 18 ч). Фракции различной плотности исследовались на наличие антигенной активности при помощи радиоиммунологического анализа и реакции гемагглютинации. Специфические ротавирусные антигены были обнаружены радиоиммунологическим методом во фракциях соответствующих плотности 1,387; 1,369; 1,316 и 1,272 г/см3. Гемагглютинирующий антиген был выявлен только во фракции с плотностью 1,369 г/см3. При исследовании антигенноактивных фракций под электронным микроскопом было показано, что фракция, соответствующая плотности 1,369 г/см3, содержит преимущественно (до 70%) частицы ротавируса, лишенные наружного капсида. Во фракции с плотностью 1,359 г/см3 концентрируются преимущественно двухкапсидные частицы ротавируса (до 90%). Эта фракция была антигенноактивной как при исследовании радиоиммунологическим методом, так и при определении гемагглютинационных свойств. Во фракциях с плотностью 1,302 г/см3 и 1,251 г/см3 при электронно-микроскопическом исследовании обнаруживались фрагменты разрушенных частиц, а также однокапсидные и двухкапсидные частицы как полные, так и лишенные сердцевины. Во фракции с наименьшей плотностью (1,251 г/см3) наблюдалось большое количество полных частиц, адсорбированных на крупных конгломератах разрушенных вирионов. A. Kalica, Н. James и A. Kapikian пришли к выводу, что гемагглютинационные свойства связаны с антигеном внешнего капсида, и реакция гемагглютинации может быть использована для типовой дифференциации ротавирусов.
При проведении исследований с вирусом SA11 нами была установлена его способность агглютинировать эритроциты человека с группой крови 0(1) и эритроциты морской свинки [Дроздов С. Г., Шекоян Л. А., Королев М. Б., 1978; Дроздов С. Г., Шекоян Л. А., Королев М. Б., Нестерина Л. Ф., 1979] и изучена возможность использования реакции подавления гемагглютинации для серологической диагностики ротавирусного гастроэнтерита человека. При сравнительном изучении антител, выявляемых в реакции нейтрализации вируса SА11, подавления гемагглютинации, вызываемой этим вирусом, и антител, обусловливающих агрегацию частиц ротавируса человека в экстракте фекалий, было показано, что реакция подавления гемагглютинации с вирусом SA11 позволяет выявлять антитела к ротавирусу человека в таких же титрах, как и реакция иммуноагрегации с гомологичным ротавирусом (табл. 17).
Таблица 17. Титры антител в сыворотке ребенка, переболевшего ротавирусным гастроэнтеритом, выявляемые в реакциях нейтрализации (PH) и подавления гемагглютинации (РПГА) с вирусом SA11 и иммуноагрегации (ИА) с ротавирусом человека в фекальном экстракте


День болезни

Титры антител

к ротавирусу SA11

к ротавирусу человека (ИА)

PH

РПГА

4-й
14-й

1:4
1:64

1:40
1:640

1:5
1:320

Для приготовления гемагглютинирующего антигена мы использовали следующий метод (Шекоян Л. А., Дроздов С. Г., I978 *). Вирус SA11 вносят в серию пробирок или флаконов с первичной или вторичной культурой ткани почек зеленых мартышек. Культуру выдерживают в течение часа при комнатной температуре, после чего добавляют бессывороточную культуральную поддерживающую среду (смесь равных объемов среды 199 и минимальной среды игла с удвоенной концентрацией витаминов и аминокислот). Культуру помещают в термостат (37°С) на 48 ч. За это время клеточный слой частично разрушается, а сохранившиеся его участки механически отделяют от стекла и полученную взвесь центрифугируют 30 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, к осадку добавляют дистиллированную воду (1/15-1/20 от исходного объема суспензии), ресуспендируют и обрабатывают в ультразвуковом аппарате для полного разрушения клеток и освобождения вируса. К обработанной суспензии добавляют равный объем фреона-112, тщательно гомогенизируют смесь встряхиванием в течение 5 мин и центрифугируют 30 мин при 5000 об/мин. Прозрачную надосадочную жидкость отделяют и используют в качестве гемагглютинирующего антигена.

* А. С. 789115 (СССР). Способ получения антигена для диагностики вирусного гастроэнтерита / Л. А. Шекоян, С. Г. Дроздов. — Заявл. 12.06.78/28 2628370/28— 13; Опубл. в Б. И., 1980, № 47.

Вирус SA11 агглютинирует эритроциты человека с группой крови 0(1) и эритроциты морской свинки, поэтому реакцию подавления гемагглютинации можно ставить с тем или другим видом эритроцитов. Исследуемые сыворотки обрабатывают каолином, для чего к 1-му разведению сыворотки добавляют равный объем 25% взвеси отмытого кислотой каолина и выдерживают 30 мин. Каолин удаляют центрифугированием, а разведение сыворотки становится вдвое большим. Разведения сыворотки и компонентов реакции готовят на фосфатно-буферном солевом растворе (pH 7,4) или на физиологическом растворе NaCl с добавлением 0,04% альбумина сыворотки крупного рогатого скота. Реакцию проводят в макрообъемах в стеклянных серологических пробирках или в микрообъемах в лупках пластиковых панелей.
Для реакции в микрообъемах серию последовательных двукратных разведений сыворотки разливают в лунки по 0,025 мл и добавляют в каждую лунку по 0,025 мл гемагглютинирующего антигена, содержащего в этом объеме 4—8 гемагглютинирующих единиц. Смеси выдерживают 1 ч при комнатной температуре, добавляют 0,05 мл 0,5% суспензии эритроцитов и помещают панели в термостат (37°С) на 1 ч. Титром антител считают обратное значение наибольшего разведения, вызывающего полное подавление гемагглютинации.
Реакция подавления гемагглютинации, вызываемой вирусом SA11, по нашим данным, является достаточно чувствительной и специфической для выявления иммунологических сдвигов в сыворотках людей, переболевших ротавирусным гастроэнтеритом, а определяемые при ее помощи титры антител вполне сравнимы с титрами, определяемыми в реакциях с ротавирусом человека. М. Martin, G. Gary и Е. Palmer (1979) при сероэпидемиологических исследованиях ротавирусного гастроэнтерита человека сравнили результаты, полученные при помощи реакции подавления гемагглютинации с вирусом SА11, реакции связывания комплемента с ротавирусом человека и иммуноферментативной реакции (ELISA) с ротавирусом диареи телят Небраски. Эти авторы также рекомендуют реакцию подавления гемагглютинации с вирусом SA11 в качестве достаточно простой, чувствительной и специфической пробы для серологических исследований при рота вирусном гастроэнтерите человека.

Гемагглютинация, вызываемая ротавирусами
Рис. 17. Гемагглютинация, вызываемая ротавирусами. Пояснения в тексте.

Разработка метода культивирования ротавируса человека в клетках ткани приматов [Дроздов С. Г., Шекоян Л. А., Королев М. Б., Анджапаридзе А. Г., 1979, 1980] дала возможность Л. А. Шекоян с сотр. провести исследования его гемагглютинационных свойств. Было установлено, что ротавирус человека хорошо агглютинирует эритроциты человека с группой крови 0(1) и эритроциты морской свинки.
На рис. 17 показана агглютинация эритроцитов человека в присутствии ротавируса обезьян SA11 и ротавируса человека (штаммы 331, 279, 553 и 1А). В горизонтальные ряды U-образных лунок серологической пластмассовой пластины внесена суспензия каждого из вирусов в разведениях от 1 : 10 до 1 :5120 и взвесь эритроцитов. Нижний горизонтальный ряд (КК) представляет собой контроль жидкости тканевой культуры, не содержащей вирус, правый вертикальный ряд (КЭ) — контроль эритроцитов. При наличии гемагглютинации эритроциты образуют равномерный осадок по всему дну лунки; при ее отсутствии они осаждаются в центре дна. Ротавирусы, испытанные в опыте, представленном на рис. 17, агглютинируют эритроциты в титрах 1 :80 (штаммы 553 и ΙΑ), 1 : 160 (штамм 331) и 1 :320 (штамм 279 и вирус SA11).
Способность ротавируса человека агглютинировать эритроциты была использована в реакции подавления гемагглютинации, при помощи которой исследовались наличие и титр специфических антител в сыворотках крови детей, переболевших острым гастроэнтеритом. Исследования показали, что титры антител, определяемые в этой реакции с ротавирусом человека, сравнимы с титрами, определяемыми с вирусом SA11.
Однако наши данные указывают на несколько большую чувствительность реакции подавления гемагглютинации с ротавирусом человека для выявления наличия и уровня антител в сыворотках переболевших ротавирусным гастроэнтеритом по сравнению с реакцией, проводимой с вирусом SAIL



 
« Роль опорно-двигательного аппарата в сохранении работоспособности   Руководство к практическим занятиям по общей гигиене »