Начало >> Статьи >> Архивы >> Ротавирусный гастроэнтерит

Методы серологического исследования - Ротавирусный гастроэнтерит

Оглавление
Ротавирусный гастроэнтерит
Этиология
Физико-химические свойства ротавирусов
Культивирование ротавирусов человека
Таксономия ротавирусов
Антигенные взаимоотношения в группе ротавирусов
Эпидемиология
Патологическая анатомия
Патогенез
Иммунитет
Клиника
Клиника - боли в животе, температура, интоксикация
Исследование слизистых оболочек, лимфатических узлов
Исследование пищеварительной функции
Функциональное состояние других органов кровообращения, дыхания
Клиническое течение при эпидемической вспышке
Клиническое течение спорадических случаев
Лабораторные исследования
Обнаружение и исследование частиц ротавируса под электронным микроскопом
Иммуноэлектронно-микроскопическое исследование частиц ротавируса
Выделение и изучение ротавируса в культурах ткани
Реакция связывания комплемента
Метод иммунофлюоресценции
Реакция иммунопреципитации с окрашиванием преципитатов
Иммунодиффузия
Иммуноэлектроосмофорез
Методы радиоиммунологического исследования
Методы иммуноферментативного исследования
Сравнительная оценка различных методов обнаружения ротавируса
Методы обнаружения и изучения иммунологических сдвигов
Реакция связывания комплемента
Реакция нейтрализации вируса
Реакция подавления гемагглютинации
Иммунофлюоресценция
Методы серологического исследования
Диагноз
Лечение
Профилактика
Список литературы

Радиоиммунологические методы серологического исследования

Метод радиоиммунологического обнаружения ротавирусного антигена в фекалиях больных гастроэнтеритом в качестве быстрой диагностической пробы разработан Р. Middleton, М. Holdaway и соавт. (1977), а его микрообъемная модификация предложена A. Kalica, R. Purcell и соавт. (1977). L. Ваbiuk, S. Acres и В. Rouse (1977) разработали радиоиммунологическую пробу для обнаружения и титрования антител к ротавирусу диареи телят в сыворотках крови крупного рогатого скота. Эта проба оказалась пригодной и для выявления иммунологических сдвигов в сыворотке крови людей, переболевших ротавирусным гастроэнтеритом.

Исследование наличия и титра антител в сыворотках крови крупного рогатого скота проводят, используя вирус, локализованный в клетках культуры ткани, выращенной в лунках одноразовых пластиковых панелей. Клетки BSC-1 вносят по 5 -104 в минимальной среде. Игла с глютамином и плодной коровьей сывороткой в каждую лунку. Через 24 ч образуется сливной слой клеток, который после промывания инфицируют ротавирусом диареи телят при множественности инфицирования 0,5. После часовой адсорбции при 37°С жидкость из лунок удаляют и вносят минимальную среду Игла с 0,5% фракции V сывороточного альбумина крупного рогатого скота. В течение 24 ч в инфицированных культурах развиваются выраженные цитопатические изменения. Культуры фиксируют 20 мин 95% этиловым спиртом, 100% метиловым спиртом или 10% раствором формалина, промывают трижды раствором Хеикса и вносят в лунки по 50 мкл исследуемых разведений сывороток (каждое разведение исследуют в 6 лунках). Пластинки выдерживают при 37°С во влажной атмосфере в течение 1 ч, промывают трижды раствором Хенкса и добавляют в каждую лунку по 50 мкл кроличьего глобулина, иммунного к глобулину крупного рогатого скота и соединенного с 1251. Пластины выдерживают еще 1 ч при 37°С, промывают четырехкратно раствором Хенкса и подсушивают на воздухе. Донышки лунок отламывают, помещают в стеклянные кюветы и вводят в счетчик гамма-излучения. Уровень специфического связывания реагирующих антигена и антител (коэффициент связывания) определяют по следующей формуле:

Коэффициент связывания выше 2 считали положительным. Авторы предлагают использовать описанный ими метод радио- иммунологического исследования для обнаружения и титрования антиротавирусных антител в сыворотках крови человека, считая по аналогии с другими серологическими реакциями, что групповой антиген ротавируса диареи телят позволит выявить соответствующие антитела.
Н. Watanabe, I. Gust и I. Holmes (1978) применили для серологических исследований при ротавирусном гастроэнтерите вирус SA11 и фиксирование иммунного комплекса с включением 1251 на бумажных дисках.

Иммуноферментативные методы серологического исследования

Иммуноферментативные методы в различных модификациях находят все большее применение при серологических исследованиях ротавирусного гастроэнтерита. R. Yolken, R. Wyatt, Н. Kim и соавт. (1978) разработали метод обнаружения и измерения уровня IgG и IgM, иммунных к ротавирусу, в сыворотке крови, используя препараты антител, соединенные со щелочной фосфатазой, под действием которой изменяется цвет индикаторного субстрата, что указывает на образование специфического иммунного комплекса. В качестве антигена авторы использовали 2% фильтрат суспензии фекалий телят-гнотобионтов, заболевших в результате экспериментального заражения ротавирусом человека. Иммунную сыворотку морских свинок получали путем иммунизации животных суспензией вируса, очищенного центрифугированием в градиентном растворе хлорида цезия. Титр антител в сыворотке по результатам реакции связывания комплемента составлял 1 : 512. Ферментативно активными иммуноглобулинами служили препараты козьего глобулина, иммунного к человеческим глобулинам классов G и М и соединенного со щелочной фосфатазой. Содержание IgG и IgM, иммунных к ротавирусу, определяли в сыворотках крови детей, госпитализированных с явлениями острого гастроэнтерита. Сыворотки крови детей, больных респираторными заболеваниями, служили в качестве контроля. Для сравнительной оценки результатов все сыворотки исследовали в реакциях нейтрализации, связывания комплемента и иммунофлюоресценции с вирусами диареи телят и О.
Иммуноферментативную реакцию проводят в микрообъемных лунках поливиниловых панелей, предназначенных для одноразового использования. Иммунную к ротавирусу человека сыворотку морских свинок в разведении 1 : 10 000 в карбонатном буферном растворе, pH 9,8 (оптимальные разведения реагентов определяются заранее шахматным титрованием), вносят в каждую лунку в количестве 100 мкл, и пластины выдерживают 14 ч при 4°С. Лунки затем промывают фосфатным буферным раствором с добавлением твина 20 (0,5 мл/л), вносят по 100 мкл антигена (2% фильтрат фекальной суспензии,, инфицированной ротавирусом человека, в разведении 1:5) и выдерживают 4 ч при 4°С. После троекратного промывания лунок фосфатнотвиновым буферным раствором в них вносят исследуемые сыворотки (по 100 мкл), пластины выдерживают 1 ч при 37°С, снова троекратно промывают, добавляют по 100 мкл соединенного со щелочной фосфатазой козьего глобулина, иммунного к человеческому глобулину G или М, и выдерживают 1 ч при 37°С. Лунки снова промывают и вносят по 100 мкл индикаторного субстрата — паранитрофенилфосфата в диэтаноламиновом буферном растворе, pH 9,8, в концентрации 1 мг/мл. После 30-минутной инкубации при комнатной температуре плотность желтой окраски раствора, появляющейся под действием фосфатазы, включенной в образовавшийся иммунный комплекс, измеряют в колориметре при длине световой волны 400 нм. При учете большого количества результатов ферментативная реакция после 30-минутной выдержки при комнатной температуре блокируется добавлением в каждую лунку 25 мкл 3М раствора едкого натра.  Результаты реакции учитывают по коэффициенту P/N, представляющему собой отношение показателей оптической плотности исследуемой пробы и отрицательного контроля. Отношение P/N выше 1,8— 2 обычно принимают за достоверно положительный результат. Титрование оценивают по наибольшему разведению, дающему положительное значение P/N. По заключению R. Yolken, R. Wyatt, Н. Kim и соавт. (1978), иммуноферментативная реакция является высоко специфической и превосходит по чувствительности реакцию иммунофлюоресценции в 4 раза, а реакцию связывания комплемента — в 10 раз. При помощи иммуноферментативной реакции было обнаружено, что антитела класса М появляются в крови больных в острой фазе заболевания ротавирусным гастроэнтеритом при отсутствии антител класса G, которые начинают обнаруживаться позднее. Полученные результаты 'подтверждают данные других авторов о том, что выявление в крови обследуемых антител класса М к ротавирусу свидетельствует об очень недавней инфекции. Возможность выявления и титрования антител классов М и G при помощи иммуноферментативной реакции и относительная несложность ее постановки определяют большую перспективность этой реакции в качестве метода лабораторной серологической диагностики и углубленного изучения ротавирусной инфекции [Ghose L., Schnagl R., Holmes I., 1978; Martin M., Gary G., Palmer E., 1979].
R. Yolken, R. Wyatt, B. Barbour и соавт. (1978) разработали модификацию иммуноферментативной реакции для обнаружения и титрования антител к ротавирусу, при которой к разведениям сыворотки добавляют равное количество ротавируса (2% фильтрат суспензии фекалий больного, содержащих ротавирус) и после 2-часовой инкубации при 37°С иммуноферментативной реакцией по описанному выше методу определяют количество ротавирусного антигена, оставшегося не связанным антителами. Эта модификация исключает необходимость использования ротавируса, размножаемого в кишечнике телят-гнотобионтов. Кроме того, результат реакции учитывают по обнаружению ротавирусного антигена, поэтому в лаборатории можно использовать один и тот же набор иммунных компонентов реакции и при обнаружении вируса в фекалиях, и при обнаружении антител в сыворотке. Модификация, по заключению авторов, является высокочувствительной и специфической, а учет ее конечных результатов может проводиться визуально без колориметра по изменению цвета, определяемому сравнением с контролями, что делает метод еще более приемлемым для использования во многих лабораториях.
Рассматривая описанные выше методы серологических исследований при ротавирусном гастроэнтерите, необходимо отметить, что к настоящему времени набор таких методов весьма значителен и продолжает пополняться. Они варьируют в сложности, так что многие лаборатории могут проводить серологические исследования случаев и вспышек ротавирусного гастроэнтерита, используя методы, соответствующие поставленным задачам и техническим возможностям.
Иммуноферментативные методы в последнее время привлекают внимание многих исследователей. Высокая чувствительность и возможность достижения большой специфичности обусловливают все более широкое использование их как для решения научных проблем, так и для диагностических целей. Разработаны достаточно простые модификации метода, уже нашедшие применение в исследовательской и диагностической практике. Изготовление стандартных и рабочих реагентов для иммуноферментативных реакций, предпринимаемое в настоящее время по инициативе Всемирной организации здравоохранения, должно во многом содействовать дальнейшему внедрению этой группы методов в практику работы широкого круга лабораторий.



 
« Роль опорно-двигательного аппарата в сохранении работоспособности   Руководство к практическим занятиям по общей гигиене »