Начало >> Статьи >> Архивы >> Ротавирусный гастроэнтерит

Культивирование ротавирусов человека - Ротавирусный гастроэнтерит

Оглавление
Ротавирусный гастроэнтерит
Этиология
Физико-химические свойства ротавирусов
Культивирование ротавирусов человека
Таксономия ротавирусов
Антигенные взаимоотношения в группе ротавирусов
Эпидемиология
Патологическая анатомия
Патогенез
Иммунитет
Клиника
Клиника - боли в животе, температура, интоксикация
Исследование слизистых оболочек, лимфатических узлов
Исследование пищеварительной функции
Функциональное состояние других органов кровообращения, дыхания
Клиническое течение при эпидемической вспышке
Клиническое течение спорадических случаев
Лабораторные исследования
Обнаружение и исследование частиц ротавируса под электронным микроскопом
Иммуноэлектронно-микроскопическое исследование частиц ротавируса
Выделение и изучение ротавируса в культурах ткани
Реакция связывания комплемента
Метод иммунофлюоресценции
Реакция иммунопреципитации с окрашиванием преципитатов
Иммунодиффузия
Иммуноэлектроосмофорез
Методы радиоиммунологического исследования
Методы иммуноферментативного исследования
Сравнительная оценка различных методов обнаружения ротавируса
Методы обнаружения и изучения иммунологических сдвигов
Реакция связывания комплемента
Реакция нейтрализации вируса
Реакция подавления гемагглютинации
Иммунофлюоресценция
Методы серологического исследования
Диагноз
Лечение
Профилактика
Список литературы

Проблема культивирования ротавируса человека оказалась достаточно сложной, и попытки добиться его размножения во многих видах культур клеток долгое время оставались безрезультатными.
Невосприимчивыми к ротавирусу человека оказались и лабораторные животные, обычно используемые в вирусологических исследованиях.
Некоторый успех был получен при попытках воспроизведения заболевания на обезьянах и отдельных видах крупных домашних животных.
R. Wyatt, D. Sly и соавт. (1976) воспроизвели клиническую картину диареи у новорожденных макак-резусов, зараженных перорально в первый день жизни содержащим ротавирус фильтратом фекалий ребенка, больного гастроэнтеритом. Явления диареи развились у обезьян после 2—5-дневного инкубационного периода и сопровождались выделением вируса с фекалиями. Однако заражение этим фекальным материалом здоровых обезьян не сопровождалось развитием у них диареи, хотя вирус и удавалось обнаруживать в их фекалиях.
Заражение 5-месячной макаки-неместрины содержащим ротавирус фекальным материалом от больных детей (материал был введен через зонд в двенадцатиперстную кишку) вызвало после 4-дневного инкубационного периода явления диареи (водянистый стул), продолжавшийся 12 ч [Mitchell J., Lambeth L. et al., 1977].
При исследовании кусочков слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки, регулярно получавшихся от этой обезьяны путем биопсии, отдельные частицы ротавируса обнаруживались в эпителиальных клетках ворсинок уже через 20 мин после заражения, а через 4—5 дней частицы образовывали крупные скопления в лизосомах этих клеток.
Воспроизвести заболевание с явлениями диареи удалось также у некоторых видов животных-гнотобионтов путем заражения их перорально фекальным материалом, полученным от больных гастроэнтеритом и содержащим ротавирус. A. Torres-Medina, R. Wyatt и соавт. (1976) наблюдали явления диареи у 1—4-дневных поросят (заболели 19 из 21 заражавшихся животных), сопровождавшиеся выделением вируса с фекалиями. D. Snodgrass,
С. Madeley и соавт. (1977) получили аналогичные результаты при заражении новорожденных ягнят, а С. Mebus, R. Wyatt и A. Kapikian (1977) воспроизвели диарею у новорожденных телят. При проведении исследований на животных-гнотобионтах был получен ряд новых данных о размножении вируса в кишечнике, развитии иммунитета, патологоанатомических особенностях инфекции. Однако сложности подобного моделирования предельно ограничивают использование его для изучения ротавирусной инфекции человека.
Проблема культивирования ротавируса человека в клеточных или тканевых субстратах in vitro, несмотря на ее исключительную важность для разработки методов диагностики, изучения инфекционного процесса, специфической профилактики и лечения ротавирусного гастроэнтерита, долгое время оставалась нерешенной.
Отдельные сообщения об обнаружении частиц ротавируса человека или ротавирусного антигена в культурах ткани, инфицированных содержащими ротавирус фекальными материалами от больных, свидетельствовали о трудностях выявления вируса, низких его концентрациях в культуре, отсутствии выраженного цитопатического процесса в клетках и нерегулярности получаемых результатов.
R. Wyatt, A. Kapikian и соавт. (1974) сообщили о культивировании ротавируса человека в клетках эпителия переживающих in vitro фрагментов кишечника плода человека и трех удачных пассажах вируса в этих культурах. О присутствии и локализации вируса в клетках авторы судили по выявлению специфического ротавирусного антигена непрямым методом иммуно- флюоресценции. Banatvala, В. Totterdell и соавт. (1975) описали накопление ротавирусного антигена в цитоплазме клеток перевиваемой культуры почек свиней (IB-RS-2) после инфицирования ее суспензией фекалий больных гастроэнтеритом детей. Очаги специфической иммунофлюоресценции выявляли нанесением на культуральный слой сыворотки свиней, иммунизированных ротавирусом человека, а затем — конъюгированной сыворотки, иммунной к сывороточному глобулину свиней. Авторы использовали культуры, выращенные в плоскодонных пластиковых пробирках. После внесения в пробирки фекального материала центрифугировали их 2 ч при 3000 g, что, по мнению исследователей, способствовало проникновению вируса в клетки.

Об обнаружении при помощи иммунофлюоресценции специфического ротавирусного антигена в однослойной культуре клеток кишечника эмбриона человека, зараженной фекальным материалом, сообщили также D. Purdham и соавт. (1975). L. De Silva и J. Marshall (1977), применяя технику J. Banatvala, В. Totterdell и соавт. (1975), также обнаружили в инфицированных клетках IB-RS-2 специфический антиген, a A. Bryden, Н. Davies и соавт. (1977) провели серию экспериментов по использованию культур клеток LLC-MK-2 (перевиваемые клетки почек обезьян), почек эмбриона человека и почек телят для обнаружения ротавируса в фекалиях больных гастроэнтеритом.
Продолжая попытки культивирования ротавируса, R. Wyatt, V. Gill и соавт. (1976) сообщили о его размножении в культуре клеток почек плода человека. Частицы вируса обнаруживались в клетках культуры и в культуральной жидкости под электронным микроскопом. Было проведено 14 пассажей вируса в культуре, однако авторы отметили отсутствие достоверного цитопатического эффекта и сколько-нибудь заметного накопления вируса — методом иммунофлюоресценции только в 1% клеток культуры на уровне 11 — 14-го пассажей удавалось обнаружить вирусный антиген. Попытки авторов повторно выделить вирус из исходного материала, использованного в этих экспериментах, а также из других фекальных проб, содержащих ротавирус человека, окончились неудачей. Т. Morisnima, S. Nagayoshi и соавт. (1976) получили сходные результаты выделения и пассирования ротавируса в клетках кишечника человеческого эмбриона. После 5 пассажей только 3—4% клеток культуры содержали ротавирусный антиген, обнаруживаемый непрямым методом иммунофлюоресценции.
М. Albrey и A. Murphy (1976а), используя методы иммунофлюоресценции и электронной микроскопии, обнаружили ротавирус в однослойной культуре клеток кишечника коровьего плода, инфицированной фекальной суспензией больного гастроэнтеритом ребенка, однако им не удалось получить доказательства размножения вируса и культивировать его в последовательных пассажах.
Достаточно многочисленные попытки инфицирования различных культур клеток ротавирусом человека убедительно показали, что первичное инфицирование клеток достигается с трудом, а последующее размножение вируса в клетках сопровождается появлением неполных частиц, лишенных наружного капсида и, по-видимому, неспособных к дальнейшей репродукции [Wvatt R., Gill V. et al., 1976].
Проблема культивирования ротавируса человека в культурах клеток приматов была успешно решена в 1978 г. в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР [Дроздов С. Г., Шекоян Л. А., Королев М. Б., Анджапаридзе А. Г., 1979]. Основное внимание при проведении этой работы было уделено созданию условий, повышающих интенсивность первичного инфицирования клеток культуры. С этой целью культуры клеток после нанесения на них вируссодержащего материала центрифугировали и к культуральной среде добавляли трипсин.
В 1975 г. J. Banatvala, В. Totterdell и соавт. отметили, что центрифугирование способствует взаимодействию вирусных частиц с клеточной оболочкой и, вероятно, облегчает проникновение вируса в клетку. В 1977 г. L. Babiuk, К. Mohammed и соавт., а в 1978 г. J. Almeida, Т. Hall и соавт. сообщили о том, что добавление трипсина к поддерживающей среде клеточной культуры почек телят значительно увеличивает продукцию клетками ротавируса крупного рогатого скота. Прием основывается на исследованиях R. Spendlove и F. Schaffer (1965) и R. Spendlove, М. McLain и Е. Lennette (1970), показавших, что обработка частиц реовируса трипсином изменяет внешний капсид, в результате чего повышается инфекционность вируса для клеточных культур и усиливается его репродукция. Стимулирующее действие протеолитических ферментов на инфицирование вирусом клетки и на его внутриклеточную репродукцию было отмечено также при культивировании вируса гриппа [Appleyard G., Maber Η., 1974] и ротавируса свиней [Theil К., Bohl Е., Agnes А., 1977].

Рис. 3. Размножение ротавируса человека в культуре клеток почек обезьян, сопровождающееся цитопатическим эффектом. Световая микроскопия. Ув. 100.
А — незараженная культура; Б — та же культура через 24 ч после заражения ротавирусом; В — 48 ч после заражения.
Размножение ротавируса человека

Рис. 4. Ротавирус человека в культуре клеток почек обезьян. 5-й пассаж. Электронная микроскопия. Негативное контрастирование. Ув. 50 000.
Ротавирус человека в культуре клеток почек обезьян
А — двухкапсидные частицы, локализованные внутри мембранных образований; Б — кристаллоподобное скопление однокапсидных частиц в мембранном образовании.
Рис. 5. Морфогенез ротавируса человека (конечные стадии) в культуре клеток почек обезьян. Электронная микроскопия. Метод ультратонких срезов. Ув. 50 000.
Морфогенез ротавируса человека
А — отпочковывание частиц ротавируса от мембраны эндоплазматического ретикулума; Б — частицы ротавируса в полости эндоплазматического ретикулума.

Отдельное воздействие того или другого из этих двух факторов на начальную фазу взаимодействия ротавируса с клеткой не достигает необходимой степени стимуляции процесса, однако их одновременное воздействие (добавление трипсина к культуральной среде и центрифугирование культуры после нанесения на клетки вируссодержащего материала) оказалось достаточным для обеспечения активного размножения вируса в клетках приматов и его быстрой адаптации к этим клеткам, необходимой для последующего серийного пассирования вируса [Дроздов С. Г., Шекоян Л. А., Королев М. Б., Анджапаридзе А. Г., 1979, 1980]. Для культивирования вируса используют однослойную пробирочную культуру (первичную или вторичную) ткани почек зеленых мартышек. Пробирки промывают солевым раствором Хенкса для удаления остатков сыворотки ростовой среды. В три пробирки с культурой вносят по 0,2 мл 0,25% раствора трипсина и центрифугируют пробирки в угловой центрифуге (угловом роторе) в течение 1 ч при 800—1000 об/мин, ориентируя клеточный слой перпендикулярно к направлению действия силы тяжести. После центрифугирования добавляют поддерживающую среду (смесь равных объемов среды 199 и минимальной среды Игла с удвоенным содержанием витаминов и аминокислот без добавления сыворотки). Культуры со средой помещают в роллерные установки и инкубируют при 37°С в течение 48 ч. В этот период в клетках культуры развиваются дегенеративные изменения — они округляются, собираются в агрегаты, в слое клеток образуются пустые пространства, а затем он отторгается от стенок пробирки (рис. 3). Содержимое каждой пробирки трехкратно замораживают и оттаивают, затем жидкость из трех пробирок объединяют, добавляют 8% (по объему) полиэтиленгликоля (М 6000), смесь выдерживают в течение ночи при 4°С, центрифугируют при 1000 об/мин 30 мин, отбрасывают надосадочную жидкость и ресуспендируют осадок в 0,3 мл дистиллированной воды. Полученную суспензию используют для следующего пассажа в культуре ткани по вышеописанному методу. Дальнейшие пассажи можно проводить без обработки полиэтиленгликолем. Размножение ротавируса в культуре ткани проверяется под электронным микроскопом. Для этого содержимое одной пробирки после замораживания и оттаивания и обработки полиэтиленгликолем ресуспендируют в 0,1 мл дистиллированной воды и исследуют под электронным микроскопом. При размножении ротавируса в препарате обнаруживают типичные частицы и их скопления. Специфический характер частиц подтверждают методом иммуноэлектронной микроскопии. В препаратах первично зараженных культур и пассажных материалов разных уровней обнаруживаются как однокапсидные, так и двухкапсидные полные частицы (рис. 4). Соотношение их существенно не меняется на уровне обследованных 4—8-го пассажей, по-видимому, эти частицы представляют собой различные стадии морфогенеза ротавируса (рис. 5). В процессе работы по культивированию ротавируса получены данные о том, что первичное инфицирование культуры и дальнейшее пассирование зависят от характера частиц, содержащихся в фекальном материале, используемом в качестве источника вируса. Инфицирование и культивирование вируса удаются в тех случаях, когда фекальный материал содержит большое количество полных двухкапсидных частиц. Если в фекалиях преобладают однокапсидные частицы, накопления вируса в культуре при первичном инфицировании не происходит и при дальнейшем пассировании вирус перестает обнаруживаться. Большое значение для дальнейшего развития методов культивирования ротавируса приобретают исследования механизма влияния физических и химических факторов на инфицирование клетки ротавирусом.
В 1980 г. R. Wyatt, W. James и соавт. сообщили о культивировании ротавируса человека в клетках почек зеленых мартышек, которое, как и в наших исследованиях [Дроздов С. Г., Шекоян Л. А., Королев М. Б., Анджапаридзе А. Г., 1979], осуществлялось с использованием трипсина и центрифугирования. Ротавирус приобрел способность размножаться в клетках культуры после 11 пассажей на новорожденных поросятах-гнотобионтах.
Авторы не смогли адаптировать к культуре ткани исходный вирус» содержащийся в фекальном материале больного и использованный для пассирования па поросятах.



 
« Роль опорно-двигательного аппарата в сохранении работоспособности   Руководство к практическим занятиям по общей гигиене »