Начало >> Статьи >> Архивы >> Руководство к практическим занятиям по общей гигиене

Микроэкспресс-метод ферментного обнаружения - Руководство к практическим занятиям по общей гигиене

Оглавление
Руководство к практическим занятиям по общей гигиене
Значение гигиенических исследований
Метод санитарного описания
Описание объектов по чертежам и топографическим картам
Методы органолептического исследования  объектов
Санитарно-физические методы исследования воздушной среды
Исследование микроклимата
Методы исследования влажности воздуха
Метода исследования подвижности воздуха
Метода комплексной оценки метеорологических факторов
Исследование ионизации воздуха
Исследование электромагнитных излучений
Исследование интенсивности инфракрасной радиации
Исследование естественной освещенности
Исследование искусственной освещенности
Исследование электромагнитных излучений радиочастот
Исследование механических колебаний воздуха
Исследование вибрации воздуха
Исследование ультразвука и инфразвука
Исследование запыленности воздуха
Методы исследования физико-механических свойств почвы
Методы гигиенических исследований тканей одежды
Испытание гигиенических свойств ткани
Исследование величины теплоизлучения тканями
Методы гигиенических исследований искусственных кож
Санитарно-химические методы исследования внешней среды
Санитарно-химические методы исследования воздушной среды
Определение показателей антропогенного загрязнения воздушной среды
Определение продуктов деструкции пластмасс
Определение в воздухе токсических примесей
Санитарно-химические методы исследования воды
Определение природного солевого состава воды
Определение веществ антропогенного происхождения
Определение в воде токсических   примесей
Санитарно-химические методы исследования почвы
Санитарно-химические методы исследования пищевых продуктов
Экспрессные методы исследования
Микроэкспресс-метод ферментного обнаружения
Бактериологические методы исследования внешней среды
Гельминтологические методы исследования внешней среды
Гидробиологические методы исследования водоемов
Расчетные методы
Исследование реакции организма на воздействие факторов внешней среды
Определение токсичности веществ при пероральном и ингаляционном поступлении
Исследование кожно-резорбтивного действия

Новый микроэкспресс-метод с применением ферментов разработан для обнаружения остаточных количеств фосфорсодержащих инсектицидов в воде и водных смывах, воздухе, экстрактах из пищевых продуктов (А. А. Покровский и Л. Г. Пономарева). С этой целью используется способность этих соединений угнетать активность холинэстеразы.
О наличии фосфорсодержащих инсектицидов судят по снижению активности фермента холинэстеразы до и после ее контактирования с материалом, загрязненным инсектицидом. Активность холинэстеразы в результате взаимодействия с антихолинэстеразными соединениями, каковыми являются фосфорорганические инсектициды, уменьшается.
Степень угнетения активности холинэстеразы в определенных пределах соответствует концентрации инсектицида в растворе.
В основу определения активности холинэстеразы положен колориметрический метод. Согласно данному методу, об активности холинэстеразы судят по скорости освобождения определенных количеств кислоты при гидролизе эфира холина (бутирилхолина или ацетилхолина) стандартными растворами фермента до и после контактирования с инсектицидами. В результате гидролиза эфира холина pH раствора понижается, что приводит к изменению цвета бромтимолового синего в индикаторнобуферном растворе от синего (нейтральная реакция среды) к зелено-желтому (кислая реакция среды).

Скорбеть реакции гидролиза эфира холина холинэстеразой пропорциональна ее содержанию и снижается после контактирования с инсектицидами, соответственно увеличивается и время изменения цвета раствора. Колориметрические сравнения проводят визуально по отношению к колориметрическим стандартам.
Для определения фосфорсодержащих инсектицидов используют специальный набор, состоящий из компаратора и необходимых реактивов.  

Техника работы с набором. Перед началом работы готовят из имеющихся в наборе эмулированных реактивов растворы: бутирилхолинйодида — 0,3% водный раствор, препарата холинэстеразы — 2% водный раствор и 0,005 н. раствор хлористоводородной кислоты для колориметрического стандарта. Индикаторно-буферный раствор представлен в готовом виде.
Реакцию проводят в компараторе, который укрепляют с помощью прорези на боковой стенке корпуса.
При определении инсектицидов в воде для каждого исследуемого образца и для контрольной пробы с чистой водой используют по три гнезда. При этом два первых гнезда служат для приготовления колориметрических стандартов, а третье — для определения ферментной активности (при достаточном опыте стандарт № 1 можно не готовить).
В начале проводят реакцию взаимодействия холинэстеразы с исследуемым раствором, содержащим инсектицид, а затем определяют остаточную активность данного фермента, сравнивая ее с активностью контрольных проб.
Для этого в три гнезда для опытной пробы вносят по две капли приготовленного раствора сыворотки, добавляют по две капли исследуемой воды, перемешивают содержимое гнезд чистыми мешалками и замечают время начала взаимодействия фермента с инсектицидами.
В гнезда для контрольной пробы вносят по две капли раствора сыворотки и незагрязненную воду (4 капли в стандарт № 1 и 2 капли в два других гнезда).
Как указывалось выше, по два гнезда, содержащих опытные и контрольные пробы, используют для приготовления колориметрических стандартов. Для этого в них вносят по две капли индикаторно-буферного раствора. Затем для приготовления стандарта № 1 в гнезда добавляют чистой воды, а для стандарта № 2 — две капли разведенной хлористоводородной кислоты (0,005 н.).

Схема внесения реактивов при определении остаточных количеств инсектицидов в воде

По истечении 15 мин с момента начала контакта фермента с исследуемым материалом в каждое третье гнездо, содержащее опытную и контрольную пробу, в которых проводят определение ферментной активности добавляют по 2 капли индикаторно-буферного реактива и по 2 капли раствора бутирилхолинйодида. Порядок внесения реактивов изображен в табл. 26. Содержимое гнезд перемешивают чистыми мешалками и замечают время начала реакции.
Поместив компаратор с откинутым экраном против света, следят за изменением окраски в гнездах с опытной и контрольной пробами и отмечают время уравнивания окрасок исследуемых проб с соответствующими вторыми колориметрическими стандартами. Окраска стандарта № 2 колеблется от зеленого до желто-зеленого цвета. Окраска первого стандарта, как правило, имеет синий или сине-зеленый цвет.
Если вода содержит кислые или щелочные продукты, то это обнаруживается по изменению цвета первого и второго стандартов. В этом случае при значительном изменении характерной окраски стандартов воду следует предварительно подтитровать до нейтральной реакции с помощью 0,01 н. раствора щелочи или кислоты.
Степень угнетения активности холинэстеразы в результате воздействия инсектицида рассчитывают по формуле:

где У — процент угнетения активности холинэстеразы; Вконтр — время уравнивания контрольной пробы со вторым колориметрическим стандартом, мин; Вопытн —время уравнивания цвета опытной пробы с тем же колориметрическим стандартом, мин.
Пример расчета: Вконтр— 1 мин-Вопытн —2 мин.

При заведомо известной природе инсектицида по полученному проценту угнетения активности холинэстеразы возможно определить концентрацию инсектицида в водном растворе.
Для этого полученный процент угнетения сопоставляют с соответствующей калибровочной кривой. Такие калибровочные кривые составлены для шести важнейших фосфорсодержащих инсектицидов: хлорофоса, метафоса, метилнитрофоса, ацетофоса, карбофоса и метилэтилтиофоса.
Пример расчета концентрации хлорофоса в исследуемом продукте. Известно, что процент угнетения активности холинэстеразы в водном растворе, полученном в количестве 100 мл при обработке 100 г клубники, равен 50%.
Далее содержание хлорофоса в клубнике рассчитываем по формуле;.  
где X— концентрация хлорофоса в продукте, мкг/кг; К — концентрация хлорофоса в растворе, найденная по калибровочной кривой, мкг/мл; п — количество водного раствора, полученного при обработке продукта; m — количество продукта, взятое для анализа, г; 1000 — перевод на кг. 
По калибровочной кривой определяем, что 50% угнетения активности холинэстеразы соответствует содержанию 4,5 мкг хлорофоса на 1 мл раствора.

При ориентировочном (групповом) определении наличия антихолинэстеразных веществ в воде, когда природа инсектицида неизвестна, ограничиваются установлением процента подавления холинэстеразной активности. При этом считают, что угнетению активности фермента на 30% соответствует содержание в воде малых количеств инсектицидов, на 50% средних, на 70 и выше — больших количеств фосфорсодержащих инсектицидов. В этих случаях анализ воды следует повторить, предварительно разбавив исследуемую воду заведомо незагрязненной.
При угнетении холинэстеразы более чем на 50% (без разбавления) вода непригодна для питья и приготовления пищи.

Образец протокола по теме:

Экспрессные методы исследования
1. Экспрессные методы использовались для определения в воздухе следующих веществ.   

  1. При помощи прибора УГ-2 были определены следующие концентрации токсических веществ.
  2. В воде исследовалось содержание железа.

Окрашивание раствора при рассмотрении сбоку

Окрашивание раствора при рассмотрении сверху вниз

Содержание железа, мг/л

 

 

 

  1. Для обнаружения остаточных количеств хлорофоса в пищевом продукте (каком . . . .) использовался микрометод ферментного обнаружения, содержание хлорофоса . . . мг/кг
  2. Оценка полученных данных . . .

Например. 1. При пропускании через индикаторную трубку прибора УГ-2 275 мл воздуха, отобранного на расстоянии 150 м от выброса вентиляции подземного гаража, столбик окраски останавливается у показания 0,1. Концентрация бензина 0,1 мг/л (100 мг/м3) указывает на загрязнение воздуха.
2. Концентрация железа в исследуемой воде 0,7 мг/л. Вода с таким содержанием железа имеет чернильный привкус.



 
« Ротавирусный гастроэнтерит   Руководство по гематологическим болезням у детей »