Начало >> Статьи >> Архивы >> Руководство к практическим занятиям по общей гигиене

Бактериологические методы исследования внешней среды - Руководство к практическим занятиям по общей гигиене

Оглавление
Руководство к практическим занятиям по общей гигиене
Значение гигиенических исследований
Метод санитарного описания
Описание объектов по чертежам и топографическим картам
Методы органолептического исследования  объектов
Санитарно-физические методы исследования воздушной среды
Исследование микроклимата
Методы исследования влажности воздуха
Метода исследования подвижности воздуха
Метода комплексной оценки метеорологических факторов
Исследование ионизации воздуха
Исследование электромагнитных излучений
Исследование интенсивности инфракрасной радиации
Исследование естественной освещенности
Исследование искусственной освещенности
Исследование электромагнитных излучений радиочастот
Исследование механических колебаний воздуха
Исследование вибрации воздуха
Исследование ультразвука и инфразвука
Исследование запыленности воздуха
Методы исследования физико-механических свойств почвы
Методы гигиенических исследований тканей одежды
Испытание гигиенических свойств ткани
Исследование величины теплоизлучения тканями
Методы гигиенических исследований искусственных кож
Санитарно-химические методы исследования внешней среды
Санитарно-химические методы исследования воздушной среды
Определение показателей антропогенного загрязнения воздушной среды
Определение продуктов деструкции пластмасс
Определение в воздухе токсических примесей
Санитарно-химические методы исследования воды
Определение природного солевого состава воды
Определение веществ антропогенного происхождения
Определение в воде токсических   примесей
Санитарно-химические методы исследования почвы
Санитарно-химические методы исследования пищевых продуктов
Экспрессные методы исследования
Микроэкспресс-метод ферментного обнаружения
Бактериологические методы исследования внешней среды
Гельминтологические методы исследования внешней среды
Гидробиологические методы исследования водоемов
Расчетные методы
Исследование реакции организма на воздействие факторов внешней среды
Определение токсичности веществ при пероральном и ингаляционном поступлении
Исследование кожно-резорбтивного действия

Раздел VI.
САНИТАРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ОБЪЕКТОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ
Биологические объекты внешней среды, которые могут оказывать неблагоприятное действие на здоровье человека весьма многообразны. К ним относятся: микроорганизмы, гельминты, простейшие, насекомые-передатчики и резервуары инфекции, животные. Санитарнобиологические методы являются необходимым элементом гигиенической и эпидемиологической оценки различных объектов внешней среды. К санитарно-биологическим методам исследования внешней среды относятся:

  1. бактериологические исследования, которые служат для определения в объектах внешней среды микроорганизмов, в том числе патогенных, или санитарно-показательных микроорганизмов;
  2. гельминтологические исследования, проводимые с целью изучения загрязнения яйцами гельминтов воды, почвы, пищевых продуктов;
  3. гидробиологические исследования, проводимые с целью санитарной оценки водоемов;
  4. прочие исследования, используемые со специальными целями. Данный раздел включает три темы:
  5. Бактериологические методы исследования внешней среды.
  6. Гельминтологические методы исследования внешней среды.
  7. Гидробиологические методы исследования водоемов.

Тема 1.
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ
Продолжительность изучения темы — 4 ч.
Цель занятий: изучить особенности методов определения бактериальной обсемененности различных объектов внешней среды.
Практические навыки: приобрести навыки определения общей микробной обсемененности воздуха, воды, почвы и определения санитарно-показательных микроорганизмов в этих объектах.
Задания студентам: 1. Проведите посев воздуха в лаборатории методом осаждения и аспирационным методом.
Дайте сравнительную характеристику полученным результатам.

  1. На двух чашках Петри с отобранными пробами 300 л воздуха в операционной до и после операции подсчитайте количество колоний стрептококков и стафилококков.

Дайте сравнительную оценку воздуха в операционной в зависимости от режима ее работы.

  1. На чашках Петри с посевом 200 л атмосферного воздуха, во дворе клиники на уровне 1,5 и 2,5 м от поверхности земли подсчитайте число колоний спорообразующихся аэробов и анаэробов. Отметьте морфологические особенности колоний. Проведите сравнительный анализ результатов.
  2. Проведите посев 1 мл воды различной степени чистоты на мясо-пептонный агар, подсчитайте колонии.

Дайте сравнительную оценку результатов.

  1. Определите коли-индекс в пробах воды, различной степени частоты, пользуясь методом мембранных фильтров.

Дайте сравнительную оценку результатов.

Методические указания к выполнению задания

При санитарной оценке различных объектов внешней среды проводят определение общей микробной обсемененности и определение санитарно-показательных микроорганизмов. К последним относятся микробные виды, присутствие которых в объектах внешней среды указывает на загрязнение экскретами человека или животных. Санитарно-показательные микроорганизмы являются условно-патогенными обитателями человеческого или животного организма.
При исследовании бактериологического состава воды в качестве санитарно-показательных используются бактерии группы кишечной палочки. В группу кишечной палочки входят бактерии родов Echerichia, Zitrobacter, Enterobacter, Clebsiella.
Санитарно-показательными организмами для воздуха являются зеленящий стрептококк, — постоянный обитатель слизистой оболочки полости рта здоровых людей, и р-гемолитический стрептококк, количество которого возрастает при различных воспалительных процессах верхних дыхательных путей человека.
При санитарно-гигиенической характеристике воздуха закрытых помещений определяют как общее количество микроорганизмов, так и наличие гемолитических стрептококков и стафилококков.
Обнаружение β-гемолитического стрептококка в большом количестве в воздухе указывает не только на санитарное неблагополучие воздушной среды, но и на ее эпидемиологическую опасность. Такое же значение имеет и обнаружение в воздухе операционных и родильных домов патогенного стафилококка.
При санитарно-бактериологической оценке почвы используется коли-тест.
Во всех случаях бактериологического исследования различных объектов внешней среды определяется общая обсемененность сапрофитной микрофлорой.
Поскольку изучение санитарной микробиологии входит в курс микробиологии, в настоящем разделе даются лишь общие сведения о роли бактериологических методов при изучении и гигиенической оценке объектов внешней среды.

Бактериологическое исследование воздушной среды.

Все существующие методы санитарно-бактериологического исследования атмосферного воздуха и воздуха закрытых помещений подразделяются на:
а) седиментационные, основанные на учете микроорганизмов, свободно оседающих из воздуха на питательную среду; б) аспирационные, основанные на задержке микроорганизмов при просасывании воздуха через питательную среду. Простейший седиментационный метод заключается в том, что чашки Петри с питательной средой устанавливают в открытом виде на горизонтальной поверхности. Срок экспозиции при исследовании на общую обсемененность 5—10 мин, на кокковую микрофлору не менее 40 мин. После экспозиции чашки помещают в термостат на сутки. Результат анализа выражают в средних цифрах.   

Метод оседания может быть использован при исследовании воздуха закрытых помещений для качественного анализа микрофлоры с применением элективных сред. Атмосферный воздух данным методом исследовать нельзя ввиду промерзания питательных сред в зимнее время и увлажнения их поверхности при выпадении осадков, что приводит к сливному росту. Кроме того, постоянно существующие токи атмосферного воздуха, даже при отсутствии ветра искусственно завышают результаты. Метод не дает представления о действительном содержании микроорганизмов в воздухе и почти не применяется, несмотря на его простоту.
Принцип аспирационного метода заключается в пропускании воздуха через жидкие питательные среды (прибор Дьяконова, бактериоуловитель Речменского), или мембранные фильтры.
Одним из наиболее распространенных приборов для санитарно-бактериологического исследования воздуха является прибор Кротова, где улавливание микрофлоры из воздуха основывается на ударно-прибивном действии струи воздуха о влажную поверхность питательной среды (рис. 26). В результате удара находящиеся в воздухе бактерии, пылевые частицы и капли, прибиваются к поверхности питательной среды. В приборе Кротова чашка Петри с питательной средой расположена на вращающемся столике, вследствие чего достигается равномерное обсеменение поверхности чашки микрофлорой воздуха.
Щелевой прибор Кротова характеризуется высокой эффективностью улавливания естественной микрофлоры воздуха помещений, дает сравнимые результаты при проведении параллельных посевов воздуха, прост в работе и позволяет за короткий промежуток времени произвести посевы больших объемов воздуха. Прибор Кротова питается от электросети, что в известной мере ограничивает возможности применения его для исследования атмосферного воздуха.
При отборе проб воздуха прибором Кротова скорость -протягивания воздуха должна составлять 25 л/ч. Длительность отбора проб воздуха зависит от предполагаемой его обсемененности.

Прибор Кротова
Прибор Кротова для бактериологического исследования

При определении общего количества микробов отбирают пробу воздуха в течение 4—6 мин в объеме не менее 100 л воздуха. Посев производят на две чашки с мясо-пептонным агаром для получения средних цифр обсемененности. Выращивают микрофлору в течение суток при температуре 37 °С. 
Подсчет выросших колоний производят через 48 ч.
При исследовании воздуха на наличие представителей кокковой микрофлоры пробу воздуха отбирают в течение 10-15 мин в объеме 250-300 л. Для обнаружения стрептококковом посев производят на среду Гарро для обнаружения стафилококков на среду Чистовича.
Посевы на среде Гарро изучают тотчас после инкубации в течение 18—24 ч при температуре 37 °С. Изучение посевов на среде Чистовича проводят через 24 ч инкубации при температуре 37 °С или 48 ч при комнатной температуре.
Количественный учет стрептококков и стафилококков производят раздельно с пересчетом на 1 м3 исследуемого воздуха.   

Бактериологическое исследование атмосферного воздуха. Бактериологическое исследование атмосферного воздуха производят в соответствии с Временными методическими указаниями, утвержденными министром здравоохранения СССР от 5 марта 1955 г. (№ 179—55).
Пробы воздуха отбирают в постоянных пунктах наблюдения не реже 2 раз в неделю, как правило, параллельно со взятием проб воздуха на запыленность. Пробы воздуха отбирают на двух уровнях от земли — 1,5 и 2,5 м в одно и то же время дня (с 10 до 12 ч), аспирационным методом при помощи прибора Кротова.
Для санитарно-гигиенической характеристики атмосферного воздуха определяют как общую бактериальную обсемененность, так и качественный состав микрофлоры с учетом наличия спорообразующих аэробов и анаэробов.
Определение общего количества бактерий производится вышеописанным способом. Определение качественного состава микроорганизмов атмосферного воздуха проводят следующим образом: колонии спорообразующих аэробов определяют по внешнему виду на мясо-пептонном агаре, используя чашки, на которых производили подсчет общей обсемененности воздуха, по истечении 48 ч с момента отбора пробы. Колонии спорообразующих аэробов в основном беловатые и сероватые, пленчатые или морщинистые, с зубчатыми краями или ветвистые, расплывчатые. На кровяном агаре колонии дают гемолиз. Количество выросших колоний пересчитывают на 1 м3 воздуха.
Для определения спорообразующих анаэробов производят дополнительный отбор проб воздуха в объеме 200—300 л на железо-сульфитную среду. После отбора пробы воздуха чашки с посевами заливают 10—15 мл остывшего агара и помещают в термостат. Подсчитывают почерневшие колонии после выращивания в течение 24 ч при температуре 37 °С с последующим пересчетом на 1 м3 воздуха.

Бактериологическое исследование воды.

Бактериологическому исследованию подвергают:

  1. Пробы воды из источников централизованного водоснабжения.
  2. Пробы воды из источников децентрализованного водоснабжения — колодцев, родников, каптажей.
  3. Пробы воды из открытых водоемов — рек, водохранилищ, озер и др.
  4. Пробы сточных вод, хозяйственно-бытовых и промышленных.

Критерием оценки воды по санитарно-бактериологическим показателям является:
а)   определение общего числа микробов в 1 мл воды, косвенно характеризующего загрязненность воды источника органическими веществами;
б)   определение степени загрязнения воды санитарнопоказательными микробами кишечной группы, выражаемой титром или индексом кишечной палочки.
Определение общего количества бактерий в воде (по ГОСТу 18963-73). Сущность метода заключается в определении в 1 мл воды общего содержания мезофильных, мезотрофных аэробов и факультативных анаэробов, способных расти на питательном агаре данного состава при температуре 37±0,5°С в течение 24+2 ч, образуя колонии, видимые при увеличении в 2—5 раз.
Стерильные чашки Петри раскладывают на столе и подписывают на крышках номер пробы, дату посева и объем посеянной воды.
Из каждой пробы должен быть сделан посев не менее двух различных объемов, выбранных с таким расчетом, чтобы на чашках выросло от 30 до 300 колоний. При исследовании водопроводной воды засевают в каждую из двух чашек по 1 мл.
Стерильной пипеткой отбирают соответствующие объемы воды и вносят в стерильные чашки, слегка приоткрывая крышку. Для посева 0,1 мл и меньших объемов воды используют разведения анализируемой воды. Для этого в пробирку с 9 мл стерильной воды вносят 1 мл анализируемой воды. Другой стерильной пипеткой тщательно перемешивают содержимое пробирки, отбирают из нее 1 мл и переносят в чашку, что будет соответствовать посеву 0,1 мл анализируемой воды. При необходимости посева меньших объемов воды этой же пипеткой переносят 1 мл содержимого первой пробирки в следующую с 9 мл стерильной воды и т. д. После внесения воды в чашки Петри ее заливают 10—12 мл остуженного питательного агара. Воду быстро смешивают с агаром, осторожно наклоняя или вращая чашку по поверхности стола. После этого чашки оставляют на горизонтальной поверхности до застывания среды, а после застывания, агара помещают в термостат вверх дном.

Посевы выращивают при температуре 37±0,5°С в течение 24 ±2 ч.
Колонии, выросшие как на поверхности, так и в глубине агара, подсчитывают при помощи лупы с увеличением в 2—5 раз или прибора для счета колоний. Для этого чашку кладут вверх дном на черный фон. Для большей точности счета каждую подсчитанную колонию отмечают со стороны дна тушью или чернилами для стекла.
Оценивают только те разведения, при посеве которых на чашке выросло от 30 до 300 колоний. При посеве 1 мл неразведенной пробы учитывают любые количества колоний, но не превышающие 300.
Если в чашке с наиболее высоким разведением выросло более 300 колоний и анализ нельзя повторить, то допускается подсчитывать колонии при помощи пластинки с сеткой и лупы при сильном боковом освещении. Подсчитывают не менее 20 квадратов площадью 1 см2, каждый в разных местах чашки, затем выводят среднее арифметическое число колоний на 1 см2, величину которого умножают на площадь чашки в см2, вычисленную по формуле:

где r — радиус чашки, см.
Результат подсчета колоний в каждой чашке выражают в количестве бактерий на 1 мл анализируемой воды с учетом посеянного объема. За окончательное количество бактерий принимают среднее арифметическое результата  подсчета на двух параллельных чашках или при разных разведениях.
Определение количества бактерий группы кишечных палочек. К бактериям группы кишечных палочек относятся грамотрицательные, не образующие спор палочки, сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа при температуре 37±0,5°С в течение 24—48 ч или сбраживающие глюкозу с образованием кислоты и газа при температуре 37±0,5 °С в течение 24 ч и не обладающие оксидазной активностью.
Обнаружение в воде бактерий группы кишечных палочек определяют методом мембранных фильтров и бродильным методом.
Сущность метода мембранных фильтров заключается в концентрировании бактерий из определенного объема анализируемой воды на мембранный фильтр, выращивании их при температуре 37±0,5°С на среде Эндо, дифференцировании выросших колоний и подсчета количества бактерий группы кишечных палочек в 1 л воды.

Рис. 27. Прибор для фильтрования воды методом   мембранных фильтров.

При анализе воды, поступающей в водопроводную сеть и в наиболее характерных ее точках, необходимо анализировать объем не менее 333 мл, профильтровывая этот объем не менее чем через два фильтра.
На этапах очистки анализируют не менее двух десятикратных объемов воды, выбранных в зависимости от ее качества таким образом, чтобы на одном из фильтров вырастало не более 30 колоний бактерий группы кишечных палочек.
При анализе воды неизвестного количества следует засевать 3—4 десятикратных объема (например, из водопроводной сети можно фильтровать 3, 30, 100, 200 мл воды; по этапам очистки — 0,1; 1; 10; 100 мл воды).
Для посева воды методом мембранных фильтров используют фильтровальные аппараты (рис. 27).
Перед посевом воды фильтровальный аппарат стерилизуют фламбированием после обтирания ватным тампоном, смоченным спиртом. После охлаждения на нижнюю часть фильтровального аппарата (столик) кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимают его верхней частью прибора (стаканом, воронкой) и закрепляют устройством, предусмотренным конструкцией прибора.
В воронку (стакан) фильтровального прибора при соблюдении правил стерильности наливают необходимый объем воды и создают вакуум в приемном сосуде. Фильтруют сначала меньшие, а затем большие объемы воды через один фильтровальный аппарат, меняя каждый раз фильтр. При фильтровании небольших объемов воды (1 мл) в воронку сначала наливают 10 мл стерильной воды, а затем вносят анализируемую воду.
После окончания фильтрования воронку снимают, фильтр осторожно приподнимают за край фламбированным пинцетом при сохранении вакуума для удаления излишков влаги на нижней стороне фильтра, а затем переносят его, не переворачивая, на среду Эндо, разлитую в чашку Петри, избегая пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх. Под каждым фильтром на дне чашки делают надпись с указанием объема профильтрованной воды, даты посева и номера пробы. На одну чашку можно поместить 3—4 фильтра с условием, чтобы фильтры не соприкасались. Чашки с фильтрами на среде Эндо помещают в термостат дном вверх и инкубируют при температуре 37+ ± 0,5 °С в течение 18—24 ч.
При отсутствии каких-либо колоний на фильтрах или при наличии только пленчатых, губчатых с неровной поверхностью и краями, плесневых и других, не характерных для кишечных палочек колоний; дают отрицательный результат на присутствие бактерий группы кишечных палочек в анализируемом объеме воды. Анализ на этом этапе заканчивают через 18—24 ч.
При наличии на фильтрах колоний, характерных для кишечных палочек (темно-красных с металлическим блеском и без него, розовых, прозрачных), из нескольких колоний каждого типа готовят мазки, окрашивают по Грамму и микроскопируют. Отсутствие в мазках грамотрицательных неспороносных палочек дает отрицательный ответ. Анализ на этом заканчивают через 18—24 ч.
При наличии в мазках грамотрицательных, коротких, полиморфных, не образующих спор палочек (возможны удлиненные нитевидные формы, а также крупные палочки, полярно окрашенные) выполняют оксидазный тест. Для определения оксидазного теста мембранный фильтр с выросшими колониями переносят пинцетом, не переворачивая, на фильтровальную бумагу, обильно смоченную специальным реактивом*. Через 2—4 мин определяют результат. Все посиневшие колонии к бактериям группы кишечных палочек не относятся, и их не учитывают.
Отсутствие активной оксидазы у темно-красных с металлическим блеском и без него (лактозоположительных) колоний позволяет отнести их к бактериям группы кишечных палочек и немедленно дать положительный ответ.  
Анализ питьевой воды может быть завершен на этом этапе, если нет других колоний, не обладающих оксидазной  активностью. Анализ воды по этапам очистки заканчивают через 18—24 ч подсчетом этих колоний для вычисления коли-индекса.
При наличии на фильтрах розовых и бесцветных колоний с отрицательной оксидазной активностью их подсчитывают и подтверждают принадлежность к бактериям группы кишечных палочек посевом 2—3 изолированных колоний каждого типа в полужидкую среду с глюкозой. Учет производят через 4—5 ч инкубации при температуре 37±0,5°С. При образовании кислоты и газа результат анализа считают положительным. При отсутствии кислоты и газа получают отрицательный результат. Анализ заканчивают через 24—28 ч.
При наличии только кислоты пробирки оставляют в термостате для окончательного учета через 24 ч. При отсутствии газообразования через 24 ч получают окончательный отрицательный результат, при наличии газообразования — положительный результат.
Результат вычисления количества бактерий группы кишечных палочек в 1 л воды выражают в коли-индексе. Коли-индекс высчитывают следующим образом: количество бактерий группы кишечных палочек, выросших в анализируемом объеме воды, умножают на 1000 мл и делят на этот объем воды.
При отсутствии на фильтре бактерий группы кишечных палочек коли-индекс будет меньше той величины, которая была бы определена в случае обнаружения в анализируемом объеме одной клетки кишечной палочки.
Пример 1. При посеве 300 мл воды не выросло ни одной колонки. (1X1000) : 300 = 3. Коли-индекс менее 3.
Пример 2. При посеве трех объемов воды по 100 мл на одном фильтре выросло три колонии бактерий группы кишечных палочек, на двух других нет роста; коли- индекс равен (3X1000) : 300= 10.
Пример 3. При посеве 10 и 100 мл воды на одном фильтре выросла одна колония, на другом выросло пять колоний; коли-индекс равен (6X1000) : 110 = 54.
Если на одном из фильтров сплошной рост бактерий и подсчет их невозможен, тогда в расчет принимают тот объем воды, при фильтрований которого на фильтре выросли изолированные колонии.
Пример 4. В 100 мл — сплошной рост, в 10 мл — 12 бактерий группы кишечных палочек; коли-индекс равен (12X1000): 10=1200.


* Реактив для определения оксидазной активности: 30—40 мг α-нафтола растворяют в 2,5 мл этилового спирта, добавляют 7,5 мл дистиллированной воды и растворяют 40—60 мг диметил-n-фенилен- диамина. Раствор готовят непосредственно перед употреблением.

При подсчете коли-индекса в пробах воды, не обеззараженной с большим фекальным загрязнением, когда для анализа профильтровывают объем воды менее 10 мл или ее разведения, для учета выбирают тот фильтр, на котором выросло менее 10 и не более 30 изолированных колоний кишечных палочек. Количество колоний на нем, относимых к бактериям группы кишечных палочек, пересчитывают на 1 л с учетом только того объема воды, который профильтрован через этот фильтр.

Образец протокола по теме:

Бактериологические методы исследования внешней среды
Образец протокола по теме: Бактериологические методы исследования внешней среды

  1. Санитарно-бактериологическое исследование воздушной среды:

а)   исследование воздуха лаборатории: метод осаждения:
общая бактериальная обсемененность воздуха .. . колоний на чашке Петри аспирационно-седиментационный метод Кротова .................  
общая бактериальная обсемененность . . в 1 м3,
количество стрептококков и стафилококков в 1 м3;
б)   исследование воздуха операционной;


Режим работы

Общая бактериальная обсемененность в 1 мЗ

Количество стрептококков в 1 мЗ

Количество стафилококков в 1 м3

До операции После операции

 

 

 

в) оценка результатов исследования воздуха закрытых помещений;

г)   исследование атмосферного воздуха (дать описание места отбора пробы воздуха, указать наличие людей, характер озеленения, наличие транспортных магистралей и др.), отобрано. ... л
воздуха, методом. ... на уровнях........................................ м
от поверхности земли,
количество спорообразующих аэробов. .... в 1 м3,
и спорообразующих анаэробов.............................. в 1 м3;
д) оценка результатов исследования.................

  1. Санитарно-бактериологическое исследование воды:


а)   общее число бактерий в 1 мл воды .... водопроводной,
колодезной....................................
б) коли-индекс водопроводной воды: профильтровано через фильтр воды . . . мл,
выросло колоний .... коли-индекс колодезной воды: профильтровано через фильтр. ... .мл воды выросло колоний ....
Коли-титр водопроводной воды .... колодезной воды ....
в) оценка результатов санитарно-бактериологического исследования воды ....



 
« Ротавирусный гастроэнтерит   Руководство по клинической электрокардиографии детского возраста »