Начало >> Статьи >> Архивы >> Токсинобразующие микроскопические грибы

Спорынья паспаловая - Токсинобразующие микроскопические грибы

Оглавление
Токсинобразующие микроскопические грибы
Морфологическая характеристика грибов
Класс фикомицеты
Класс аскомицеты
Класс базидиомицеты
Несовершенные грибы
Род пенициллий
Род аспергилл
Род стахиботрис
Порядок спородохиальные
Порядок пикнидиальные
Спорынья пурпуровая
Спорынья паспаловая
Пенициллий исландский
Пенициллий красный
Пенициллий крапивный, лимонно-желто-зеленый, зеленоватый
Аспергиллотоксикозы
Аспергиллофумигатотоксикоз
Стахиботриотоксикоз
Спородесмиотоксикоз
Дендродохиотоксикоз
Фузариотоксикозы
Фузариограминеаротоксикоз
Другие токсические микромицеты
Методы культивирования токсических микромицетов
Экология токсинобразующих грибов и меры борьбы
Литература

Claviceps paspali Stev. et Hall.—спорынья паспаловая
Клавицепспаспалитоксикоз (Clavicepspaspalitoxicosis)
Распространен на видах Paspalum в тропических и субтропических странах. Отравления животных происходят как на пастбищах, так и при стойловом содержании при скармливании сена со склероциями гриба. Такие отравления отмечались, например, в Австралии, Новой Зеландии, Африке, Южной Америке, США, Турции и др. В СССР впервые отмечено в 1942 г. на черноморском побережье Западной Грузии на Paspalum digiiaria и P. dilatatum.
У крупного рогатого скота, лошадей и ослов наблюдалось заболевание, известное под названием «бандала» (Маградзе, 1948).
По Саликову (1944), у лошадей отравление протекает в более тяжелой форме, чем у крупного рогатого скота и свиней. В наиболее тяжелой форме оно протекает у истощенных животных и молодняка. Переболевшие животные восприимчивы к повторным инфекциям. Заболевание развивается на 2—6-й день после начала скармливания зараженного корма (травы).
Токсические вещества гриба действуют на центральную нервную систему животных. Первый признак заболевания — нарушение координации движений. Затем у лошадей возникают мышечная дрожь, угнетенное состояние и ограниченность движений, покачивание корпуса назад, вперед и в стороны. У коров отмечаются временное слюнотечение, шаткость походки, пугливость, у некоторых — расширение зрачков, повышенная возбудимость. Температура тела остается нормальной или падает ниже нормы. Слизистая оболочка рта гиперемирована. Пульс слабого наполнения. Перистальтика несколько усилена. В зависимости от продолжительности болезни (от 2—3 дней до 1—2 месяцев и более) упитанность животных снижается до полного истощения. Удои уменьшаются. Но молоко и мясо больных животных для человека безвредны.
При вскрытии обычно обнаруживаются местные очаговые поражения слизистой желудка, дегенеративное изменение сердечной мышцы и гиперплазия лимфатических, особенно мезентеральных, желез; на воспаленной оболочке желудка имеются гиперемированные участки и, в небольшом количестве, точечные кровоизлияния. Более резко выражены фокусная гиперемия и очаговые кровоизлияния на слизистой оболочке тонкого кишечника. Слизистая ободочной и слепой кишок очагово гиперемирована и местами геморрагически воспалена. Отмечается инъекция сосудов спинного и головного мозга и паренхиматозное перерождение печени.
Через два-три дня после смены корма животные выздоравливают.
Структура алкалоидов
Рис. 13. Структура некоторых алкалоидов С/, purpurea:
а — тетрациклическое ядро алкалоидов спорыньи, 6 — производные лизергиновой кислоты, в — производные клавиновых алкалоидов.
Предупредительные меры против заболевания заключаются в ранней косовице сена до образования конидиальной стадии (сфацелии) и склероциев, недопущении скармливания пораженных растений, уничтожении паспалума (Paspalum) в кустарниках и т. п.
При отравлении CL paspali крупного рогатого скота, лошадей и овец отмечалось, что зрелые склероции гриба менее токсичны.
чем молодые, но более токсичны, чем гриб в стадии сфацелии (Пидо пличко, 1953).
Многие работы посвящены исследованию различных аспектов биологии спорыньи и эрготизма, экологии гриба, чувствительности разных сортов ржи к заражению, условиям искусственного заражения, влиянию различных условий на токсичность склероциев, химической природе эрготоксинов и др. В последние годы достигнуты значительные успехи в изучении химии и фармакологии эрготоксинов, а также метода сапрофитной культуры гриба.
В настоящее время описано большое количество токсинов спорыньи и их производных, обладающих высокой биологической активностью и широко применяемых в медицине. Эрготалкалоиды представлены двумя основными типами: клавиналкалоидами, их производными и пептидными алкалоидами, производными лизергиновой кислоты. В состав указанных типов входит ряд близких, но отличающихся строением и свойствами токсинов (рис. 13).
Алкалоиды клавинового типа, имеющие в основе эрголин (аргоклавин, элимоклавин и др.), довольно простого строения с молекулярным весом около 250. В сапрофитной культуре их получают сравнительно просто. Более сложен токсиногенез алкалоидов полипептидного типа, имеющих в составе лизергиновую и изолизергиновую кислоты. Молекулярный вес этих алкалоидов равен около 600; они отмечены преимущественно в мицелии С/, purpurea. Токсиногенез и образование алкалоидов спорыньи в сапрофитной культуре при поверхностном и глубинном методах культивирования изучались многими авторами (Abe и др., 1953, 1955, 1961, 1966; Taber, 1957; Taylor и др., 1960, и др.).
Неклавиновые алкалоиды представлены эпимерными парами — амидными производными лизергиновой и изолизергиновой кислот. Биологической активностью обладают производные лизергиновой кислоты.
Лизергиновая кислота содержит хинолиновую и индольную структуры; наличие последней обусловливает характерное синефиолетовое окрашивание ее растворов с глиоксалевой и концентрированной серной кислотами, которое используется при качественном и количественном определении эрготал кал оидов.
Более простые амидные производные лизергиновой кислоты (эргометрин и эргометринин) образуют один ряд соединений, производные с полициклической пептидной цепью (эрготамин и эрготаминин) — другой ряд (табл. 1).
В настоящее время описано большое количество производных клавиновых и лизергиновых алкалоидов, выделенных из склероциев или из сапрофитной культуры С/, paspali и С/, purpurea, отличающихся фармакологическими, токсическими и другими свойствами. Так, эрготоксин, эрготамин, эргозин действуют на гладкие мышцы, сужают зрачок, кровеносные сосуды, вызывая нарушение питания тканей (цианоз и гангрену), парализуют двигательные симпатические нервы. Эргометрин в сильной мере сокращает мускулатуру матки, но менее токсичен (не вызывает гангрены).
Определение токсинов производится различными способами: фармакологическими, химическими по цветным реакциям и интенсивности флуоресценции, УФ-спектрометрией и хроматографией (Vining, Taber, 1963).
Таблица 1
Краткая характеристика некоторых алкалоидов Cl. purpurea

Выделены штаммы СZ.|purpurea, образующие в паразитной и сапрофитной культурах преимущественно клавиновые алкалоиды или алкалоиды лизергиновой кислоты.
Тейбер и Вайнинг (Taber, Vining, 1960) изучали в сапрофитной культуре эрготалкалоидобразующие свойства у 41 штамма С/. ригригеа, выделенных из различных растений, Aspergillus flavus, Coniothyrium fuckelii, Ustilago bulata, U. trebouxii, U. maydis, Penicillium roqueforti.
Отмечено определяемое количество эрготоксина у 18 штаммов С/. purpurea и образование у P. roqueforti веществ, аналогичных по значению Rf с элимоклавином, пенниклавином и аргоклавином. Из исследованных источников углерода наиболее пригодными для образования алкалоидов оказались галактоза с примесью глюкозы; рост не отмечался на среде с дульцитом и глюконатом. В качестве источников азота более пригодными оказались аммоний янтарно-кислый, соевая мука, мочевина, дрожжевой экстракт. На среде с азотнокислым калием, мочевиной и /-триптофаном, как единственными источниками азота, рост гриба не наблюдался, но при добавлении 500 мг!л /-триптофана  — к среде с янтарнокислым аммонием
выход эрготоксина в 35-дневной культуре почти удваивался. Не отмечено роста гриба на среде с винной, фосфорной, уксусной кислотами, но хороший выход эрготоксина получен на среде с янтарной кислотой. Авторы установили, что на синтез эрготоксинов значительно влияет соотношение источников углерода (галактозы) и фосфора (табл. 2).
Таблица 2
Влияние соотношения галактозы и фосфора на образование алкалоидов Claviceps purpurea


Г алактоза,
2/Л

КН2Р04, г/л

0,1

0,15

0,25

1,0

3.0

35

 

 

19,0

16,6

27,7

50

49,4

30,1

40,7

65

13,4

59,5

76,0

24,3

39,6

85

3,5

39,7

80,3

100

3,6

11,9

59,8

На основании проведенных исследований установлены типичные показатели роста гриба и образования алкалоидов. Последнее наступает при истощении основных компонентов среды и значительного периода (до 20 дней) роста мицелия (рис. 14).
Рост и образование эрготалкалоидов
Рис. 14. Рост и образование эрготалкалоидов Claviceps purpurea в сапрофитной культуре на среде с галактозой.
Штаммы С/, purpurea отличаются по способности образовывать алкалоиды при росте на среде с различными сахарами и источниками азота. Из исследованных штаммов 10 образовывали алкалоиды при росте на среде с галактозой, 8 — на среде с сахарозой и только один штамм — на среде с лактозой.
Изучаемые штаммы различались также по диапазону использования сахаров: один штамм образовывал алкалоиды при использовании пяти сахаров, три — при использовании четырех и т. д. Однако прямой зависимости между способностью использовать сахара и образованием алкалоидов не отмечалось. Из пяти штаммов С/. purpurea два образовали алкалоиды при росте на среде с янтарнокислым аммонием, три — при росте на среде с дрожжевым экстрактом и ни один — при росте на среде с аспарагином.
Отмечены различная активность штаммов С/, purpurea и влияние среды на общий выход и состав эрготоксинов. Добавление тиамина и цистеина несколько повышало общий выход алкалоидов. Условия, способствующие росту мицелия, не всегда благоприятствуют биосинтезу токсинов (Voigt, Keipert, 1967). Наблюдается значительная
ингибиция биосинтеза токсинов в атмосфере дейтерия (Mrtek и др., 1967).
Тайберг и Ванинг показали изменения в составе компонентов мицелия С/. purpurea, происходящие в период роста, в связи с образованием эрготалкалоидов в зависимости от различной концентрации в среде фосфатов, источников азота, а также от процесса адаптации инокулюма к использованию галактозы (Taber, Vining, 1963).
Полученные результаты позволяют считать, что интенсивность роста мицелия не является общим фактором регуляции образования эрготалкалоидов. В мицелии культур перед началом образования токсинов аккумулируются полиолы, углеводы, липиды и остается высокой концентрация водорастворимого азота и РНК.
Усиление роста мицелия при высокой концентрации фосфатов в среде не сопровождается увеличением образования эрготалкалоидов; наибольшее содержание общего азота зафиксировано при росте на среде с низкой концентрацией фосфатов. Аккумуляция РНК и водорастворимого азота является наиболее характерным показателем образования эрготалкалоидов.
Исходя из этого, авторы считают, что образование эрготалкалоидов происходит в период переходной фазы роста, характеризующейся продолжением аккумуляции азота, но не углеводных резервных веществ. При хроматографическом исследовании сахаров и полиолов мицелия С/. purpurea установлено, что главными и постоянными резервными компонентами его являются трегалоза и маннит, наличие других углеводов (глюкозы, арабита, глицерина, дульцита) зависит от состава питательной среды для культивирования гриба (рис. 15).
Показано значительное влияние неорганических компонентов среды — различных минеральных солей и микроэлементов — на рост и образование алкалоидов лизергинового ряда (Rosarra и др., 1967).
Авторы использовали штаммы Claviceps paspali, образующие лизергиновую кислоту и ее производные. В частности, установлено существенное влияние минерального состава водопроводной воды на образование алкалоидов, в связи с чем рекомендованы среды со специальным составом минеральных солей, стимулирующих синтез алкалоидов лизергиновой кислоты.
Авторы селекционировали штамм С/. paspali, который при культивировании гриба на этих средах образовывал более 1000 мкг алкалоидов на 1 мл среды.
В первой стадии роста гриб культивировался на основной среде с 4%-ным маннитом, 1%-ной янтарной кислотой и микроэлементами, во второй — на среде с 5%-ным маннитом и 3%-ной янтарной кислотой. В третьей стадии определяли рост и образование алкалоидов в зависимости от наличия некоторых минеральных солей и микроэлементов: Са (N03)2 -*H2OJ(l,27 • 10-3), MgS04 • 7H20 (3,25 x X КГ3), ZnS04 • 7H20 (1,74 • КГ5), FeS04 • 7H20 (1-80 • 1(T4), CuS04 • 5H20 (2,01 • 1(П5), MnS04 • 4H20 (4,48 • 10-5), NaNO,
(1,19 • 10-3), KH2P04 (7,35 • 10~3) в молях на литр. Установлено, что для штамма С/, paspali потребность в калии и магнии для роста мицелия была такой же, как и при алкалоидообразовании.
Изменение состава эндогенных сахаров и полиолов в мицелии
Рис. 15. Изменение состава эндогенных сахаров и полиолов в мицелии
Claviceps purpurea в зависимости от состава питательной среды:
а — глюкоза и сукцинат аммония, б — галактоза и сукцинат аммония, в—манноза и сукцинат аммония, г— маннит и сукцинат аммония.
Максимум роста отмечен при более низкой концентрации фосфора, железа, цинка, чем при образовании алкалоидов. Марганец и медь существенно влияли на синтез алкалоидов (рис. 16).
Шалагина и сотрудники (1965) изучали образование алкалоидов у 32 штаммов С/. purpurea, выделенных из склероциев злаковых трав, пшеницы, ржи в различных географических районах СССР. Грибы культивировались в поверхностной культуре на среде следующего состава (в г!л): сахарозы — 75, сорбита — 25, аммония лимоннокислого — 5, КН2Р04 — 0,25, Са (ON3)2 — 1,5, MgS04 — 0,25, КС1 — 0,125, ZnS04 - H20 — 0,00003, FeS04 . 7H20 — 0,03, цистеина — 0,01, аневрина — 0,0001, биотина — 0,000001 (pH 6,5). Наличие токсинов в мицелии определяли в полтора-двухмесячной культуре. Большинство изученных штаммов при данных условиях образовывали эргокриптин и эрготамин; последний был преобладающим, он составлял до 80% всего выхода алкалоидов.
Влияние микроэлементов на рост мицелия
Рис. 16. Влияние микроэлементов на рост мицелия и образование эрготалкалоидов в сапрофитной культуре Claviceps paspali:
а — калий, б — фосфор, в — магний, г — сера, д — железо, е — цинк, ж — марганец
з — медь (1 — мицелий, 2 — эрготалкалоиды).
Их общее  содержание равнялось около 0,03% по отношению к сухому весу мицелия (табл. 3).
Таблица 3
Состав алкалоидов, образуемых различными штаммами CL purpurea


Источник выделения (склероции)

Количество штаммов, образующих алкалоиды

Эргота
мин

Эргокри-
тин

Эргокарнин, эргокритин

Эргометрин

Водорастворимые — клавиновые

Правовра
щающие
эрготок-
синовой
группы

Рожь

20

18

1

 

 

4

Пшеница

1

1

Волосенец

4

11

1

1

Пырей

1

6

1

 

5

1

Канареечник

7

Ежа

1

Чин

1

Лисохвост

1

1

1

Кастаньоли и Мантл (Costaghnoli, Mantle, 1966) исследовали строение алкалоидов, образуемых в сапрофитной культуре штаммами С/, purpurea, изолированными из различных трав. Было показано, что у штамма изолированного из Spartina townsendii при pH 8,5 извлекается хлороформом из фильтрата около 40% токсинов, остальное количество — бутанолом при pH 3,5. Хроматографией хлороформного экстракта на бумаге и в тонком слое силикагеля в большом количестве был получен хеноклавин и в незначительном — элимоклавин и эрготоксин. При хроматографии л-бутанольных экстрактов авторы у этого штамма обнаружили d-лизергиновую кислоту и ее изомер 6-метилэргол-8-еле-8-карбоксил кислоту. d-Лизергиновая кислота в незначительном количестве ранее была изолирована из фильтратов штаммов С/, purpurea, выделенных из Pennisetum typhoideum.
Костаньоли и Тоноло (1966) изучали образование эрготалкалоидов CL purpurea и С/, paspali в погруженной культуре. Установлено, что в сапрофитной культуре синтез эрготалкалоидов происходит у аспорогенных штаммов (не образующих конидий). У активных алкалоидобразующих штаммов, особенно в погруженной культуре, гифы мицелия по характеру роста и функциональной активности имеют ряд фаз. Фаза, характеризующаяся наличием типичной склероциальной структуры мицелия с короткими утолщенными клетками и обильными включениями жира, связана с образованием эрготалкалоидов.
При культивировании штаммов С/, purpurea и CL paspali на пептонно-маннитной среде отмечено пятикратное увеличение выхода токсинов при повышении концентрации сахара от 5 до 25%.
Растущие клетки и неклеточные экстракты изучаемого штамма CL purpurea в сапрофитной культуре содержат ферменты, осуществляющие разные пути метаболизма глюкозы. При росте в погруженной культуре на сахарозно-минеральной среде или среде с мочевиной и дрожжевым экстрактом в неклеточных структурах обнаруживаются гексокиназа, глюкозо-б-фосфатдегидрогеназа, дегидрогеназа 6-фосфоглюконовой кислоты, альдолаза, ферменты пентозного цикла (Me Donald и др., 1960). Радиографически установлено относительное значение различных путей метаболизма глюкозы у гриба: 90% глюкозы превращается растущими клетками в результате гликолиза и цикла Кребса, 10% глюкозы усваивается путем пентозо- фосфатного цикла. Ферментативные пути разрушения алкалоидов исследовались при окислении их пероксидазой хрена (Taylor, Shough, 1967), декарбоксилировании меченых триптофана и его производных в молекуле аргоклавина и алимоклавина (Plieninger и др., 1967); выявлены специфические ферментативные реакции гидроксилирования у многих видов грибов (Beliveau, Ramstad, 1966, и др., Оранская, Гончарова, Безбородов, 1969).
Установлена различная потребность гриба в фосфатах для максимального роста мицелия и образования эрготалкалоидов. В процессе роста гриба значительно уменьшается содержание ортофосфата в культуральной жидкости, снижаются образование кислоторастворимых, кислотонерастворимых полифосфатов и использование первых в связи с увеличением содержания РНК (табл. 4).
Таблица 4
Соотношение фосфатов в процессе роста Claviceps purpurea


Фосфаты

Дни инкубации

8

15

20

26

35

Ортофосфат в фильтрате

52*

14

4

1

1

Ортофосфат в мицелии

4

10

9

8

5

Кислоторастворимый полифосфат

22

34

18

17

5

Кислотонерастворимый полифосфат

16

12

22

24

24

РНК

16

20

48

50

65

* В процентах Р04 от экзогенного КН2Р04.

Как видно из табл. 4, в 35-дневной культуре CL purpurea при максимуме образования эрготалкалоидов значительная часть экзогенного фосфата использовалась для образования РНК. Предполагают, что соотношение уровня образования РНК и количества кислотонерастворимых полифосфатов типично для токсинобразующего штамма С/, purpurea. Изучено влияние пуриновых производных и энергетических фосфатов на синтез РНК, образование эрготалкалоидов и содержание фосфатов (Waart, 1960, 1961).
Предложен ряд схем биосинтеза клавиновых алкалоидов и алкалоидов лизергиновых кислот. В опытах с меченым а-триптофаном по94 казано, что он является предшественником лизергиновой кислоты. Грегер (Groger et al., 1961, 1964, 1966) показал, что триптофан является предшественником клавиновых алкалоидов у клавинобразующих штаммов CL purpurea в сапрофитной культуре. Последовательность их биосинтеза идет по схеме: триптофан элимоклавин хеноклавин -> агроклавин элимоклавин производные лизергиновой кислоты.
Тэйлор и Рэмстед (Taylor, Ramstad, 1960) нашли, что мевалоновая кислота служит предшественником изо-изо-пентениловой части лизергиновой кислоты.
Плинингер (Plieninger, 1965) считает, что биосинтез эрготоксинов осуществляется по следующей схеме: агроклавин элимоклавин лизергиновая кислота -> эрготалкалоиды.
Костаньоли и Мэнтл (Costahgnoli, Mantle, 1966) исследовали пути биосинтеза карбиноламидной боковой цепи — оксиэтиламида лизергиновой кислоты, имеющей структурное сходство с пептидными боковыми цепями алкалоидов типа эрготамина. В опытах авторов алкалоид путем пиролиза превращался в ацетальдегид и амид лизергиновой кислоты; было показано, что из многих веществ, входящих в молекулу алкалоида, только аланин и пируват в значительной степени включались в боковую цепь (табл. 5).
Таблица 5
Включение радиоактивных веществ в молекулу а-оксиэтиламида лизергиновой кислоты


Соединение

Процент включения в алкалоиды

Процент включения в боковую цепь

L-Аланин-С14

3,75

41,3

Пируват-2-С14

1,61

38,9

DL-Серин-З-С14

1,85

2,4

Формиат-С14

6,64

0,3

Лактон мевалоновой кислоты, -2-С14

1,33

<0,05

Ацетат-1-С14

10,11

<0,05

DL-Триптофан-метилен-С14

24,00

<0,05

Индол-2-С14

5,11

<0,05

Мэйер, Кибал и Комерсова (Mayer, Kybal, Komersova, 1967) исследовали эрготамин и эрготоксинобразующие штаммы гриба. При их росте на среде с меченым аланином в гидролизатах эрготоксина значительная часть радиоактивности содержалась в валине и лейцине. Меченый метионин не включался ни в одну из структурных единиц пептидной цепи. Обсуждаются возможные пути синтеза пептидных цепей.



 
« Токсикология полимерных материалов   Трудности диагностики заболеваний сердечно-сосудистой системы »