Начало >> Статьи >> Архивы >> Токсинобразующие микроскопические грибы

Аспергиллотоксикозы - Токсинобразующие микроскопические грибы

Оглавление
Токсинобразующие микроскопические грибы
Морфологическая характеристика грибов
Класс фикомицеты
Класс аскомицеты
Класс базидиомицеты
Несовершенные грибы
Род пенициллий
Род аспергилл
Род стахиботрис
Порядок спородохиальные
Порядок пикнидиальные
Спорынья пурпуровая
Спорынья паспаловая
Пенициллий исландский
Пенициллий красный
Пенициллий крапивный, лимонно-желто-зеленый, зеленоватый
Аспергиллотоксикозы
Аспергиллофумигатотоксикоз
Стахиботриотоксикоз
Спородесмиотоксикоз
Дендродохиотоксикоз
Фузариотоксикозы
Фузариограминеаротоксикоз
Другие токсические микромицеты
Методы культивирования токсических микромицетов
Экология токсинобразующих грибов и меры борьбы
Литература

Aspergillus Mich. — аспергилл аспергиллотоксикозы (aspergillotoxicoses)
Аспергиллотоксикозы человека и сельскохозяйственных животных широко распространены во многих странах мира. Многочисленны сообщения о возникновении энзоотий аспергиллотоксикозов в США, Франции, Англии, Польше, Норвегии, Италии, Индии, Аргентине, Новой Зеландии и других странах мира. Аспергиллотоксикозы отмечены в СССР.
Обсемененность кормов и промышленного сырья аспергиллами — А. fumigatus, А. flavus, А. niger, А. clavatus и др.— вызывает заболевание людей аспергиллозом и аспергиллотоксикозом. Чаще болеют работники лабораторий, элеваторов и складов, солодовщики пивоваренных, спиртовых и других заводов, работники животноводческих ферм и т.д. Многие виды аспергилла описаны как возбудители бронхо- и дермомикозов человека и животных. В последние годы аспергиллозы отмечаются как вторичные инфекции после антибиотикотерапии (Austwick, 1965).
Токсичность и патогенность некоторых видов аспергиллов, поражающих корма и продукты, изучены недостаточно, поэтому взаимосвязь токсинобразования и паразитирования в животном организме не ясна. Известно, что обычно аспергиллозы возникают при ослаблении тканей и организма под влиянием других факторов. Можно думать, что образование токсических метаболитов имеет определенное значение в развитии аспергиллозов. К числу наиболее изученных в последние годы относится аспергиллофлавотоксикоз (афлатоксикоз). Многочисленные данные отечественных и зарубежных авторов свидетельствуют о том, что A. flavus является одним из преобладающих видов грибов, поражающих зерно-фураж, комбикорма и другие виды концентратов (поражение этих субстратов достигает 40—100%).
Оустуик (Austwick, 1965) классифицирует заболевания тепло- и холоднокровных животных, вызываемые видами аспергилла, на три группы:

  1. Микозы (аспергиллозы). Характеризуются поражением живых тканей различных органов путем: а) первичной инфекции — внедрения возбудителя (гриба) в клетки ткани здорового, чувствительного органа; б) вторичной инфекции — внедрение гриба в ткани, пораженные туберкулезом, гистоплазмозом, карциномой и т. д., после ранений, осложнений после антибиотико- и кортикостероидной терапии или в ткани, ослабленные воздействием других факторов.
  2. Аллергия. Возникает от ингаляции конидий или от других контактов с грибом. Проявляется в виде сенной лихорадки, конъюнктивитов, дерматитов, иногда бронхиальной астмы.
  3. Аспергиллотоксикозы. Возникают после воздействия токсических метаболитов, образуемых в продуктах или кормах, пораженных грибом.

Микозы и аллергия относятся к заболеваниям, возникающим, главным образом, респираторным путем, микотоксикозы — к заболеваниям, которые возникают главным образом алиментарным путем.

Aspergillus flavus Link — аспергилл желтый

Аспергиллофлавотоксикоз, афлатоксикоз (Aspergilloflavotoxicosis,
aflatoxicosis)

Вызывает заболевание молодняка птицы, а также других животных.
Токсичность гриба для животных впервые установлена Шило (1940). Изучая действие Aspergillus на организм кроликов и крыс, автор показал, что вытяжки из кормов, зараженных грибом (30-дневные культуры), как и из культуры гриба, выращенной на среде Ролена, обладают токсическим действием. При внутрибрюшинном введении животным исход был летальным в зависимости от дозы и сроков введения; при пероральном введении дозы, вдвое большей, чем при внутрибрюшинном, наблюдалось выраженное токсическое действие, но без летального исхода. Автором отмечена неодинаковая токсичность вытяжек из корма, зараженного А. flavus, и из культуры гриба.
Левитский и Конюкова также отмечали токсичность штаммов A. flavus (1947). Кулик (1957) установил токсическое действие гриба и пораженного им пищевого гороха. Автор показал, что ядовитыми свойствами обладают свободные и связанные липиды гороха, зараженного грибом. Они действуют на конъюнктиву глаза кролика; при пероральном введении кошке возникали рвота, понос, резкий лейкоцитоз; летальная доза свободных липидов составляла 9—11 связанных — 8—9 г/кг. Фракция жирных кислот более токсична, летальная доза 4,5—5 г/кг\ при введении животным меньших доз отмечались признаки выраженного отравления.

Установлена токсичность отдельных штаммов A. flavus, выделенных из заплесневелого корма, вызывавшего заболевание свиней в США (Burnside и др., 1957; Forgacs, Carll, 1962).
Дальнейшее исследование токсических свойств А. flavus связано с изучением заболевания молодняка птицы (индюшат). В 1960 г. на птицефермах в Англии погибло около 100  000 индюшат. У павших животных обнаружены острые гепатические некрозы, связанные с пролиферацией клеток эпителия желчных протоков. Вначале были высказаны предположения о токсическом действии алкалоидов крестовника. Затем выяснилось, что заболевание утят и индюшат вызывалось скармливанием арахисовой муки, импортированной из Бразилии. При кормлении в течение нескольких недель молодых самцов и самок крыс пищей, содержащей 20% токсической арахисовой муки, у животных возникали задержка роста, снижение усвояемости пищи, а при более длительном кормлении — сильные поражения печени. При патологоанатомическом исследовании крыс, убитых через 9 недель после такой диеты, отмечено, что печень сморщена, с многочисленными субкапсул яр ными желтыми фокусными поражениями; у крыс, убитых через 30 недель, печень ненормально увеличена (по весу в два раза больше, чем у контрольных животных), коричнево-желтого цвета, с неправильной узловатой поверхностью, с красными, зеленоватыми цистами и многочисленными желтоватыми фокусными поражениями. После шести месяцев кормления у 9 из 11 крыс обнаружены многочисленные опухоли печени, у двух — с метастазами в легких. Таким образом, установлено, что токсическая арахисовая мука при длительном кормлении карциногенна для крыс (Sargeant и др., 1961).
Из экстрактов токсической муки получено кристаллическое вещество, которое при пероральном введении в дозе 20 мкг вызывало гибель однодневных утят через 24 ч. При хроматографии на бумаге в п-бутаноле и 5%-ной уксусной кислоте оно дает одно пятно с Rf 0,7 и голубую флуоресценцию в ультрафиолетовых лучах. Хлороформный экстракт из культуральной жидкости A. flavus на среде Чапека или при росте на нетоксичном стерильном горохе при хроматографии на бумаге образовывал аналогичное пятно. Полученное вещество также обладало токсическими свойствами, оно было названо афлатоксином.
Несбитт и сотрудники (Nesbitt и др., 1962) провели дальнейшую очистку афлатоксина. При хроматографии на колонке алюминия в хлороформ-метаноле (98,5 : 1,5) получено два пятна в ультрафиолетовых лучах. Одно из них с Rf 0,6 и фиолетово-голубой флуоресценцией названо афлатоксином В; второе, имеющее более низкую величину Rf и зеленую флуоресценцию, названо афлатоксином G.
Токсические метаболиты получали при заражении грибом стерильного зерна гороха и культивировании его на среде Чапека — Докса с добавлением ZnS04. Через 5—7 дней после заражения токсины экстрагировались горячим метанолом, концентрированные экстракты разводились водой, а затем обезжиривались 40—60°-ным петролейным эфиром. После удаления метанола токсин повторно экстрагировался хлороформом. Хлороформный раствор пропускали через колонку силикагеля; флуоресцирующая в ультрафиолетовых лучах фракция досуха испарялась, и остаток перекристаллизовывался из бензола или метанола. Из культуральной жидкости кристаллический токсин получали прямой экстракцией хлороформом и последующей хроматографией на силикагеле.
Смесь токсинов помещалась в аппарат противоточного разделения в систему хлороформ — четыреххлористый углерод — вода — метанол (2 : 2,5 : 1 : 3). Температура плавления афлатоксина В (с разложением) составляет около 270° С, молекулярный вес 312—314, элементарный состав С17Н1206. Спектры поглощения в ультрафиолетовых лучах — максимум 223, 265, 363 ммк, в инфракрасных лучах — 1755 и 1688 см—1. Оптическое вращение раствора афлатоксина в хлороформе = —562 ± 15/с = 0,115. ЛД50 для однодневных утят — менее 20 мкг.
Афлатоксин Q1 в кристаллическом виде получен при повторной кристаллизации. Температура плавления 247—250° С, молекулярный вес 326—328, элементарный состав С17Н1207, максимум поглощения в ультрафиолетовых лучах при 265,363 ммк, в инфракрасных лу-
чах — 1125—1140 см-3 [се] = — 533 ± 5(с = 0,133). ЛД50 для
однодневных утят составляет около 60 мкг.
Ченг и др. (Chang и др., 1963) установили наличие второго токсического вещества — афлатоксина В2, также дающего голубую флуоресценцию в ультрафиолетовых лучах, но отличающегося меньшей токсичностью. При культивировании афлатоксинобразующего штамма А. flavus на стерилизованном зерне пшеницы выход афлатоксина В2 относительно не велик. Авторы считают, что В2 является дигидро-афлатоксином В1 с температурой плавления 286—289°С (разложение); максимум поглощения в ультрафиолетовом спектре — 222, 265, 362 ммк, в инфракрасных лучах — 1760, 1685, 1625, 1600 см-1.
Карнагэн, Хартли и Окелли (Carnaghan, Hartley, Okeolly, 1963) провели сравнительное изучение токсичности, флуоресценции и других свойств афлатоксинов B1, В2, G1, G2. ЛД50 афлатоксинов для однодневных утят: В1 — 18,2, В2 — 84,8, G1 — 39 и G2— 172,5 мкг, т. е. восстановление изолированной двойной связи в концевом дигидрофурановом кольце афлатоксинов В1 и G1 с образованием В1 и G2 снижает их токсичность несколько более, чем в четыре раза (В2 — в 4,66 раза по сравнению с В1, G2 — в 4,4 раза по сравнению с G1).
Химическая природа и строение афлатоксинов В1 и G1 изучены
Acao (Asao и др., 1963, 1965) и другими авторами (Zijden и др., 1962; Chang и др., 1963; Cheung, Sim, 1964). Эти соединения являются производными дигидрофурана (рис. 18). Компоненты В2 и G2 представляют собой гидропроизводные соответственно афлатоксинов В1 и G1 по двойной связи в концевом дигидрофурановом кольце.

Строение и токсичность различных афлатоксинов
Рис. 18. Строение и токсичность различных афлатоксинов.

В ряде последующих исследований изучалось токсинообразование штаммов A. flavus разного происхождения. Девис и сотрудники  (Davis, Diener, Eldridge, 1966) показали, что активность образования афлатоксинов и отдельных его компонентов у разных штаммов не одинакова (табл. 10). В опытах авторов грибы культивировались на среде с сахарозой (20%) и дрожжевым экстрактом (2%) в стационарной культуре. В течение 6—8 дней токсин экстрагировался из культуральной жидкости хлороформом и хроматографировался на тонком слое силикагеля (растворитель — 2,5%-ный раствор метанола в хлороформе). Активность определялась визуально по интенсивности флуоресценции в ультрафиолетовых лучах по сравнению со стандартной калибровочной. Показано, что штаммы, выделенные не только из арахиса, но из кукурузы, зерна других злаков и кормов, при культивировании на горохе и синтетической среде имеют различную активность образования афлатоксинов. Отмечен обильный рост гриба и активное образование афлатоксинов (от 10—100 мкг/мл) на углеводной среде с органическим источником азота.
Культуры других видов аспергиллов, выделенных из арахиса (A. amstelodani, A. chevalieri, A. ruber, A. terreus, А. restrictus,
A. candidum, A. microviridocitreus), а также Penicillium citrinum оказались практически нетоксичными для утят. При скармливании им в течение трех недель сухого обезжиренного остатка фильтрата существенной потери в весе не отмечалось, в то же время при скармливании такого же препарата из фильтрата А. flavus животные значительно теряли в весе и гибли на четвертый — седьмой день. При исследовании обнаружились характерные патологоанатомические изменения органов.
Таблица 10 Образование афлатоксинов разными штаммами A. flavus


Номера
штаммов

Вес мицелия, г/100 мл

Афлатоксины
В1

Афлотоксины G1

мг/100 мл
Общее количество (B1 + G1)

2

2,6

3,8

3,2

7,0

6

4,6

17,1

14,4

31,5

8

3,7

15,2

1,4

16,6

2999

4,3

24,7

20,8

45,5

15517

5,3

28,5

24,0

52,5

15 548

6,5

34,2

28,8

63,0

15 547

2,1

0,1

0,1

0,20

Таким образом, приведенные данные показывают, что афлатоксины являются одними из характерных метаболитов A. flavus.
Шотуэлл и др. (Shotwell и др., 1966) изучали образование афлатоксинов активным штаммом A. flavus при его культивировании на стерильном зерне риса. После экстракции хлороформом зараженного зерна неочищенные препараты афлатоксина осаждали гексаном, хроматографией на колонке силикагеля, очищенные компоненты — хроматографией на тонком слое силикагеля. Изучаемый авторами штамм A. flavus образовывал преимущественно афлатоксин В1, максимальное количество которого отмечалось на пятый день роста гриба и оставалось на высоком уровне до 12-дневного возраста. Максимальное содержание афлатоксина G1 отмечено только на четвертый- пятый день культивирования гриба (табл. 11). Выход неочищенного токсина в восьми ферментациях (в миллиграммах на грамм субстрата) составлял: 1,0; 0,16; 0,8; 1,11; 1,1; 0,74; 1,19; 0,88. Соотношение компонентов В1, В2, G1, G2 равнялось 1,0 : 0,15 : 0,22 : 0,02, т. е. в среднем выход неочищенного токсина составлял 1 мг на 1 г зерна с преимущественным образованием афлатоксина В1.
Шредер (Schroeder, 1966) показал, что кукурузный экстракт стимулирует рост мицелия и образование афлатоксинов A. flavus (рис. 19). Суммарное образование афлатоксинов на среде Чапека увеличивалось пропорционально повышению концентрации кукурузного экстракта: максимум токсинобразования совпадал с максимумом роста мицелия гриба, но затем снижение содержания токсина наступало быстрее, чем лизис мицелия.
Таблица 11
Образование афлатоксинов Aspergillus flavus при культивировании на зерне риса


Дни инкубации

Афлатоксины, мкг/г субстрата

В1

В2

G1

G2

Общий
выход

2

184

20

64

10

278

4

760

167

458

56

1,441

5

950

143

356

62

1,511

6

634

100

160

20

914

7

760

111

180

25

1,076

9

476

100

80

25

681

10

634

125

183

22

964

11

476

100

142

56

774

12

762

166

160

25

1,113

Крог и др. (Krogh и др., 1966) исследовали образование афлатоксинов у восьми штаммов Л. flavus, выделенных из грубых и концентрированных кормов, вызывавших в Дании микотоксикозоподобные заболевания различных сельскохозяйственных животных (коров, телят, свиней, лошадей).

Рис. 19. Влияние продолжительности культивирования (а) и концентрации кукурузного экстракта (б) на активность образования афлатоксинов
Aspergillus flavus на среде Чапека.
Авторы показали, что изученные штаммы A. flavus при культивировании на зерне ржи и ячменя образуют комплекс афлатоксиноподобных веществ, более или менее четко вы
являемых хроматографически, по почти не дающих положительного токсического эффекта в опытах с утятами.
Из восьми изученных штаммов только три обладали токсичностью, менее выраженной по сравнению с эталонным, образующим афлатоксин штаммом британского происхождения. Не установлена зависимость между антибиотическими и токсическими свойствами исследованных культур.

Таблица 12
Образование афлатоксинов и коевой кислоты штаммами различных видов Aspergillus и Penicllliutn
Образование афлатоксинов и коевой кислоты штаммами
При сравнительном анализе образования афлатоксина и коевой кислоты различными штаммами видов аспергилла и пенициллия Пэрриш и др. (Parrish и др., 1966) также нашли, что образование афлатоксина характерно главным образом для культур A. flavus, A. parasiticus, в то время как коевая кислота обнаружена у всех изучавшихся штаммов A. flavus (92 из 93), а также у некоторых штаммов других видов аспергилла и пенициллия (табл. 12). Грибы культивировались на глюкозо-аммиачнонитратной среде с микроэлементами; разделение коевой кислоты и афлатоксинов в хлороформных экстрактах производилось хроматографией на силикагеле в системе растворителей бензол-уксусная кислота — вода (3:1: 1).
Ныреди и Бондар (Nyirody, Bondar, 1966) при изучении микрофлоры свыше 300 образцов кормов установили, что 118 из них поражены A. flavus. При культивировании выделенных культур у 64 штаммов отмечено активное образование афлатоксина.
Рэби и Смэлли (Rabie, Smalley, 1965) установили, что оптимальная температура для роста A. flavus (в их опытах 18° С) не совпадает с оптимальной температурой для образования афлатоксинов (24° С).

Шайндлер и др. (Shindler, Palmer, Eisenberg, 1967) изучали влияние температуры (от 2 до 52° С) на рост и образование афлатоксина В2 двумя изолятами А. flavus. Максимальный рост мицелия на пятый день отмечен при 29 и 35° С, максимум образования афлатоксина — при 24° С; не наблюдалось (в этот же срок) образования афлатоксина при температуре ниже 18° и выше 35° С. Не отмечено в течение 12 недель афлатоксина у изолятов A. flavus, растущих при температуре 2,7 и 41° С; оба изолята, растущие при 13° С, образовывали афлатоксин через три недели. Авторы выявили различную окраску хлороформных экстрактов культуральной жидкости изолятов, растущих при неодинаковой температуре, и ее связь с активностью образования афлатоксинов. В зависимости от штамма и температуры культивирования соотношение между образованием отдельных компонентов афлатоксинов В1 и G1 меняется.
Аугустинавичюс (1965—1967) установил токсичность 16 штаммов А. flavus, выделенных из кормов в Литовской ССР, а также из почвы, зерна хлебных злаков в различных географических зонах СССР. При проведении кожной пробы и на простейших наибольшая токсичность проявляется при культивировании гриба на стерильном горохе, среде Чапека — Докса с сульфатом цинка. Вещества, элюированные из зон эфирных, хлороформных и других экстрактов, дающих сине-голубую флуоресценцию с Rf 0,5—0,7, обладали токсическим и дермонекротическим действием. Штаммы A. flavus вызывают также характерные патологоанатомические изменения органов, в первую очередь легких и печени. В зависимости от свойств штамма заболевание проявляется с более выраженными признаками флавоаспергиллоза или аспергиллофлавотоксикоза.
Японские авторы изучали образование афлатоксина у 214 штаммов Aspergillus различного происхождения и продолжительности культивирования. Наличие токсина определялось по флуоресценции плотной среды (обратной стороны колонии гриба), флуорометрией и тонкослойной хроматографией в геле экстрактов культуральной жидкости. Отмечено наличие многих других веществ, не идентичных афлатоксину, и несколько одиночных штаммов, образующих афлатоксин (Muracami, Takase, Ishii, 1967).
Как уже упоминалось, одним из наиболее важных биологических свойств афлатоксинов является карциногенное действие, проявляющееся при низкой дозе токсина в хронических опытах (Lancaster, Genkins, Philp, 1961). У крыс через 30 недель после содержания на диете с 20% арахиса, зараженного A. flavus, печень весила вдвое больше, чем в норме, имела коричнево-желтую неправильную, узловатую поверхность, красные и зеленоватые цисты и многочисленные желтоватые фокусные поражения. Узелки опухоли печени представляли собой плотные желтоватые гепатомы долек, наполненные кровью и желчью цисты; желтые фокусированные поражения отмечались и в более ранний срок. Клубочки на оболочке почек наполнены гомогенной эозинофильной массой; бугорки состоят из удлиненных клеток с большими вазикулярными ядрами и обильной вакуолизированной протоплазмой. У некоторых животных на срезах легких обнаружены инфильтрации с анапластической гематомой клеток, митозы и другие изменения. Наличие опухолей в печени при отсутствии циррозов, некрозов клеток или клеточной инфильтрации позволило считать, что токсин действует непосредственно на клетки.
Карнаган (Carnaghan, 1965) изучал карциногенное влияние корма, зараженного A. flavus, на утят, которые наиболее чувствительны к афлатоксинам. В опытах исследовались семидневные утята, содержащиеся на нормальной диете с добавлением 0,5% токсической арахисовой муки (около 7 мкг афлатоксина В1). Через 14 месяцев после начала скармливания у 8 из 11 птиц были обнаружены опухоли печени.
Под влиянием афлатоксинов В1 и G1 у белых мышей развиваются первичные опухоли не только в печени, но и в мезентерии, желудке, легких, полости рта и слюнной железе, которые морфологически определяются как саркомы и фибросаркомы. Образуемые под воздействием афлатоксинов опухоли приживались при перевивках другим животным (Barnes, Butler, 1964; Newborne, Carlton, Wogan, 1964).
Образование гепатом у форели отмечено при скармливании ей в течение 6—7 месяцев неочищенных препаратов афлатоксина, полученных из зерна пшеницы, зараженного А. flavus. При введении в диету чистого афлатоксина В1 или G2 через 10—15 дней возникал острый токсикоз с летальным исходом (Ashley, Halver, Wogan, 1964; Ashley и др., 1965). Молодые лососи были в 10 раз устойчивее. Многие виды рыб переносят высокие дозы афлатоксина в корме (Halver, 1965).
Карцинома поджелудочной железы возникала у крыс, содержащихся на диете с афлатоксином (Barnes, Butler, 1964). Ряд авторов указывает, что при интрамуральной инъекции крысам карциногенных полициклических углеводородов возникают незначительные поражения карциномой, но при пероральном введении этих веществ результат был отрицательный. При введении через рот других карциногенных веществ (N, N, 1, 2,7-флуоренил-бис-ацетамида, N-нитрозо-1М-метилуретана) отмечены случаи аденокарциномы желудка у крыс.
В опытах с крысами пятинедельного возраста через 66—76 недель после начала кормления токсической арахисовой мукой в двух случаях авторы наблюдали возникновение типичной аденокарциномы желудка; в одном случае отмечены разросшиеся метастазы, гистологически идентичные аденокарциноме. В последующих опытах шесть самцов крыс в возрасте одного года получали токсическую арахисовую муку с 3—4 мкг токсина (50% диеты). У трех из пяти подопытных животных, проживших более 39 недель, обнаружена анапластическая гепатоцеллюлярная карцинома; у одного из этих животных впоследствии образовалась аденокарцинома прямой кишки, у другого — аденокарцинома желудка. В опытах с молодыми крысами, получавшими в течение трех недель диету с токсическим кормом, а затем нормальную, у одного из шести животных через 106 недель после содержания на обычной диете диагностирована карцино-саркома желудка.
Таким образом, афлатоксины представляют интерес для изучения и, по-видимому, имеют этиологическое значение при возникновении карцином печени у человека в географических районах, где возможно длительное употребление слаботоксических продуктов из арахиса.
Проведено изучение токсичности и карциногенности афлатоксинов на утятах с целью установления дозы, которая, не вызывая гибели животных в эксперименте, позволяла бы воспроизводить характерные патологические признаки (Wogan, 1965). Патогистологическим анализом показано, что степень гиперплазии эпителия желчных протоков, поражения клеток паренхимы печени и прирост веса животного зависят от дозы токсина.
Испытаны дозы 2—31,25 мкг афлатоксина В1 на одного утенка, вводимые перорально в течение пяти дней; на седьмой день птиц забивали и производилось вскрытие. Согласно данным опытов, суточная доза 1,56 мкг на животное вызывает депрессию роста и атрофию печени утят, но все применявшиеся дозы в различной степени вызывали пролиферацию клеток эпителия желчных протоков, которая тем больше, чем сильнее общее поражение печени (т. е. чем выше доза). Наиболее четкие изменения в метаболизме глюкозы — уменьшение содержания гликогена, увеличение липидов — отмечены при дозе афлатоксина В1, равной 6 мкг на 100 г живого веса.
Афлатоксин В1 нарушает метаболические функции печени. При его введении утятам в течение пяти дней в дозе 60 мкг/кг значительно уменьшалось содержание гликогена и витамина А, повышалось содержание липидов, игибировалось включение глюкозы и лейцина в мышцы (Shank, Wogan, 1964; Allcroft, 1965).
Афлатоксин В1 ингибирует многие ферменты клеток печени и клеточных структур, снижает активность триптофанпирролазы и тирозинтрансаминазы у крыс, которым одновременно вводили триптофан и гидрокортизон (Wogan, Friedmann, 1965; Pong, Wogan. Степень ингибиции зависит от дозы и продолжительности действия. Установлено нарушение метаболизма ядерной РНК под влиянием афлатоксина В1: при введении крысам 5 мг/кг (ЛД50) ингибировалось включение цитидина на 62—73%, изменялось отношение РНК : ДНК в клетках печени на 23—28% (Friedmann, Wogan, 1966).
Аналогичные данные о влиянии афлатоксина Вх на активность ДНК-полимеразы, синтез белка (ДНК), образование нитчатых форм отмечены у Е. coli (Wragg, Ross, Legator, 1967).
Уже через час после введения афлатоксина в клетках печени обезьян и крыс отмечалось образование капсул вокруг ядер, ингибиция митоза в клетках, в гомогенатах печени под влиянием афлатоксина уменьшалось соотношение РНК и ДНК (Svoboda, 1966; Rogers, Newborne, 1967). У животных, больных циррозом печени, при введении афлатоксина наблюдается усиленное размножение циррозных клеток (Lovenstein, Lec, 1966).
Токсическое действие афлатоксина на клетки печени объясняют его способностью химически связывать ДНК, ингибировать образование передатчиков (мессенджеров), несущих генетическую информацию для синтеза белка. Снижение синтеза белка в пораженных клетках наступает при коротком периоде воздействия токсина (через 15 мин), хотя гибели клеток не наблюдается (Clifford, Rees, Stevens, 1967). Выяснены другие биологические свойства афлатоксинов. В низких концентрациях они разрушают культивируемые клетки почек теленка (Juhasz, Greczi, 1964), вызывают вакуолизацию и разрушение клеток почек обезьян, ингибируют включение С14-лейцина в белки препаратов печени (Smith, 1965), подавляют митозы диплоидных и гетероплоидных клеток в культуре ткани легких эмбриона человека, ингибируют рост клеток и синтез ДНК.
Экстракты из арахиса, зараженного A. flavus, проявляли высокую цитотоксичность при введении в однослойную культуру тканей почки теленка; через 48 ч в пораженных клетках наблюдалось разрушение цитоплазмы и ядра при концентрации афлатоксина 0,1 — 0,5 мкг/мл. В указанных опытах Гюхаз и Грекзи афлатоксины из токсического арахиса экстрагировались метанолом, очищались с помощью хлороформа и воды, затем метанолом и петролейным эфиром, а также хроматографией на бумаге с применением растворителя из смеси n-бутанола, уксусной кислоты и воды (4:1 : 5). В опытах авторов токсичностью для клеток почки теленка обладала не содержащая афлатоксинов петролейная фракция (т. е. липиды), она составляла 0,1 токсичности метанольной фракции (афлатоксинсодержащей). Элюаты пятен с Rf выше, чем у афлатоксинов, также были токсичны. Авторы считают, что кроме афлатоксинов в токсическом арахисе имеются еще и другие цитотоксические метаболиты.
Установлена чувствительность куриных эмбрионов к афлатоксинам. Испытывались чистые препараты афлатоксинов B1, G1, экстракты из токсинобразующей культуры A. flavus, афлатоксин В1, полученный из неочищенного препарата при помощи тонкослойной хроматографии. В качестве контроля вводились соответствующие экстракты из непораженного грибом арахиса и изделий из него. Растворы вводились в яйца кур породы Белый Леггорн перед инкубацией. Введение афлатоксина производилось двумя путями — через желточный мешок или воздушную камеру. Токсин вводился в растворе пропилен-гликоля в количестве не более 0,04—0,05 мл; в течение четырех дней инкубации отбирались все нежизнеспособные эмбрионы. Установлено, что токсичность афлатоксина для куриных эмбрионов зависит от способа введения токсина: ЛД50 соответствует 0,25 мкг при введении через воздушную камеру и 0,048 мкг — при введении через желточный мешок (рис. 20).
При высоких дозах афлатоксина В1 большинство эмбрионов гибнет на 8—10-й день, при более низких — до 21-го дня. Афлатоксин G1 значительно менее токсичен: его введение в желточный мешок в дозе 1 мкг вызывало гибель только 60% эмбрионов, в дозе 2 мкг — 90%. У эмбрионов, погибших от введения афлатоксина В1, в большинстве случаев отмечались резкое торможение роста, эдема, геморрагии, недоразвитие мезенцефалона (у эмбрионов, погибших до седьмого дня); поверхность печени была испещрена и гранулирована. Остальные компоненты афлатоксинов (В2 и G2) были нетоксичны для куриных эмбрионов (Verrett, Marliac, Laughlin, 1964).

Рис. 21. Влияние афлатоксина B1 на количество клеток в культуре тканей легких эмбриона человека (концентрация от 0,5 до 5,0 мкг/мл).

Рис. 20. Токсичность афлатоксина В, для куриных эмбрионов (смертность на 21-й день; 1 — инфекция через желточный мешок, 2 — через воздушную камеру).
Легатор, Уайсроу (Legator, Withrow, 1964) изучали влияние двух комплексных препаратов афлатоксина, содержащих 15% В19 9% Gl9 менее чем 1 % В2 и G2 (первый) и 25% В1, 17% G1 и 2—5% В2 и G2 (второй), а также кристаллического афлатоксина В1 на митозы культивируемых клеток легкого эмбриона человека. Афлатоксин в растворителе добавлялся в среду. Подавление митозов гетероплоидных клеток на 50—55% отмечено при концентрации 0,5 мкг/мл афлатоксина, диплоидных клеток на 50% против контроля — при концентрации 0,1 мкг/мл (рис. 21). Авторы считают, что по степени подавления митозов в течение 24 ч можно определить 0,01 мкг/мл афлатоксина в исследуемом материале.
Афлатоксин в зависимости от концентрации проявлял ингибирующее влияние на рост клеток гетероплоидной культуры легких эмбриона человека, процессы синтеза белка, вызывал изменение их морфологии. При низкой концентрации (0,05; 0,1 мкг/мл) через 48 и до 93 ч после добавления число клеток повышалось против контроля, но при внесении 5 мкг/мл отмечалось резкое подавление роста, снижение содержания белка; при концентрации афлатоксина 0,5 мкг/мл перечисленные симптомы особенно резко проявлялись через 65—93 ч после введения (рис. 22—24). Радиографическим методом с меченым тимидином изучалось влияние афлатоксина на синтез ДНК. Клетки инкубировались с токсином в течение 16 ч, после этого 20 мин выдерживались в растворе меченого тимидина в концентрации 0,5 мкг/мл, затем среда удалялась и заменялась равной смесью свежей и инкубационной среды; через 12 ч клетки отделялись, и после соответствующей обработки определялось число меченых клеток не менее чем в 1000 просмотренных в каждом варианте опыта. Синтез ДНК ингибировался на 40% при концентрации афлатоксина 1 мкг/мл, при этом неочищенный препарат был более эффективен, чем кристаллический. Ингибирующее действие зависит от времени инкубации клеток с токсином (см. рис. 23). Морфологические изменения клеток культуры легкого эмбриона человека выражаются в образовании гигантских клеток, число которых при концентрации токсина 0,1 мкг/мл через 12—18 ч увеличилось почти вдвое по сравнению с контролем (0,3%). Установленные биологические свойства афлатоксина — подавление митозов, ингибиция биосинтеза ДНК, сверхнормальное образование гигантских клеток, карциногенность — приводят автора к убеждению, что афлатоксины близки к хорошо изученным алкилирующим веществам, являющимся мутагенными и антинеобластическими агентами.
Таблица 13
Токсичность афлатоксина (через 48 ч) в клеточных культурах

 

Афлатоксин В1, мкг/мл

Культура клеток

ТД 50

ид50

ЛД50

Печень человека (нормальная ткань)

1,0

1,0—1,75

 

Не—La (карциномы человека)

5,0-7,0

5,0—7,0

Эмбрион утки

1,0

1,0

Эмбрион курицы

5

5,0

Эмбрионированные яйца утки

0,5—1,0

» » курицы

--

2,0—5,0

Примечание: ТД50 — токсическая доза (концентрация токсина), вызывающая поражение от 25—50% клеток; ИД50 — ингибирующая доза, вызывающая снижение белка клеток на 50%; ЛД60 — летальная доза, вызывающая гибель 50% эмбрионов уток и куриц.
Афлатоксин в очень низкой концентрации индуцирует бактериофаг у некоторых лизогенных культур (Legator, 1966) (рис. 25).
Установлено токсическое действие афлатоксина В2 на клетки культуры разных тканей. Оно определялось по морфологическим изменениям, числу клеток в культуре, содержанию белка и нуклеиновых кислот. Наиболее чувствительными к токсину оказались клетки эмбриона утки, затем печени человека, эмбриона курицы, клетки Не—La (табл. 13).

Рис. 22. Влияние афлатоксина В1 на митозы в зависимости от концентрации (а) и времени действия (б) (1 — среднее трех определений, 2 — индивидуальное определение).

Влияние афлатоксина В1 на биосинтез белка
Рис. 23. Влияние афлатоксина В1 на биосинтез белка в культуре легких эмбриона человека:
1 — контроль, 2 — опыт (0,5 мкг/мл токсина).

Ингибиция включения Н3-тимидина в ДНК
Рис. 24. Ингибиция включения Н3-тимидина в ДНК в зависимости от концентрации афлатоксина (а) и времени действия (б):
1 — контроль, 2 — неочищенный афлатоксин 1 мкг/мл, 3—5 — афлатоксин В1 в концентрации 1,0; 0,1; 0,05 мкг/мл.

Первоначальное действие токсина проявляется в ингибиции клеточного роста, увеличении грануляции, округлении, наконец, свисании клеток со стекла. Минимальная доза, при которой проявляются эти признаки не менее чем у 25% клеток, составляет: для печени и эмбриона утки — 0,1, эмбриона курицы—1—5, клеток Не—La—5 мкг/мл. Чувствительность клеток эмбрионов утки в 4—5 раз выше, чем клеток эмбрионов курицы. Уменьшение числа клеток (т. е. ингибиция их деления) и повышение содержания белка, ДНК и РНК в пересчете на живые клетки подтверждает, по мнению авторов, возможность их удлинения (рис. 26) (Gabliks, Schaeffer, Friedman, Wogan, 1965).

Рис. 25. Влияние афлатоксина B1 на индукцию фага у Staphylococcus aureus (М204). На оси ординат — индекс индукции — число фаговых пятен в опыте по сравнению с негативным контролем.
К афлатоксину чувствительны многие виды животных (утята, индюшата, куры, цыплята, поросята, телята, коровы, собаки, хорьки, обезьяны).

Влияние афлатоксина B1 на рост
Рис. 26. Влияние афлатоксина B1 на рост (количество клеток) Flavobacterium aurantiacum, количество белка, РНК и ДНК в пересчете на культуру (а) и на живую клетку (б):
1 — контроль (инкубация в течение 30 ч), 2-4 - концентрации афлатоксина соответственно 0,1; 1,0; 5,0 мкг/мл.
При скармливании афлатоксина обезьянам резус по 1 мг в день у животных через две недели развились апатия, анорексия, и через 4 недели они погибли. У крупного рогатого скота скармливание зараженного А. flavus корма вызывало депрессию, резкое снижение удоев, потерю аппетита, понос; при вскрытии отмечены подкожные кровоизлияния, асциты, гиперплазия клеток желчных протоков, жировая дегенерация, некрозы и фиброзы печени, отек почек и альбуминоидная дегенерация эпителия почечных канальцев. Для овец, коз и кроликов токсичными оказались штаммы, выделенные из жмыхов и силоса. Относительная устойчивость характерна для крыс, белых мышей, овец.
Эпизоотии токсических гепатитов у свиней в южных штатах США связаны с наличием в кормах афлатоксинообразующих штаммов А. flavus. При экспериментальном афлатоксикозе или добавлении в корм кристаллического токсина возникало заболевание, сходное с наблюдаемым в естественных условиях (Wilson и др., 1967).
Степень патологического действия зависит от дозы токсина. В опытах Гинтц и сотрудников у свиней 12—14-недельного возраста, получавших низкие дозы афлатоксина В1, отмечены незначительные изменения веса и снижение степени переваримости корма; при дозе, вызвавшей гибель животных, отмечалась сильно выраженная дегенерация печени (Hintz, Booth, 1967). При экспериментальном афлатоксикозе показано, что гибель крыс и интенсивность образования опухолей печени или других органов зависит от содержания белков в диете (Madhavan, Gopalan, 1968).
В связи с установлением токсичности афлатоксинов не только для утят, но и для других животных проведена серия интересных исследований судьбы афлатоксина в организме, прежде всего в связи с выяснением вопроса: является ли токсичным молоко коров, содержащихся на диете с афлатоксин содержащим арахисом?
Показано, что экстракты молока коров, которых кормили афлатоксинсодержащей арахисовой мукой, вызывают поражение печени у однодневных утят, аналогичное наблюдаемому при введении им афлатоксина или токсической арахисовой муки. Хроматографией на тонком слое силикагеля афлатоксин В1 в токсическом экстракте из молока не обнаружен, но найдено вещество, названное «молочным» афлатоксином, «М»-токсином, отличное от афлатоксина В1. В связи с этим были проведены исследования путей превращения афлатоксина В1 в «молочный» токсин у коров и других млекопитающих.
Исследовались 2 кг сухого молока коров, которым в рационе скармливали 15% высокотоксической арахисовой муки. Экстракцию токсического молока коров, питавшихся травой и арахисом, зараженным A. flavus, проводили метанолом и хлороформом; после удаления из экстрактов растворителей осадок вновь растворяли в 85%-ном метаноле, обезжиривали петролейным эфиром и 40%-ный водно-метаноловый раствор экстрагировали хлороформом. Разделение производили хроматографией на тонком слое силикагеля (0,3 мм). При проявлении пластинок в ультрафиолетовых лучах выявлены значительные различия пятен экстрактов из токсического и нетоксического молока. В первом случае отмечено фиолетовое четко флуоресцирующее пятно с Rf 0,4, выше которого располагаются пятна с желто-зеленой флуоресценцией и едва заметное пятно, относящееся к афлатоксину В1; во втором случае — пятна с низким Rf, зеленовато-желтой и желтой флуоресценцией. Экстракты из арахиса, зараженного A. flavus, давали четкие пятна, соответствующие афлатоксинам В1, G1, а также фиолетовое пятно, аналогичное обнаруженному в токсичном молоке (рис. 27). Экстракты из токсического молока были разделены хроматографией на колонках силикагеля; при проявлении колонок установлены фракции, аналогичные полученным при хроматографии на тонком слое.
афлатоксины
Рис. 27. Тонкослойная хроматография афлатоксинов:
А — экстракты молока (1 — чистый афлатоксин В1, 2 — экстракт коровьего молока, 3 — экстракт токсического коровьего молока, 4 — экстракт культуры Л. flavus, 5 — экстракт молока крыс, 6 — экстракт токсического молока крыс).
Б — экстракты печени, почек и мочи овец (1 — смесь афлатоксинов B1 и G1, 2—3 — экстракты печени и почек овец, получавших афлатоксины, 4—5 — экстракты мочи овец до и после получения афлатоксинов. 6 — экстракт токсического коровьего молока — контроль). Флуоресценция: ф — фиолетовый, г — голубой, з — зеленый, ж — желтый, с-ф — сине-фиолетовый, с-з — сине-зеленый, ж-з — желто-зеленый.
Испытание на токсичность для однодневных утят показало, что только фракция, дающая фиолетовое пятно с Rf 0,4, обладает токсичностью и вызывает характерное разрастание клеток эпителия желчных протоков печени, т. е., что токсичен «молочный» афлатоксин, идентичный обнаруженному в незначительном количестве в экстрактах из арахиса, зараженного A. flavus (табл. 14). Опыты на лактирующих крысах, которым вводили чистый афлатоксин В1 или скармливали арахис, зараженный A. flavus, показали, что в организме животных афлатоксин В1 превращается в «молочный» токсин (Jongh и др., 1962). Батлер и Клайфорд (Butler,Clifford, 1965) изучали метаболизм афлатоксина B1 у относительно устойчивых к нему животных — крыс и овец. У крыс, относительно устойчивых в острых опытах, при однократном введении афлатоксина В1 отмечаются стойкие характерные поражения печени, развивающиеся гораздо медленнее, чем при введении карциногенных веществ — четыреххлористого углерода или диметилнитрозамина.

Токсичность для утят хроматографических фракций экстрактов из
токсического коровьего молока

Примечание. В каждой серии опыта было четверо однодневных утят (обозначены цифрами), которые ежедневно в течение пяти дней получали экстракт, эквивалентный 3 л молока.

Некрозы появляются впервые через 36—48 ч и прогрессируют в течение месяца; регенерация паренхимы печени протекает также медленно, и этот период характеризуется пролиферацией желчных протоков и гиперхроматией паренхиматозных клеток. При однократных пероральном и внутрибрюшинном введениях афлатоксина В1 самцам крыс в дозе ЛД50 он обнаруживается через 0,5—1 ч, через 6 ч содержание афлатоксина В1 снижалось, а через 24 ч после введения отмечены только следы. Через 2 ч на хроматограмме четко обнаруживалось второе пятно, обладающее синефиолетовой флуоресценцией с Rf 0,2; оно уменьшалось через 6 ч, и только следы его обнаруживались через 24 ч. Аналогичные компоненты найдены в печеночной и общей крови. Через неделю после введения афлатоксина В1 последний, как и второй компонент, в экстрактах печени крыс не обнаруживался. Таким образом, было показано, что в печени и крови происходит инактивация афлатоксина В1, возможно частичная, и появляется новый токсический компонент, аналогичный «молочному» токсину. Авторы предполагают, что афлатоксин В1 и продукты его превращения могут вызывать необратимые изменения в тканях печени крыс, наступающие в последующий период после их полного исчезновения в печени (через 24 ч) и гистологически обнаруживаются только после этого времени. При однократном внутрибрюшинном введении овцам комплексного препарата через 2 ч в экстрактах печени были обнаружены афлатоксины В1, G1 и «М»-токсин. В экстрактах из почек интенсивность флуоресценции пятен В1 и G1 на хроматограмме меньше, чем пятна «М»-токсина. Экстракты из мочи через один и два часа после введения афлатоксина давали интенсивную флуоресценцию пятна, соответствующего «М»-токсину, слабую — афлатоксинов G1 и В1. Авторы предлагают использовать метод обнаружения «М»-афлатоксина в моче для диагностических целей.
Антюков (1965—1966) установил, что при скармливании поросятам пищи, зараженной A. flavus, у них до 10%уменьшается количество протромбина, до 15%— гамма-глобулина и до 12% — альбуминов в сыворотке крови. Автор считает, что гриб влияет на снижение белкообразовательной функции печени, резистентность организма и выработку антител (отмечено резкое снижение, до 77%, фагоцитарной активности лейкоцитов). Предполагается, что токсические вещества A. flavus вначале активизируют моторно-секреторную функцию организма (через 1—3 дня после введения), затем угнетают и вызывают резкую атонию кишечника.

Афлатоксин В1 при введении мышам подавляет плазмоцитарную реакцию лимфатических узлов и селезенки и резко угнетает образование антител (Галикеев, Раипов, Маняшева, 1968).
Афлатоксин вызывает патологические изменения в хромосомах белых мышей (Lorna, 1965), проявляет фитотоксические свойства, вызывая альбинизм растений (Schoental, White, 1965).
Таблица 15
Разрушение афлатоксина В1 покоящимися клетками Flavobacterium aurantiacum


Время инкубации бактерий, ч

Исходная концентрация токсина, мкг/50 мл

Бактерии предварительно росли в среде без токсина

Бактерии предварительно росли в среде с токсином,
250 мкг/50 мл

количество разрушенного токсина, мкг/50 мл

%

количество разрушенного токсина, мкг/50 мл

%

 

170

30

18

30

18

16

335

55

16

105

31

 

670

110

16

110

16

 

3350

350

10

400

12

 

170

100

59

70

41

 

335

135

40

135

40

41

670

110

16

 

3350

350

10

750

22

 

170

170

100

170

100

88

335

295

88

265

79

 

670

340

51

340

51

 

3350

750

22

750

22

 

170

170

100

170

100

112

335

305

91

175

82

 

670

450

67

400

60

 

3350

550

16

125

37

Примечание. Густота бактериальной взвеси 10» мл.

Действие неочищенного афлатоксина изучалось на 329 различных микроорганизмах. Препарат афлатоксина, экстрагированный хлороформом из зараженного А. flavus риса и осажденный гексадеканом, содержал такие компоненты: В1 — 23,8, В2 — 6,3, G2 — 0,9% (Вагmeister,Hesseltine, 1966). Поданным авторов, 35 исследованных видов мицелиальных грибов, относящиеся к 16 родам, оказались устойчивыми к афлатоксину в дозе 30 мкг/мл  дрожжи — к концентрации 40 мкг/мл; наиболее чувствительными были штаммы В. brevis (их рост ингибировался при концентрации 10 мкг/мл, в то время как рост некоторых штаммов В. megatherium — при 15 мкг/мл).

Рис. 29. Поглощение афлатоксина B1 автоклавированными клетками Flavobacterium aurantiacum.
Циглер и др. (Ciegler и др., 1966) исследовали около 1000 культур различных микроорганизмов—дрожжей, мицелиальных грибов и их спор, актиномицетов, водорослей и бактерий. Изученные культуры проявляли значительную устойчивость к афлатоксинам В1 и G1 хорошо росли на содержащих его средах, но не обнаруживали характерных флуоресцирующих зон вокруг колоний.

Рис. 28. Угнетение роста Flavobacterium aurantiacum афлатоксином В1:
1 — контроль, 2 —3 — концентрации 10 и 15 мкг/мл.
Афлатоксин разрушался большинством штаммов видов Pseudomonas и не разрушался  изученными штаммами дрожжей, актиномицетов, водорослей. Из микроскопических грибов афлатоксин изредка инактивировался представителями серии A. niger (после сравнительно длительного периода инкубации — 11 дней). В последнем случае афлатоксины В1 и G1 не обнаруживаются, а выявляется новое, с более интенсивной голубой флуоресценцией вещество с Rf 0,25. У Penicillium raciborskii после роста на среде с афлатоксином В1 на хроматограмме проявлялось вещество с Rf, близким к Rf афлатоксина В2. Споры большинства видов грибов не специфически адсорбировали афлатоксин, после обработки хлороформом он быстро снимался, но частично превращался конидиями A. terreus, A. flavus и A. luchinesis в серию соединений, обладающих светло-голубой флуоресценцией. Афлатоксин разрушается только штаммом Flavobacterium aurantiacum, растущие и покоящиеся клетки которого большую часть использованного токсина поглощают в течение 88—112 ч инкубации (табл. 15). Высокие концентрации токсина ингибировали рост и вызывали образование нетипичных форм клеток (рис. 28). Поглощение афлатоксина снижалось при повышении его концентрации в инкубационной среде. Автоклавированные клетки F. aurantiacum также обладали способностью поглощать афлатоксин В1 из раствора (рис. 29).
Таблица 16
Поглощение афлатоксина из водного раствора живыми и автоклавированными клетками Flavobacterium aurantiacum


Время инкубации, ч

Количество клеток, Х10-12

Поглощение афлатоксина клетками, %

живыми

автоклави-
рованными

5

0,5

49

38

5

1,4

61

51

5

3,0

71

72

5

4,2

73

72

60

4,2

85

73

240

4,2

100

73

Живые клетки F. aurantiacum поглощали афлатоксин, добавленный к растворам молока, арахисового масла, а также из арахиса, кукурузы, сои, искусственно зараженных токсинобразующим штаммом A. flavus. Растворы, содержащие токсин после инкубации с клетками F. aurantiacum, были не токсичны для утят.
Клетки F. aurantiacum, росшие при концентрации афлатоксина до 50 мкг/мл и выше, давали измененные формы — увеличение размеров, утолщение концов, часто ветвление. Аналогичные изменения морфологии клеток были отмечены при росте на среде с пенициллином. При 10 и 15 мкг/мл афлатоксина В1 наблюдается ингибиция биосинтеза ДНК на 73 и 96% после 28 ч, при этом токсин полностью поглощается растущими клетками F. aurantiacum. При четырехминутной обработке клеток ультразвуком после воздействия афлатоксина в концентрации 2,5 и 5 мкг/мл отмечено соответственно 25 и 35%разорванных клеток против 15% в контроле. Следовательно, клетки с токсином проявляют большую чувствительность к обработке. Уродливых форм не обнаружено при концентрации 2,5 мкг/мл, обнаружено мало — при 5 мкг/мл. Афлатоксин B1 поглощался клеточными оболочками бактерий так же, как и автоклавированными клетками. Исходя из этого авторы считают, что токсин влияет на образование клеточной оболочки.
Живые и автоклавированные клетки поглощали определенное количество афлатоксина B1 независимо от продолжительности инкубационного периода, но характер поглощения совершенно различен. В первом случае поглощенный афлатоксин связывался клетками и не переходил в раствор при соответствующей обработке, во втором — легко переходил в раствор при промывании клеток водой (табл. 16).
По данным Араи и др. (Arai, Tatsuya, Koyama, 1967), многие грамположительные и грамотрицательные бактерии устойчивы к афлатоксину в концентрации 100 мкг/мл, но рост исследованных авторами штаммов Streptomyces и Nocardia тормозился при концентрации 25—50 мкг/мл.
Наибольшую чувствительность проявлял S. olivoreticuli; его рост задерживался в концентрации 10 мкг/мл. Сравнительное
определение неочищенного афлатоксина при хроматографии на тонком слое силикагеля и при биоавтографическом проявлении показало, что антимикробная активность относится к афлатоксину B1.
Изменение спектра поглощения афлатоксина
Рис. 30. Изменение спектра поглощения афлатоксина B1 Nocardia asteroides 8 (pH 7,0).
При инкубации с токсином взвеси клеток штаммов N. asteroides 2, 5. virginica 1026, N. asteroides 3, Е. coli, S. aureofaciens 1042, N. rangonensis 23, N. asteroides 8, устойчивых и чувствительных к афлатоксину, только во взвеси клеток N. asteroides 8 уже через час не обнаруживались следы афлатоксина, в то время как с клетками остальных штаммов афлатоксин обнаруживался почти без изменения в течение 38ч. После 6 ч инкубации смеси афлатоксина В1 и клеток N. asteroides 8 при pH 7 токсин хроматографически не выявлялся, но отмечалось изменение спектра поглощения в ультрафиолетовых лучах (снижение — при 362 ммк, появление и повышение— при 265 ммк) (рис. 30).
Теюниссон и Робертсон (Теиnisson, Robertson, 1967) установили, что афлатоксин Вх разрушается растущими и отделенными от среды клетками Tetrahynema pyriformis (табл. 17). Растущие клетки в зависимости от продолжительности инкубации разрушали 58— 67% внесенного токсина соответственно через 24 и 48 ч и не инактивировали афлатоксин G1. Разложение афлатоксина В1 отделенными от среды клетками Т. pyriformis на 50% наступало через 10 ч инкубации, на 75% —после 30 ч. При хроматографии экстрактов на тонком слое силикагеля обнаружено новое пятно, отличное от пятна, соответствующего афлатоксину В1, с Rf 0,5 (Rf афлатоксина В1 0,59 и В2 0,55) и другим спектром поглощения в ультрафиолетовых лучах. Афлатоксин В1 даже в высокой концентрации не вызывал потери жизнеспособности клеток Т. pyriformis.
В опытах in vitro показано влияние афлатоксина на вязкость гистонов и ДНК (Black, Giergensons, 1967). Гистоны — сравнительно низкого молекулярного веса, белки, состоящие главным образом из основных аминокислот, во многих исследованиях используются для изучения некоторых механизмов биологических процессов. Установлено, что они преобладают в белках ядер, связаны с ДНК и поэтому, очевидно, участвуют в процессах синтеза нуклеиновых кислот, белков ядер и цитоплазмы (Никитин, Клименко, 1967). В этом отношении изучение взаимодействия афлатоксина как карциногенного вещества с гистонами и ДНК представляет значительный интерес. Исследовались две фракции гистонов, имеющих молекулярный вес 14 000 и 21 000, которые отличались по аминокислотному составу и другим свойствам, и высокополимеризованная ДНК, полученные из тимуса теленка.
Таблица 17
Разрушение афлатоксинов B1 и G1 Tetrahynema pyriformis
Разрушение афлатоксинов
Афлатоксин вызывал изменение вязкости гистонов  (в различной степени каждого) и ДНК, а также в определенных молярных отношениях связывался ими. Связывание афлатоксинов определялось прямым путем при уравновешенном диализе соответствующих концентраций растворов. Показано, что афлатоксин значительно повышает вязкость гистонов с молекулярным весом 14 000, вторичная структура которых изменяется незначительно и почти не влияет на вязкость гистонов с молекулярным весом 21  000 (рис. 31). Также различен уровень связывания токсина этими двумя фракциями гистонов: около 35 моль токсина связывалось фракцией с молекулярным весом 14  000 и около 65 моль — фракцией с молекулярным весом 21  000. Афлатоксин вызывал увеличение вязкости ДНК и связывался ею: около 1800 молекул токсина связывалось одной молекулой ДНК, или одна молекула приходилась на каждые пять нуклеотидов. Поданным авторов, токсин проявляет в 8—9 раз большее сродство к денатурированной, чем к нативной ДНК. Считают, что данные о влиянии афлатоксина на изменение первичной структуры гистонов и ДНК и уровне его связывания в зависимости от строения и степени денатурации последних могут быть использованы для изучения ряда биологических процессов в опытах in vitro и живой клетке (Black, Girgensons, 1967).
Вильсоны (С. Wilson, В. Wilson, 1964) при изучении штаммов А. flavus, изолированных из зерна хлебных злаков и кормов, которые непосредственно вызывают заболевания свиней и коров, характеризующиеся симптомами гепатитов, получили культуру гриба, образующего при росте на кукурузной крупекоевую кислоту и новый нейротоксин.

Рис. 31. Влияние афлатоксина В1 на вязкость гистонов с молекулярным в сом 14 000 (а), 21000 (б) и ДНК тимуса теленка (в). Связывание афлатоксина гистонами (г) с молекулярным весом 14000 (1) и 21000 (2) и ДНК(д).
К — контроль, О — опыт.
Оба вещества обнаружены в метанольных и хлороформных  экстрактах из зараженной грибом кукурузы. Вещество, названное авторами «треморгеном», вызывало у мышей дрожание, судороги, конвульсии. Животные заболевали через 10—30 мин после введения 0,5—1 мг частично очищенного вещества. Треморген образуется также при росте штамма А. flavus на зерне овса, проса, риса, кукурузы и на картофеле через 2—3 недели и в незначительном количестве — на фисташковой муке. При этом, как отмечают авторы, наибольшее количество токсина находится в склероциях гриба, которые обильно образуются в культуре. Хлороформные экстракты конидий гриба содержат незначительную концентрацию токсина. Rf треморгена соответствует 0,7—0,8; на хроматограмме он проявляется через 48— 72 ч видимым желтовато-коричневым пятном.
Коевая кислота обладает многими свойствами у-пирона: может образовывать стабильные водонерастворимые хелаты с металлами; входит в состав многих сложных соединений как производное их боковой цепи или ядра (В. Wilson, 1966).



 
« Токсикология полимерных материалов   Трудности диагностики заболеваний сердечно-сосудистой системы »